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Resumen

La cortina de ADN, una técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento, proporciona una plataforma para la visualización en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. El presente protocolo utiliza la técnica de cortina de ADN para investigar el papel biológico y el mecanismo molecular de Abo1, una ATPasa AAA+ que contiene bromodominio de Schizosaccharomyces pombe .

Resumen

La cromatina es una estructura de orden superior que empaqueta el ADN eucariota. La cromatina sufre alteraciones dinámicas según la fase del ciclo celular y en respuesta a estímulos ambientales. Estos cambios son esenciales para la integridad genómica, la regulación epigenética y las reacciones metabólicas del ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación. El ensamblaje de la cromatina es crucial para la dinámica de la cromatina y es catalizado por las chaperonas de histonas. A pesar de los extensos estudios, los mecanismos por los cuales las chaperonas de histonas permiten el ensamblaje de la cromatina siguen siendo esquivos. Además, las características globales de los nucleosomas organizados por las chaperonas de histonas son poco conocidas. Para abordar estos problemas, este trabajo describe una técnica única de imagen de una sola molécula llamada cortina de ADN, que facilita la investigación de los detalles moleculares del ensamblaje de nucleosomas por parte de las chaperonas de histonas. La cortina de ADN es una técnica híbrida que combina la fluidez lipídica, la microfluídica y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) para proporcionar una plataforma universal para la obtención de imágenes en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. Utilizando la cortina de ADN, se investiga la función de la chaperona de histonas de Abo1, la ATPasa AAA+ que contiene bromodominios de Schizosaccharomyces pombe , y se revela el mecanismo molecular subyacente al ensamblaje de histonas de Abo1. La cortina de ADN proporciona un enfoque único para estudiar la dinámica de la cromatina.

Introducción

El ADN eucariota está empaquetado en una estructura de orden superior conocida como cromatina 1,2. El nucleosoma es la unidad fundamental de la cromatina, que consiste en aproximadamente 147 pb de ADN envuelto alrededor de las histonas del núcleo octamérico 3,4. La cromatina desempeña un papel fundamental en las células eucariotas; por ejemplo, la estructura compacta protege el ADN de factores endógenos y amenazas exógenas5. La estructura de la cromatina cambia dinámicamente de acuerdo con la fase del ciclo celular y los estímulos ambientales, y estos cambios controlan el acceso a las proteínas durante las transacciones del ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación6. La dinámica de la cromatina también es importante para la estabilidad genómica y la información epigenética.

La cromatina está regulada dinámicamente por varios factores, incluidas las modificaciones de la cola de las histonas y los organizadores de la cromatina, como los remodeladores de la cromatina, las proteínas del grupo polycomb y las chaperonas de histonas7. Las chaperonas de histonas coordinan el ensamblaje y desensamblaje de nucleosomas a través de la deposición o desprendimiento de histonas centrales 8,9. Los defectos en las chaperonas de histonas inducen inestabilidad genómica y causan trastornos del desarrollo y cáncer 9,10. Varias chaperonas de histonas no necesitan consumo de energía química como la hidrólisis de ATP para ensamblar o desensamblar nucleosomas 9,11,12,13. Recientemente, los investigadores informaron que las ATPasas AAA+ (ATPasa asociadas con diversas actividades celulares) que contienen bromodominios desempeñan un papel en la dinámica de la cromatina como chaperonas de histonas 14,15,16,17. La ATAD2 humana (proteína 2 que contiene el dominio AAA de la familia ATPasa) promueve la accesibilidad de la cromatina para mejorar la expresión génica18. Como co-regulador transcripcional, ATAD2 regula la cromatina de los factores transcripcionales oncogénicos14, y la sobreexpresión de ATAD2 se relaciona con un mal pronóstico en muchos tipos de cáncer19. Yta7, el homólogo de ATAD2 por Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), disminuye la densidad de nucleosomas en la cromatina15. Por el contrario, Abo1, el homólogo de ATAD2 de Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), aumenta la densidad de nucleosomas16. Utilizando una técnica única de imagen de una sola molécula, la cortina de ADN, se aborda si Abo1 contribuye al ensamblaje o desensamblaje de nucleosomas17,20.

Tradicionalmente, las propiedades bioquímicas de las biomoléculas han sido examinadas mediante experimentos masivos como el ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) o la coinmunoprecipitación (co-IP), en los que se sondean un gran número de moléculas y se caracterizan sus propiedades medias21,22. En los experimentos a granel, los subestados moleculares están velados por el efecto conjunto-promedio, y el sondeo de las interacciones biomoleculares está restringido. Por el contrario, las técnicas de una sola molécula eluden las limitaciones de los experimentos masivos y permiten la caracterización detallada de las interacciones biomoleculares. En particular, las técnicas de imagen de molécula única se han utilizado ampliamente para estudiar las interacciones ADN-proteína y proteína-proteína23. Una de estas técnicas es la cortina de ADN, una técnica única de imagen de molécula única basada en la microfluídica y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM)24,25. En una cortina de ADN, cientos de moléculas individuales de ADN están ancladas a la bicapa lipídica, lo que permite el movimiento bidimensional de las moléculas de ADN debido a la fluidez lipídica. Cuando se aplica el flujo hidrodinámico, las moléculas de ADN se mueven a lo largo del flujo en la bicapa y se atascan en una barrera de difusión, donde se alinean y se estiran. Mientras el ADN se tiñe con agentes intercalantes, se inyectan proteínas marcadas con fluorescencia y se utiliza TIRFM para visualizar las interacciones proteína-ADN en tiempo real a nivel de una sola molécula23. La plataforma de cortina de ADN facilita la observación de los movimientos de las proteínas, como la difusión, la translocación y la colisión 26,27,28. Además, la cortina de ADN se puede utilizar para el mapeo de proteínas en el ADN con posiciones, orientaciones y topologías definidas o se puede aplicar al estudio de la separación de fases de proteínas y ácidos nucleicos 29,30,31.

En este trabajo, se utiliza la técnica de cortina de ADN para proporcionar evidencia de la función de las chaperonas a través de la visualización directa de proteínas específicas. Además, debido a que DNA Curtain es una plataforma de alto rendimiento, facilita un grado de recopilación de datos suficiente para la confiabilidad estadística. Aquí, se describe cómo realizar el ensayo de cortina de ADN en detalle para investigar el papel molecular de la ATPasa AAA+ que contiene bromodominios de S. pombe Abo1.

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Protocolo

1. Preparación de la celda de flujo

  1. Prepare un portaobjetos de sílice fundida limpio que contenga patrones de nanozanjas siguiendo el informe publicado anteriormente25.
    1. Taladre dos orificios de 1 mm de diámetro en un portaobjetos de sílice fundida limpio (Figura 1A) con una broca recubierta de diamante (consulte la Tabla de materiales).
    2. Deposite 250 nm de aluminio grueso (Al) en el portaobjetos utilizando pulverización catódicade CC 32 (ver Tabla de Materiales) con 10 mTorr de gas argón.
    3. Aplicar una capa de 310 nm de espesor de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) al 4% de 950K (ver Tabla de Materiales) a 4.000 rpm durante 1 min y hornear en una placa caliente a 180 °C durante 3 min.
    4. Dibuje los patrones de nanozanja en la capa de PMMA entre los dos orificios utilizando litografía de haz de electrones (ebeam)33 con una corriente de 0,724 nA a 80 kV.
      NOTA: La arquitectura y las dimensiones de los patrones de nanozanjas se muestran en la Figura 1A.
    5. Retire el PMMA expuesto al haz de agua sumergiendo los portaobjetos en la solución de revelado (proporción 1:3 de metil isobutil cetona e isopropanol, consulte la Tabla de materiales) durante 2 min.
    6. Grabe capas de Al con grabado iónico reactivo por plasma acoplado inductivamente (ICP-RIE) utilizando gases cloro (Cl2) y tricloruro de boro (BCl3).
      NOTA: Estos dos gases pueden eliminar el Al de las áreas expuestas al haz de e.
    7. Talle nanozanjas en los portaobjetos utilizando gases tetrafluoruro de azufre (SF4), tetrafluorometano (CF4) y oxígeno (O2) (ver Tabla de Materiales).
    8. Retire la capa de Al restante sumergiendo los portaobjetos en un grabador de Al (revelador AZ 300 MIF, consulte la Tabla de materiales) durante 10 min.
    9. Después de la fabricación, enjuague los portaobjetos con agua desionizada y sonique en acetona durante 30 minutos con un sonicador tipo baño.
    10. Limpie los portaobjetos en una solución Hellmanex III al 2% (consulte la tabla de materiales) durante al menos 1 día con agitación magnética.
    11. Sonicar los portaobjetos en acetona durante 30 min y 1 M de NaOH durante 30 min sucesivamente.
    12. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada y séquelos con un gas nitrógeno (N2).
  2. Coloque un papel limpio (5 mm x 35 mm) en el centro de la cinta adhesiva de doble cara. Pega la cinta adhesiva sobre el portaobjetos para cubrir los dos agujeros y los nanopatrones con el papel.
  3. Elimine el papel con una cuchilla limpia (Figura 1A).
  4. Coloque un cubreobjetos de vidrio encima de la cinta adhesiva de doble cara y frote el cubreobjetos con la punta de una pipeta para formar una cámara microfluídica (Figura 1A).
  5. Coloque la celda de flujo ensamblada entre dos portaobjetos de microscopio y sujételos.
  6. Hornee la celda de flujo en un horno al vacío a 120 °C durante 45 min.
  7. Conecte el conector de fluido (Nanoport) para los análisis basados en chips (consulte la Tabla de materiales) a cada orificio abierto con una pistola de pegamento caliente y conecte las dos líneas de tubería de bloqueo Luer.
  8. Conecte una jeringa Luer lock que contenga 3 ml de agua desionizada y lave la cámara.
  9. Lave la cámara con 3 ml de tampón lipídico (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 y 100 mM de NaCl) a través de la conexión gota a gota .
    NOTA: La conexión gota a gota conecta todas las jeringas a la celda de flujo para evitar inyectar burbujas de aire en la cámara.
  10. Inyecte 1 ml de lípido biotinilado 0,04x en tampón lipídico en la cámara en dos tomas con 5 minutos de incubación por toma.
    NOTA: La preparación de 1x caldo lipídico biotinilado se describe en un informe publicado anteriormente34.
  11. Lavar la cámara con 3 ml de tampón lipídico e incubar durante 20 min para que la bicapa lipídica madure en la superficie del portaobjetos.
  12. Agregue 1 mL de tampón BSA (40 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2 y 0.2 mg/mL de BSA) e incube durante 5 min para pasivar la superficie del portaobjetos.
    NOTA: Este paso puede reducir la unión inespecífica de proteínas a la superficie del portaobjetos.
  13. Inyecte 0,025 mg/ml de estreptavidina en 1 ml de tampón BSA con dos inyecciones y 10 minutos de incubación por inyección.
  14. Lave la estreptavidina residual con 3 ml de tampón BSA.
  15. Inyecte ~300 pM (30 μL) de ADN de fagos lambda biotinilados en 1 mL de tampón BSA en la cámara con dos disparos y 10 minutos de incubación por disparo.
    NOTA: La preparación de ADN lambda biotinilado se describe en un informe publicado anteriormente34.

2. Conectar la celda de flujo al sistema microfluídico y cargarla en el microscopio

  1. Prepare el tampón de imagen Abo1 (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1 mM de ATP, 2 mM de MgCl2, 1.6% de glucosa y 0.1x de gloxy, ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Gloxy es un sistema de eliminación de oxígeno que reduce el fotoblanqueo de los tintes fluorescentes. La preparación de 100x gloxi stock con glucosa oxidasa y catalasa se describe en la Referencia35.
  2. Conecte una jeringa que contenga 10 ml de tampón de diagnóstico por imágenes a una bomba de jeringa y elimine las burbujas en todas las líneas de tubería del sistema microfluídico.
  3. Acople la celda de flujo preparada con el sistema microfluídico a través de una conexión gota a gota para evitar la inyección de burbujas en la celda de flujo (Figura 1B).
  4. Ensamble la celda de flujo y los soportes de la celda de flujo y monte el ensamblaje en un microscopio TIRF hecho a medida (Figura 1C).
    PRECAUCIÓN: Cuando la celda de flujo se coloca bajo el microscopio, ajuste cuidadosamente la altura de la lente del objetivo. La celda de flujo no debe tocar la lente del objetivo. Esto puede dañar la lente.
  5. Deje caer el aceite correspondiente al índice en el centro de la celda de flujo y coloque un prisma de paloma hecho a medida (consulte la Tabla de materiales) en la gota de aceite.

3. Ensamblaje de histonas por Abo1 usando cortina de ADN

  1. Mezclar 5 nM de Abo1 y 12,5 nM de dímero de histonas H3-H4 marcado con Cy5 (Cy5-H3-H4) (ver Tabla de Materiales) en 150 μL de tampón de imagen. Todas las proteínas se prepararon siguiendo el informe previamente publicado17.
  2. Incuba la mezcla en hielo durante 15 min.
    NOTA: Para evitar el fotoblanqueo de Cy5, la incubación debe realizarse en la oscuridad.
  3. Inyecte ~20 pM (2 μL) de colorante YOYO-1 en tampón de imagen a través de un bucle de muestra de 100 μL para teñir las moléculas de ADN lambda.
  4. Ejecute un software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) y encienda el láser de 488 nm para verificar si las cortinas de ADN están bien formadas.
    NOTA: Si las cortinas de ADN están bien formadas, las moléculas de ADN, que se tiñen con YOYO-1, se muestran como líneas alineadas en una barrera en presencia de flujo. Las líneas estiradas retroceden y se difunden lejos de la barrera cuando se cierra el flujo.
  5. Inyecte 2 mL de tampón con alto contenido de sal (200 mM de NaCl y 40 mM de MgCl2) para eliminar el colorante YOYO-1 del ADN.
  6. Después de eliminar el colorante YOYO-1, inyecte la muestra de proteína preincubada.
  7. Cuando las proteínas lleguen a la cortina de ADN, apague la bomba de jeringa, cierre la válvula de cierre e incube 15 minutos para la carga de histonas por Abo1.
  8. Lave las proteínas Abo1 e histonas no unidas durante 5 min.
  9. Abra la válvula de cierre y reanude la inyección de flujo.
  10. Encienda el láser de 637 nm y obtenga imágenes de las proteínas fluorescentes mientras el flujo del tampón está activado.
  11. Apague transitoriamente el flujo tampón para verificar si las proteínas histonas están cargadas en el ADN (Figura 2C).
  12. Recolectar imágenes de cortinas de ADN con un programa de adquisición de imágenes (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Cuando el flujo de tampón se detiene transitoriamente, el ADN retrocede fuera del campo evanescente de reflexión interna total, y las proteínas marcadas con fluorescencia unidas al ADN desaparecen.

4. Análisis de datos

  1. Transforme las imágenes tomadas por el programa de adquisición de imágenes en formato TIFF como secuencias de imágenes.
    NOTA: Todos los datos se analizaron utilizando la Imagen J (NIH) como se describe en la Referencia20.
  2. Elige una sola molécula de ADN de las secuencias de imágenes y dibuja un quimógrafo.
    NOTA: El quimógrafo puede mostrar el cambio en la intensidad de fluorescencia de cada proteína histona unida a una sola molécula de ADN en función del tiempo.
  3. Cree el perfil de intensidad de fluorescencia a partir del cimógrafo y ajústelo con múltiples funciones gaussianas.
  4. Recopile las coordenadas centrales de los picos del perfil de intensidad de fluorescencia. En este paso, se puede obtener la intensidad mínima de fluorescencia de histonas.
  5. Divida todas las intensidades máximas recogidas de los perfiles por la intensidad mínima. En este paso se estima el número de dímeros H3-H4 unidos al ADN.
  6. Realice los pasos 4.2-4.5 para otras moléculas de ADN.
  7. Cree un histograma para la distribución de enlace de dímeros H3-H4 con un tamaño de intervalo de 1 kbp. El número de moléculas analizadas es de al menos 300.

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Resultados

Este trabajo describe el procedimiento para la preparación de la celda de flujo para el ensayo de cortina de ADN (Figura 1A). El ensayo de cortina de ADN facilitó el estudio del ensamblaje del dímero de la histona H3-H4 en el ADN por Abo1. En primer lugar, se comprobó la formación de la cortina de ADN tiñendo las moléculas de ADN con YOYO-1, un colorante intercalante. Se mostraron líneas verdes en matrices paralelas, lo que indica que YOYO-1 se intercaló en moléculas de ADN, que es...

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Discusión

Como técnica de imagen de una sola molécula, la cortina de ADN se ha utilizado ampliamente para sondear las reacciones metabólicas del ADN43. La cortina de ADN es un sistema híbrido que concatena la fluidez lipídica, la microfluídica y el TIRFM. A diferencia de otras técnicas de una sola molécula, la cortina de ADN permite la visualización en tiempo real de alto rendimiento de las interacciones proteína-ADN. Por lo tanto, la técnica de cortina de ADN es adecuada para sondear el mecanism...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen el amable apoyo a Abo1 y Cy5-H3-H4 por parte del profesor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., y Juwon Jang, Ph.D., en KAIST, Corea del Sur. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Beca de la Fundación Nacional de Investigación (NRF-2020R1A2B5B01001792), el fondo de investigación intramuros (1.210115.01) del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Ulsan y el Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R022-D1).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL luer-lock syringeBecktonDickinson301321
1' x 3' fused-silca slide glassG. Finkenbeiner1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PEAvanti870273This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PEAvanti880130This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302832
6-way sample injection valveIDEXMX series II
950K PMMAAll-resist671.04
AcetoneSAMCHUNA1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA2383
Aluminum (Al)TASCO, South KoreaLT50AI414Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
AmpicillinMbcellMB-A4128Antibiotics
AZ 300 MIF developerMerck10454110521Used for removing aluminum
BladeDORCODN5212 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3)UNIONGASPurity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
CatalaseSigmaC40-1gThis is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2)UNIONGASPurity: >99.99%
Clear double-sided tape3M313770
D-(+)-glucoseSigmaG7528
DC sputterSoronaSRM-120Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bitEurotoolDIB-211.00Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co. Ltd.1906-106Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
DrillDremelDremel 3000Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean LithographyNanobeam Ltd.NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)SigmaEDS-1KG
Fingertight fittingsIDEXF-300It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nutIDEXP-235It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOLLabogeneHC3110Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidaseSigmaG2133-50KUThis is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochlorideAcros Organics364790025
Hamilton syringeHamilton Company80065This syringe is used for sample injection
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrerCorningPC-420D
Hydrochloric acidSigmaH1759Used for Tris-HCl
Index matching oilZEISS444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etchingTop Technology Ltd.FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Glentham Life SciencesGC6586-100gUsed for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNANEBN0311
LB brothBD difco244610Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32IDEXP-659This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydratefisher bioreagentsBP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK)KAYAKU ADVANCED MATERIALSUsed for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslipMARIENFELD10114222 x 50 mm (No. 1)
Microscope slideDURAN GROUPDU.2355013Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
NanoportIDEXN-333-01
Objective lensNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WIImmersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC6060-03Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
PFA tubing naturalIDEX1512LIt is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche11359061001Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High ResolutionCytiva17-0584-01Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valveIDEXP-732
Sodium acetateSigma791741
Sodium chloride (NaCl)SigmaS3014
Sodium hydroxide (NaOH)Sigmas5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDaSpectrum laboratories132660
StreptavidinThermo Fisher ScientificS888
Sulfur tetralfluoride (SF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
Syringe pumpKD Scientific78-8210
Tetrafluoromethane (CF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
TritonX-100SigmaT9284
Trizma baseSigmaT1503Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715Used for FPLC (ion exchange)
Union assemblyIDEXP-760This connects tubings
UreaSigmaU5378
Vacuum ovenJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME)SigmaM6250

Referencias

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