פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

Summary

מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.

Abstract

כרומטין הוא מבנה מסדר גבוה יותר שאורז דנ"א אאוקריוטי. הכרומטין עובר שינויים דינמיים בהתאם לשלב מחזור התא ובתגובה לגירויים סביבתיים. שינויים אלה חיוניים לשלמות הגנומית, לוויסות אפיגנטי ולתגובות מטבוליות של DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון. הרכבת הכרומטין חיונית לדינמיקה של הכרומטין והיא מזורזת על ידי מלווים של היסטון. למרות מחקרים מקיפים, המנגנונים שבאמצעותם מלווים בהיסטון מאפשרים הרכבת כרומטין נותרו חמקמקים. יתר על כן, התכונות הגלובליות של נוקלאוזומים המאורגנים על ידי מלווים היסטון אינן מובנות היטב. כדי להתמודד עם בעיות אלה, עבודה זו מתארת טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה בודדת בשם מסך DNA, המאפשרת לחקור את הפרטים המולקולריים של הרכבת נוקלאוזומים על ידי מלווים היסטון. מסך DNA היא טכניקה היברידית המשלבת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) כדי לספק פלטפורמה אוניברסלית להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. באמצעות וילון DNA נחקרת פונקציית מלווה ההיסטון של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase, ומתגלה המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הרכבת ההיסטון של Abo1. וילון DNA מספק גישה ייחודית לחקר דינמיקת הכרומטין.

Introduction

דנ"א אאוקריוטי ארוז במבנה מסדר גבוה יותר המכונה כרומטין ^1,2. נוקלאוזומים הם היחידה הבסיסית של כרומטין, המורכבת מכ-147 bp DNA העוטפים את אבני הליבה האוקטמריות ^3,4. כרומטין ממלא תפקיד קריטי בתאים אאוקריוטים; לדוגמה, המבנה הקומפקטי מגן על הדנ"א מפני גורמים אנדוגניים ואיומים אקסוגניים⁵. מבנה הכרומטין משתנה באופן דינמי בהתאם לשלב מחזור התא ולגירויים סביבתיים, ושינויים אלה שולטים בגישה לחלבונים במהלך עסקאות DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון⁶. דינמיקה של כרומטין חשובה גם ליציבות גנומית ולמידע אפיגנטי.

הכרומטין מווסת באופן דינמי על ידי גורמים שונים, כולל שינויים בזנב היסטון ומארגני כרומטין כגון משפצי כרומטין, חלבונים מקבוצת פוליקומב ומלווי היסטון⁷. מלווים היסטון מתאמים את ההרכבה והפירוק של נוקלאוזומים באמצעות שיקוע או ניתוק של אבני ליבה ^8,9. פגמים במלווים היסטון גורמים לאי יציבות גנומית וגורמים להפרעות התפתחותיות וסרטן ^9,10. מלווי היסטון שונים אינם זקוקים לצריכת אנרגיה כימית כמו הידרוליזה ATP כדי להרכיב או לפרק נוקלאוזומים 9,11,12,13. לאחרונה, חוקרים דיווחו כי ATPases המכיל ברומודומיין AAA+ (ATPase הקשור לפעילויות תאיות מגוונות) ממלאים תפקיד בדינמיקה של כרומטין כמו מלווים היסטון 14,15,16,17. ATAD2 אנושי (חלבון המכיל תחום AAA ממשפחת ATPase 2) מקדם את נגישות הכרומטין כדי לשפר את ביטוי הגנים¹⁸. כמווסת שעתוק משותף, ATAD2 מווסת את הכרומטין של גורמי שעתוק אונקוגניים¹⁴, וביטוי היתר של ATAD2 קשור לפרוגנוזה גרועה בסוגים רבים של סרטן¹⁹. Yta7, ההומולוג Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) של ATAD2, מפחית את צפיפות הנוקלאוזומים בכרומטין¹⁵. לעומת זאת, Abo1, ההומולוג Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) של ATAD2, מגביר את צפיפות הנוקלאוזומים¹⁶. באמצעות טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה בודדת, וילון DNA, השאלה אם Abo1 תורם להרכבת נוקלאוזומים או פירוקו מטופלת^17,20.

באופן מסורתי, התכונות הביוכימיות של ביומולקולות נבדקו על ידי ניסויים בתפזורת כגון בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA) או קו-אימונומשקעים (co-IP), שבהם נבדקים מספר רב של מולקולות, ותכונותיהן הממוצעות מאופיינות^21,22. בניסויים בתפזורת, תת-מצבים מולקולריים מוסווים על ידי אפקט ממוצע האנסמבל, וחקירת אינטראקציות ביומולקולריות מוגבלת. לעומת זאת, טכניקות של מולקולות בודדות עוקפות את המגבלות של ניסויים בתפזורת ומאפשרות אפיון מפורט של אינטראקציות ביומולקולריות. בפרט, נעשה שימוש נרחב בטכניקות הדמיה של מולקולות בודדות כדי לחקור אינטראקציות DNA-חלבון וחלבון-חלבון²³. טכניקה אחת כזו היא מסך DNA, טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה אחת המבוססת על מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM)^24,25. במסך דנ"א, מאות מולקולות דנ"א בודדות מעוגנות לדו-שכבה השומנית, המאפשרת תנועה דו-ממדית של מולקולות דנ"א עקב נזילות השומנים. כאשר זרימה הידרודינמית מופעלת, מולקולות דנ"א נעות לאורך הזרימה על הדו-שכבה ונתקעות במחסום דיפוזיה, שם הן מיושרות ונמתחות. בעוד שהדנ"א מוכתם בחומרים משתלבים, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי מוזרקים, ו-TIRFM משמש לדמיין אינטראקציות חלבון-דנ"א בזמן אמת ברמת מולקולה בודדת²³. פלטפורמת מסך הדנ"א מאפשרת תצפית על תנועות חלבונים כגון דיפוזיה, טרנסלוקציה והתנגשות 26,27,28. יתר על כן, וילון DNA יכול לשמש למיפוי חלבונים על דנ"א עם מיקומים, כיוונים וטופולוגיות מוגדרות או מיושם לחקר הפרדת פאזה של חלבונים וחומצות גרעין 29,30,31.

בעבודה זו, טכניקת מסך הדנ"א משמשת כדי לספק ראיות לתפקודם של מלווים באמצעות הדמיה ישירה של חלבונים ספציפיים. יתר על כן, מכיוון שמסך DNA הוא פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה, הוא מאפשר איסוף נתונים בהיקף מספיק לאמינות סטטיסטית. כאן, הוא מתואר כיצד לבצע את בדיקת מסך ה- DNA בפירוט כדי לחקור את התפקיד המולקולרי של S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1.

Protocol

1. הכנת תא הזרימה

1. הכינו שקופית סיליקה מאוחה מנוקה המכילה תבניות ננו-תעלות בהתאם לדוח²⁵ שפורסם בעבר.
   1. קדחו שני חורים בקוטר 1 מ"מ במגלשת סיליקה מאוחה נקייה (איור 1A) באמצעות מקדח מצופה יהלום (ראו טבלת חומרים).
   2. הפקד 250 ננומטר של אלומיניום עבה (Al) על המגלשה באמצעות מרזב DC³² (ראה טבלת חומרים) עם 10 mTorr של גז ארגון.
   3. יש לצפות שכבה בעובי 310 ננומטר של 4% פולי(מתיל מתקרילט) (PMMA) (ראו טבלת חומרים) ב-4,000 סל"ד למשך דקה אחת ולאפות על פלטה חמה בטמפרטורה של 180°C במשך 3 דקות.
   4. צייר את תבניות ננו-תעלה על שכבת PMMA בין שני החורים באמצעות ליתוגרפיית קרן אלקטרונים (אלומה)³³ עם זרם 0.724 nA ב- 80 kV.
      הערה: הארכיטקטורה והממדים של תבניות ננו-תעלות מוצגים באיור 1A.
   5. הסר את PMMA החשוף לאלומה על ידי השריית השקופיות בתמיסה המתפתחת (יחס של 1:3 של מתיל איזובוטיל קטון ואיזופרופנול, ראה טבלת חומרים) למשך 2 דקות.
   6. תחריט שכבות Al עם תחריט יונים תגובתי פלזמה מצומד אינדוקטיבי (ICP-RIE) באמצעות כלור (Cl₂) וגזי בורון טריכלוריד (_{BCl 3}).
      הערה: שני גזים אלה יכולים להסיר את ה-Al מאזורים החשופים לאלומות.
   7. חצבו ננו-תעלות במגלשות באמצעות גזי גופרית טטרה-פלואוריד (SF₄), טטרה-פלואורומתאן (CF₄) וגזי חמצן (O₂) (ראו טבלת חומרים).
   8. הסר את שכבת Al הנותרת על ידי השריית השקופיות ב- Al etchant (מפתח AZ 300 GIF, ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות.
   9. לאחר הייצור, שטפו את המגלשות במים נטולי יונים, ובצעו סוניקציה באצטון למשך 30 דקות באמצעות סוניק מסוג אמבטיה.
   10. נקו את המגלשות בתמיסת Hellmanex III 2% (ראו טבלת חומרים) למשך יום אחד לפחות עם ערבוב מגנטי.
   11. החליקו את המגלשות באצטון במשך 30 דקות וב-1 M NaOH במשך 30 דקות ברציפות.
   12. יש לשטוף את המגלשות במים שעברו דה-יוניזציה ולייבש בגז חנקן (N₂).
2. שים נייר נקי (5 מ"מ x 35 מ"מ) על מרכז סרט דו-צדדי. חבר את סרט הדבק מעל השקופית כדי לכסות את שני החורים ואת תבניות הננו עם הנייר.
3. הבלו על הנייר באמצעות להב נקי (איור 1A).
4. הניחו כיסוי זכוכית על גבי סרט הדבקה דו-צדדי ושפשפו את הכיסוי באמצעות קצה פיפטה כדי ליצור תא מיקרופלואידי (איור 1A).
5. מקם את תא הזרימה המורכב בין שתי שקופיות מיקרוסקופ וגזור אותן.
6. אופים את תא הזרימה בתנור ואקום בטמפרטורה של 120 מעלות למשך 45 דקות.
7. חבר את מחבר הנוזל (Nanoport) עבור ניתוחים מבוססי שבב (ראה טבלת חומרים) לכל חור פתוח באמצעות אקדח דבק חם וחבר את שני הקווים של צינורות נעילת Luer.
8. חברו מזרק Luer lock המכיל 3 מ"ל מים נטולי יונים, ושטפו את החדר.
9. שטפו את התא עם 3 מ"ל של חיץ שומנים (20 מילימול של Tris-HCl, pH 8.0 ו-100 מילימול של NaCl) באמצעות חיבור טיפה אחר טיפה.
   הערה: חיבור טיפה אחר טיפה מקשר את כל המזרקים לתא הזרימה כדי למנוע הזרקת בועות אוויר לתא.
10. הזריקו 1 מ"ל של 0.04x שומן ביוטינילציה בחיץ שומנים לתוך התא בשתי יריות עם 5 דקות דגירה לכל זריקה.
    הערה: הכנת מלאי שומנים 1x biotinylated מתואר בדוח^{שפורסם בעבר 34}.
11. שטפו את התא עם 3 מ"ל של חיץ שומנים ודגרו במשך 20 דקות כדי ששכבת השומנים תתבגר על משטח המגלשה.
12. הוסף 1 מ"ל של מאגר BSA (40 מ"מ של Tris-HCl, pH 8.0, 50 מילימול של NaCl, 2 מילימול של MgCl₂ ו- 0.2 מ"ג/מ"ל של BSA) ודגור במשך 5 דקות כדי להפוך את משטח המגלשה לפסיבי.
    הערה: שלב זה יכול להפחית את הקישור הלא ספציפי של חלבונים למשטח השקופית.
13. הזריקו 0.025 מ"ג/מ"ל סטרפטאווידין ב-1 מ"ל של חיץ BSA עם שתי יריות ו-10 דקות דגירה לכל זריקה.
14. שטפו את שאריות הסטרפטאווידין עם 3 מ"ל של מאגר BSA.
15. הזריקו ~300 pM (30 μL) של DNA פאג' למבדה ביוטינילציה ב-1 מ"ל של חיץ BSA לתוך התא עם שתי יריות ו-10 דקות דגירה לכל ירייה.
    הערה: הכנת DNA של למבדה ביוטינילציה מתוארת בדו"ח³⁴ שפורסם בעבר.

2. חיבור תא זרימה למערכת המיקרופלואידית והטענתו על המיקרוסקופ

1. הכן מאגר הדמיה Abo1 (50 mM של Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM של NaCl, 1 mM של DTT, 1 mM של ATP, 2 mM של MgCl₂, 1.6% גלוקוז, ו 0.1x של gloxy, ראה טבלה של חומרים).
   הערה: Gloxy היא מערכת לניקוי חמצן המפחיתה את ההלבנה של צבעים פלואורסצנטיים. הכנת מלאי גלוקסי 100x עם גלוקוז אוקסידאז וקטלאז מתוארת בהפניה³⁵.
2. חבר מזרק המכיל 10 מ"ל של חיץ הדמיה למשאבת מזרק והסר בועות בכל קווי הצינור במערכת המיקרופלואידית.
3. חברו את תא הזרימה המוכן למערכת המיקרופלואידית באמצעות חיבור טיפה לטיפה כדי למנוע הזרקת בועות לתוך תא הזרימה (איור 1B).
4. הרכיבו את מחזיקי תאי הזרימה ותאי הזרימה והרכיבו את המכלול על מיקרוסקופ TIRF שנבנה במיוחד (איור 1C).
   זהירות: כאשר מכניסים את תא הזרימה מתחת למיקרוסקופ, קבעו בזהירות את גובה עדשת המטרה. אסור שתא הזרימה ייגע בעדשת המטרה. זה יכול להזיק לעדשה.
5. הורידו שמן תואם אינדקס במרכז תא הזרימה והניחו מנסרת יונה בהתאמה אישית (ראו טבלת חומרים) על טיפת השמן.

3. הרכבת היסטון על ידי Abo1 באמצעות וילון DNA

1. ערבבו 5 ננומטר של Abo1 ו-12.5 ננומטר של דימר היסטון H3-H4 עם תווית Cy5 (Cy5-H3-H4) (ראו טבלת חומרים) ב-150 מיקרוליטר של מאגר הדמיה. כל החלבונים הוכנו בעקבות דו"ח¹⁷ שפורסם בעבר.
2. דוגרים על התערובת על קרח במשך 15 דקות.
   הערה: כדי למנוע הלבנה של Cy5, הדגירה חייבת להיעשות בחושך.
3. הזריקו ~20 pM (2 μL) של צבע YOYO-1 במאגר הדמיה דרך לולאת דגימה של 100 μL כדי להכתים מולקולות DNA של למדא.
4. הפעל תוכנת הדמיה (ראה טבלת חומרים) והפעל את הלייזר של 488 ננומטר כדי לבדוק אם וילונות הדנ"א בנויים היטב.
   הערה: אם וילונות הדנ"א בנויים היטב, מולקולות הדנ"א, המוכתמות ב-YOYO-1, מוצגות כקווים מיושרים במחסום בנוכחות זרימה. הקווים המתוחים נרתעים ומתרחקים מהמכשול כאשר הזרימה כבויה.
5. הזריקו 2 מ"ל של מאגר מלח גבוה (200 מילימול של NaCl ו-40 מילימול של MgCl₂) כדי לסלק את צבע YOYO-1 מהדנ"א.
6. לאחר הסרת צבע YOYO-1, יש להזריק את דגימת החלבון שהודגרה מראש.
7. כאשר החלבונים מגיעים לווילון הדנ"א, כבו את משאבת המזרק, כבו את שסתום הסגירה ודגרו 15 דקות על העמסת היסטון על ידי Abo1.
8. שטפו את חלבוני ה-Abo1 וההיסטון הלא קשורים למשך 5 דקות.
9. הפעל את שסתום הכיבוי וחדש את הזרקת הזרימה.
10. הפעל את הלייזר של 637 ננומטר וצלם את החלבונים הפלואורסצנטיים בזמן שזרימת המאגר מופעלת.
11. כבו באופן זמני את זרימת החיץ כדי לבדוק אם חלבוני היסטון נטענים על דנ"א (איור 2C).
12. אסוף תמונות מסך DNA באמצעות תוכנית לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים).
    הערה: כאשר זרימת החיץ נפסקת באופן זמני, הדנ"א נרתע מהשדה האוונסנטי של השתקפות פנימית כוללת, וחלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי הקשורים לדנ"א נעלמים.

4. ניתוח נתונים

1. המר את התמונות שצולמו על-ידי התוכנית לרכישת תמונות לתבנית TIFF כרצפי תמונות.
   הערה: כל הנתונים נותחו באמצעות תמונה J (NIH) כמתואר בהפניה²⁰.
2. בחרו מולקולת דנ"א בודדת מתוך רצפי התמונות וציירו קימוגרף.
   הערה: הקימוגרף יכול להראות את השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות של כל חלבון היסטון הקשור למולקולת דנ"א יחידה כפונקציה של זמן.
3. צור את פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות מהקימוגרף והתאם אותו למספר פונקציות גאוסיות.
4. אסוף את הקואורדינטות המרכזיות של הפסגות מפרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות. בשלב זה, ניתן להשיג את העוצמה המינימלית של פלואורסצנטיות היסטון.
5. חלק את כל עוצמות השיא שנאספו מהפרופילים בעוצמה מינימלית. מספר הדימרים H3-H4 הקשורים לדנ"א מוערך בשלב זה.
6. בצע שלבים 4.2-4.5 עבור מולקולות דנ"א אחרות.
7. צור היסטוגרמה להתפלגות הקישור של דימרים H3-H4 בגודל סל של 1 kbp. מספר המולקולות שנותחו הוא לפחות 300.

תוצאות

עבודה זו מתארת את הליך הכנת תאי הזרימה לבדיקת מסך הדנ"א (איור 1A). בדיקת מסך הדנ"א אפשרה את המחקר של הרכבת דימר היסטון H3-H4 על DNA על ידי Abo1. ראשית, היווצרות מסך הדנ"א נבדקה על ידי צביעת מולקולות דנ"א ב-YOYO-1, צבע מצטלב. קווים ירוקים הוצגו במערכים מקבילים, מה שמצביע על כך ש-YOYO-1 הצטלב למ?...

Discussion

כטכניקת הדמיה של מולקולה יחידה, נעשה שימוש נרחב בווילון הדנ"א כדי לחקור תגובות מטבוליות של דנ"א⁴³. וילון DNA הוא מערכת היברידית המשרשרת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ו-TIRFM. שלא כמו טכניקות אחרות של מולקולות בודדות, מסך DNA מאפשר הדמיה בזמן אמת בתפוקה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA. ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL luer-lock syringe	BecktonDickinson	301321
1' x 3' fused-silca slide glass	G. Finkenbeiner		1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringe	BecktonDickinson	302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)	Avanti	850375	This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PE	Avanti	870273	This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PE	Avanti	880130	This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringe	BecktonDickinson	302832
6-way sample injection valve	IDEX	MX series II
950K PMMA	All-resist	671.04
Acetone	SAMCHUN	A1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)	Sigma	A2383
Aluminum (Al)	TASCO, South Korea	LT50AI414	Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa	Millipore	Z648027
Ampicillin	Mbcell	MB-A4128	Antibiotics
AZ 300 MIF developer	Merck	10454110521	Used for removing aluminum
Blade	DORCO	DN52	12 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3)	UNIONGAS		Purity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7030
Catalase	Sigma	C40-1g	This is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2)	UNIONGAS		Purity: >99.99%
Clear double-sided tape	3M	313770
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DC sputter	Sorona	SRM-120	Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bit	Eurotool	DIB-211.00	Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
Dove-prism	Korea Electro-Optics Co. Ltd.	1906-106	Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
Drill	Dremel	Dremel 3000	Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean Lithography	Nanobeam Ltd.	NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)	Sigma	EDS-1KG
Fingertight fittings	IDEX	F-300	It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nut	IDEX	P-235	It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOL	Labogene	HC3110	Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidase	Sigma	G2133-50KU	This is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochloride	Acros Organics	364790025
Hamilton syringe	Hamilton Company	80065	This syringe is used for sample injection
Hellmanex III	Sigma	Z805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg	Cytiva	28-9893-36	Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrer	Corning	PC-420D
Hydrochloric acid	Sigma	H1759	Used for Tris-HCl
Index matching oil	ZEISS	444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etching	Top Technology Ltd.	FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Glentham Life Sciences	GC6586-100g	Used for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNA	NEB	N0311
LB broth	BD difco	244610	Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32	IDEX	P-659	This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydrate	fisher bioreagents	BP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	KAYAKU ADVANCED MATERIALS		Used for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2)	Nikon	Eclipse Ti2	Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslip	MARIENFELD	101142	22 x 50 mm (No. 1)
Microscope slide	DURAN GROUP	DU.2355013	Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
Nanoport	IDEX	N-333-01
Objective lens	Nikon	CFI Plan Apochromat VC 60XC WI	Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli	Thermo Fisher Scientific	C6060-03	Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2)	NOBLEGAS, South Korea		Purity: >99.99%
PFA tubing natural	IDEX	1512L	It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche	11359061001	Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High Resolution	Cytiva	17-0584-01	Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valve	IDEX	P-732
Sodium acetate	Sigma	791741
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S3014
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	s5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa	Spectrum laboratories	132660
Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	S888
Sulfur tetralfluoride (SF4)	NOBLEGAS, South Korea		Purity: >99.99%
Syringe pump	KD Scientific	78-8210
Tetrafluoromethane (CF4)	NOBLEGAS, South Korea		Purity: >99.99%
TritonX-100	Sigma	T9284
Trizma base	Sigma	T1503	Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PW	TOSOH	14715	Used for FPLC (ion exchange)
Union assembly	IDEX	P-760	This connects tubings
Urea	Sigma	U5378
Vacuum oven	Jeio Tech	OV-11
YOYO-1	Thermo Fisher Scientific	Y3601	This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M6250