Decifrando o Mecanismo Molecular da Montagem de Histonas pela Técnica de Cortina de DNA

Resumo

A cortina de DNA, uma técnica de imagem de molécula única de alto rendimento, fornece uma plataforma para visualização em tempo real de diversas interações proteína-DNA. O presente protocolo utiliza a técnica de cortina de DNA para investigar o papel biológico e o mecanismo molecular de Abo1, uma Schizosaccharomyces pombe contendo bromodomínio AAA+ ATPase.

Resumo

A cromatina é uma estrutura de ordem superior que empacota o DNA eucariótico. A cromatina sofre alterações dinâmicas de acordo com a fase do ciclo celular e em resposta a estímulos ambientais. Essas alterações são essenciais para a integridade genômica, regulação epigenética e reações metabólicas do DNA, como replicação, transcrição e reparo. A montagem da cromatina é crucial para a dinâmica da cromatina e é catalisada por chaperonas de histonas. Apesar de extensos estudos, os mecanismos pelos quais as chaperonas de histonas permitem a montagem da cromatina permanecem indefinidos. Além disso, as características globais dos nucleossomos organizados por chaperonas de histonas são pouco compreendidas. Para resolver esses problemas, este trabalho descreve uma técnica única de imagem de molécula única chamada cortina de DNA, que facilita a investigação dos detalhes moleculares da montagem de nucleossomos por chaperonas de histonas. A cortina de DNA é uma técnica híbrida que combina fluidez lipídica, microfluídica e microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRFM) para fornecer uma plataforma universal para imagens em tempo real de diversas interações proteína-DNA. Usando cortina de DNA, a função de chaperona de histona de Abo1, a Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase, é investigada, e o mecanismo molecular subjacente à montagem de histonas de Abo1 é revelado. A cortina de DNA fornece uma abordagem única para estudar a dinâmica da cromatina.

Introdução

O DNA eucariótico é empacotado em uma estrutura de ordem superior conhecida como cromatina ^1,2. O nucleossomo é a unidade fundamental da cromatina, que consiste em aproximadamente 147 pb de DNA envolto em torno das histonas do núcleo octeramérica ^3,4. A cromatina desempenha um papel crítico em células eucarióticas; por exemplo, a estrutura compacta protege o DNA de fatores endógenos e ameaças exógenas⁵. A estrutura da cromatina muda dinamicamente de acordo com a fase do ciclo celular e estímulos ambientais, e essas alterações controlam o acesso às proteínas durante transações de DNA, como replicação, transcrição e reparo⁶. A dinâmica da cromatina também é importante para a estabilidade genômica e informações epigenéticas.

A cromatina é regulada dinamicamente por vários fatores, incluindo modificações na cauda de histonas e organizadores da cromatina, como remodeladores de cromatina, proteínas do grupo policomb e chaperonas de histonas⁷. As chaperonas de histonas coordenam a montagem e desmontagem de nucleossomos via deposição ou descolamento de histonas centrais ^8,9. Defeitos nas chaperonas de histonas induzem instabilidade do genoma e causam distúrbios do desenvolvimento e câncer ^9,10. Várias chaperonas de histonas não necessitam de consumo de energia química, como hidrólise de ATP, para montar ou desmontar nucleossomos 9,11,12,13. Recentemente, pesquisadores relataram que AAA+ contendo bromodomínio (ATPase associada a diversas atividades celulares) ATPases desempenham um papel na dinâmica da cromatina como chaperonas de histonas 14,15,16,17. A ATAD2 humana (ATPase family AAA domain-containing protein 2) promove a acessibilidade da cromatina para aumentar a expressão gênica¹⁸. Como co-regulador transcricional, o ATAD2 regula a cromatina dos fatores transcricionais oncogênicos¹⁴, e a superexpressão de ATAD2 está relacionada ao mau prognóstico em muitos tipos de câncer¹⁹. Yta7, o homólogo de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) de ATAD2, diminui a densidade nucleossômica na cromatina¹⁵. Em contraste, Abo1, o Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homólogo de ATAD2, aumenta a densidade nucleossômica¹⁶. Usando uma técnica única de imagem de molécula única, a cortina de DNA, se Abo1 contribui para a montagem ou desmontagem do nucleossomo^é abordada ^17,20.

Tradicionalmente, as propriedades bioquímicas de biomoléculas têm sido examinadas por experimentos em massa, como o ensaio de deslocamento da mobilidade eletroforética (EMSA) ou a co-imunoprecipitação (co-IP), nos quais um grande número de moléculas é sondado e suas propriedades médias são^{caracterizadas21,22}. Em experimentos em massa, os sub-estados moleculares são velados pelo efeito ensemble-average, e a sondagem de interações biomoleculares é restrita. Em contraste, técnicas de molécula única contornam as limitações dos experimentos em massa e permitem a caracterização detalhada das interações biomoleculares. Em particular, técnicas de imagem de molécula única têm sido amplamente utilizadas para estudar interações DNA-proteína e proteína-proteína²³. Uma dessas técnicas é a cortina de DNA, uma técnica única de imagem de molécula única baseada em microfluídica e microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRFM)^24,25. Em uma cortina de DNA, centenas de moléculas individuais de DNA estão ancoradas à bicamada lipídica, o que permite o movimento bidimensional das moléculas de DNA devido à fluidez lipídica. Quando o fluxo hidrodinâmico é aplicado, as moléculas de DNA se movem ao longo do fluxo na bicamada e ficam presas em uma barreira de difusão, onde são alinhadas e esticadas. Enquanto o DNA é corado com agentes intercalantes, proteínas fluorescentemente marcadas são injetadas, e o TIRFM é usado para visualizar interações proteína-DNA em tempo real em nível de molécula^{única 23}. A plataforma de cortina de DNA facilita a observação de movimentos de proteínas como difusão, translocação e colisão 26,27,28. Além disso, a cortina de DNA pode ser utilizada para mapeamento de proteínas no DNA com posições, orientações e topologias definidas ou aplicada ao estudo da separação de fases de proteínas e ácidos nucléicos 29,30,31.

Neste trabalho, a técnica de cortina de DNA é usada para fornecer evidências da função de chaperonas através da visualização direta de proteínas específicas. Além disso, como a cortina de DNA é uma plataforma de alto rendimento, ela facilita uma extensão de coleta de dados suficiente para a confiabilidade estatística. Aqui, descreve-se como conduzir o ensaio de cortina de DNA em detalhes para investigar o papel molecular de S. pombe bromodomain contendo AAA+ ATPase Abo1.

Protocolo

1. Preparação da célula de fluxo

1. Prepare uma lâmina de sílica fundida limpa contendo padrões de nano-trincheira seguindo o relatório²⁵ publicado anteriormente.
   1. Faça dois furos com 1 mm de diâmetro em uma lâmina de sílica fundida limpa (Figura 1A) usando uma broca revestida de diamante (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Deposite 250 nm de alumínio espesso (Al) na lâmina usando a pulverização DC³² (ver Tabela de Materiais) com 10 mTorr de gás argônio.
   3. Spin-coat uma camada de 310 nm de espessura de 4% 950K poli(metacrilato de metila) (PMMA) (ver Tabela de Materiais) a 4.000 rpm por 1 min e asse em uma placa quente a 180 °C por 3 min.
   4. Desenhe os padrões de nano-trincheiras na camada de PMMA entre os dois furos usando litografia de feixe de elétrons (ebeam)³³ com corrente de 0,724 nA a 80 kV.
      NOTA: A arquitetura e as dimensões dos padrões de nano-trincheira são mostradas na Figura 1A.
   5. Remova o PMMA exposto ao feixe mergulhando as lâminas na solução reveladora (proporção 1:3 de metilisobutilcetona e isopropanol, ver Tabela de Materiais) por 2 minutos.
   6. Camadas de Etch Al com corrosão iônica reativa a plasma indutivamente acoplado (ICP-RIE) usando cloro (Cl₂) e tricloreto de boro (BCl₃).
      NOTA: Estes dois gases podem remover o Al das áreas expostas ao feixe.
   7. Esculpir nano-trincheiras nas lâminas usando tetrafluoreto de enxofre (SF₄), tetrafluorometano (CF₄) e gases de oxigênio (O₂) (ver Tabela de Materiais).
   8. Remova a camada de Al restante mergulhando os slides em Al etchant (desenvolvedor AZ 300 MIF, consulte Tabela de Materiais) por 10 minutos.
   9. Após a fabricação, enxaguar as lâminas com água deionizada e sonicar em acetona por 30 min usando um sonicador tipo banho.
   10. Limpe as lâminas em solução de Hellmanex III a 2% (ver Tabela de Materiais) durante pelo menos 1 dia com agitação magnética.
   11. Sonicar as lâminas em acetona por 30 min e NaOH 1 M por 30 min sucessivamente.
   12. Enxaguar as lâminas com água deionizada e secar com um gás nitrogênio (N₂).
2. Coloque um papel limpo (5 mm x 35 mm) no centro da fita dupla face. Fixe a fita sobre a lâmina para cobrir os dois orifícios e os nanopadrões com o papel.
3. Excique o papel usando uma lâmina limpa (Figura 1A).
4. Coloque uma tampa de vidro em cima da fita dupla face e esfregue a lamínula usando uma ponta de pipeta para formar uma câmara microfluídica (Figura 1A).
5. Coloque a célula de fluxo montada entre duas lâminas de microscópio e prenda-as.
6. Asse a célula de fluxo em forno a vácuo a 120 °C por 45 min.
7. Conecte o conector de fluido (Nanoport) para as análises baseadas em chips (consulte Tabela de Materiais) a cada orifício aberto usando uma pistola de cola quente e conecte as duas linhas de tubulação Luer lock.
8. Conecte uma seringa Luer lock contendo 3 mL de água deionizada e lave a câmara.
9. Lavar a câmara com 3 mL de tampão lipídico (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 e 100 mM de NaCl) através da conexão gota-a-gota.
   NOTA: A conexão gota a gota liga todas as seringas à célula de fluxo para evitar a injeção de bolhas de ar na câmara.
10. Injetar 1 mL de lipídio biotinilado 0,04x em tampão lipídico na câmara em dois disparos com 5 min de incubação por disparo.
    NOTA: A preparação de 1x estoque lipídico biotinilado é descrita em um relatório publicado anteriormente³⁴.
11. Lavar a câmara com 3 mL de tampão lipídico e incubar por 20 min para que a bicamada lipídica seja maturada na superfície da lâmina.
12. Adicionar 1 mL de tampão BSA (40 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl₂ e 0,2 mg/mL de BSA) e incubar por 5 min para passivar a superfície da lâmina.
    NOTA: Esta etapa pode reduzir a ligação inespecífica de proteínas à superfície da lâmina.
13. Injetar 0,025 mg/mL de estreptavidina em 1 mL de tampão BSA com duas doses e 10 min de incubação por injeção.
14. Lavar a estreptavidina residual com 3 ml de tampão BSA.
15. Injetar ~300 pM (30 μL) de DNA de fagos lambda biotinilados em 1 mL de tampão BSA na câmara com dois tiros e 10 min de incubação por disparo.
    NOTA: A preparação de DNA lambda biotinilado é descrita em um relatório publicado anteriormente³⁴.

2. Conectando a célula de fluxo ao sistema microfluídico e carregando-a no microscópio

1. Preparar tampão de imagem Abo1 (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 1 mM de TDT, 1 mM de ATP, 2 mM de MgCl₂, 1,6% de glicose e 0,1x de gloxy, ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Gloxy é um sistema de sequestro de oxigênio que reduz o fotobranqueamento de corantes fluorescentes. A preparação de estoque de gloxy 100x com glicose oxidase e catalase é descrita na referência³⁵.
2. Conecte uma seringa contendo 10 mL de tampão de imagem a uma bomba de seringa e remova as bolhas em todas as linhas de tubulação no sistema microfluídico.
3. Acoplar a célula de fluxo preparada com o sistema microfluídico através de conexão gota-gota para evitar a injeção de bolhas na célula de fluxo (Figura 1B).
4. Monte a célula de fluxo e os suportes de célula de fluxo e monte o conjunto em um microscópio TIRF personalizado (Figura 1C).
   CUIDADO: Quando a célula de fluxo for colocada sob o microscópio, ajuste cuidadosamente a altura da lente objetiva. A célula de fluxo não deve tocar na lente objetiva. Isso pode danificar a lente.
5. Índice de queda de óleo correspondente no centro da célula de fluxo e coloque um prisma de pomba feito sob medida (consulte Tabela de Materiais) na gota de óleo.

3. Montagem de Histone por Abo1 usando cortina de DNA

1. Misturar 5 nM de Abo1 e 12,5 nM de dímero de histona H3-H4 marcado com Cy5 (Cy5-H3-H4) (ver Tabela de Materiais) em 150 μL de tampão de imagem. Todas as proteínas foram preparadas seguindo relato publicado anteriormente¹⁷.
2. Incubar a mistura no gelo por 15 min.
   OBS: Para evitar o fotoclareamento do Cy5, a incubação deve ser feita no escuro.
3. Injetar ~20 pM (2 μL) de corante YOYO-1 em tampão de imagem através de uma alça de amostra de 100 μL para corar moléculas de DNA lambda.
4. Execute o software de imagem (consulte a Tabela de Materiais) e ligue o laser de 488 nm para verificar se as cortinas de DNA estão bem formadas.
   NOTA: Se as cortinas de DNA são bem formadas, as moléculas de DNA, que são coradas com YOYO-1, são mostradas como linhas alinhadas em uma barreira na presença de fluxo. As linhas esticadas recuam e se difundem para longe da barreira quando o fluxo é desligado.
5. Injetar 2 mL de tampão salino alto (200 mM de NaCl e 40 mM de MgCl₂) para eliminar o corante YOYO-1 do DNA.
6. Após a remoção do corante YOYO-1, injete a amostra de proteína pré-incubada.
7. Quando as proteínas atingirem a cortina de DNA, desligue a bomba da seringa, desligue a válvula de desligamento e incube 15 min para carregamento de histona por Abo1.
8. Lave as proteínas Abo1 e histonas não ligadas por 5 min.
9. Ligue a válvula de desligamento e retome a injeção de fluxo.
10. Ligue o laser de 637 nm e obtenha imagens das proteínas fluorescentes enquanto o fluxo tampão está ligado.
11. Desligue transitoriamente o fluxo tampão para verificar se as proteínas de histonas estão carregadas no DNA (Figura 2C).
12. Coletar imagens de cortina de DNA com um programa de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Quando o fluxo tampão pára transitoriamente, o DNA recua para fora do campo evanescente de reflexão interna total, e as proteínas fluorescentemente marcadas ligadas ao DNA desaparecem.

4. Análise dos dados

1. Transformar as imagens obtidas pelo programa de aquisição de imagens em formato TIFF como sequências de imagens.
   OBS: Todos os dados foram analisados utilizando-se a Imagem J (NIH) conforme descrito na Referência²⁰.
2. Escolha uma única molécula de DNA das sequências de imagem e desenhe um quimógrafo.
   NOTA: O quimógrafo pode mostrar a mudança na intensidade de fluorescência de cada proteína de histona ligada a uma única molécula de DNA em função do tempo.
3. Crie o perfil de intensidade de fluorescência a partir do quimógrafo e encaixe-o com múltiplas funções gaussianas.
4. Coletar as coordenadas centrais dos picos do perfil de intensidade de fluorescência. Nesta etapa, pode-se obter a intensidade mínima de fluorescência de histonas.
5. Divida todas as intensidades de pico coletadas dos perfis pela intensidade mínima. O número de dímeros H3-H4 ligados ao DNA é estimado nesta etapa.
6. Execute as etapas 4.2-4.5 para outras moléculas de DNA.
7. Crie um histograma para a distribuição de ligação de dímeros H3-H4 com tamanho de compartimento de 1 kbp. O número de moléculas analisadas é de pelo menos 300.

Resultados

Este trabalho descreve o procedimento de preparação de células de fluxo para o ensaio de cortina de DNA (Figura 1A). O ensaio de cortina de DNA facilitou o estudo da montagem de dímeros de histona H3-H4 no DNA por Abo1. Primeiro, a formação de cortinas de DNA foi verificada pela coloração de moléculas de DNA com YOYO-1, um corante intercalante. Linhas verdes foram mostradas em arranjos paralelos, indicando que YOYO-1 intercalou em moléculas de DNA, que estavam bem alinhadas e estic...

Discussão

Como uma técnica de imagem de molécula única, a cortina de DNA tem sido usada extensivamente para sondar reações metabólicas do DNA⁴³. A cortina de DNA é um sistema híbrido que concatena fluidez lipídica, microfluídica e TIRFM. Ao contrário de outras técnicas de molécula única, a cortina de DNA permite a visualização em tempo real de alto rendimento das interações proteína-DNA. Portanto, a técnica de cortina de DNA é adequada para investigar o mecanismo por trás das interaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL luer-lock syringe	BecktonDickinson	301321
1' x 3' fused-silca slide glass	G. Finkenbeiner		1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringe	BecktonDickinson	302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)	Avanti	850375	This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PE	Avanti	870273	This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PE	Avanti	880130	This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringe	BecktonDickinson	302832
6-way sample injection valve	IDEX	MX series II
950K PMMA	All-resist	671.04
Acetone	SAMCHUN	A1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)	Sigma	A2383
Aluminum (Al)	TASCO, South Korea	LT50AI414	Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa	Millipore	Z648027
Ampicillin	Mbcell	MB-A4128	Antibiotics
AZ 300 MIF developer	Merck	10454110521	Used for removing aluminum
Blade	DORCO	DN52	12 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3)	UNIONGAS		Purity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7030
Catalase	Sigma	C40-1g	This is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2)	UNIONGAS		Purity: >99.99%
Clear double-sided tape	3M	313770
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DC sputter	Sorona	SRM-120	Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bit	Eurotool	DIB-211.00	Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
Dove-prism	Korea Electro-Optics Co. Ltd.	1906-106	Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
Drill	Dremel	Dremel 3000	Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean Lithography	Nanobeam Ltd.	NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)	Sigma	EDS-1KG
Fingertight fittings	IDEX	F-300	It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nut	IDEX	P-235	It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOL	Labogene	HC3110	Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidase	Sigma	G2133-50KU	This is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochloride	Acros Organics	364790025
Hamilton syringe	Hamilton Company	80065	This syringe is used for sample injection
Hellmanex III	Sigma	Z805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg	Cytiva	28-9893-36	Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrer	Corning	PC-420D
Hydrochloric acid	Sigma	H1759	Used for Tris-HCl
Index matching oil	ZEISS	444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etching	Top Technology Ltd.	FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Glentham Life Sciences	GC6586-100g	Used for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNA	NEB	N0311
LB broth	BD difco	244610	Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32	IDEX	P-659	This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydrate	fisher bioreagents	BP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	KAYAKU ADVANCED MATERIALS		Used for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2)	Nikon	Eclipse Ti2	Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslip	MARIENFELD	101142	22 x 50 mm (No. 1)
Microscope slide	DURAN GROUP	DU.2355013	Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
Nanoport	IDEX	N-333-01
Objective lens	Nikon	CFI Plan Apochromat VC 60XC WI	Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli	Thermo Fisher Scientific	C6060-03	Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2)	NOBLEGAS, South Korea		Purity: >99.99%
PFA tubing natural	IDEX	1512L	It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche	11359061001	Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High Resolution	Cytiva	17-0584-01	Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valve	IDEX	P-732
Sodium acetate	Sigma	791741
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S3014
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	s5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa	Spectrum laboratories	132660
Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	S888
Sulfur tetralfluoride (SF4)	NOBLEGAS, South Korea		Purity: >99.99%
Syringe pump	KD Scientific	78-8210
Tetrafluoromethane (CF4)	NOBLEGAS, South Korea		Purity: >99.99%
TritonX-100	Sigma	T9284
Trizma base	Sigma	T1503	Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PW	TOSOH	14715	Used for FPLC (ion exchange)
Union assembly	IDEX	P-760	This connects tubings
Urea	Sigma	U5378
Vacuum oven	Jeio Tech	OV-11
YOYO-1	Thermo Fisher Scientific	Y3601	This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M6250