JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

DNAカーテンは、ハイスループットな1分子イメージング技術であり、多様なタンパク質-DNA相互作用をリアルタイムで可視化するためのプラットフォームを提供します。現在のプロトコルはAbo1の Schizosaccharomycesのpombe のbromodomain含んでいるAAA+ ATPaseの生物的役割そして分子メカニズムを調査するのにDNAのカーテンの技術を利用する。

要約

クロマチンは、真核生物のDNAをパッケージ化する高次構造です。クロマチンは、細胞周期の段階に応じて、また環境刺激に応答して動的に変化します。これらの変化は、ゲノムの完全性、エピジェネティックな調節、および複製、転写、修復などのDNA代謝反応に不可欠です。クロマチンの集合体はクロマチンの動態に不可欠であり、ヒストンシャペロンによって触媒されます。広範な研究にもかかわらず、ヒストンシャペロンがクロマチンの組み立てを可能にするメカニズムは、とらえどころのないままです。さらに、ヒストンシャペロンによって組織化されたヌクレオソームの全体的な特徴はよくわかっていません。これらの問題に対処するために、本研究では、ヒストンシャペロンによるヌクレオソームアセンブリの分子詳細の調査を容易にするDNAカーテンと呼ばれる独自の単一分子イメージング技術について説明します。DNAカーテンは、脂質流動性、マイクロ流体工学、全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を組み合わせたハイブリッド技術であり、多様なタンパク質-DNA相互作用のリアルタイムイメージングのためのユニバーサルプラットフォームを提供します。DNAカーテンを用いて、Abo1のヒストンシャペロン機能( Schizosaccharomyces pombe bromodomain 含有AAA+ ATPase)を調べ、Abo1のヒストン集合の分子機構を明らかにしました。DNAカーテンは、クロマチン動態を研究するためのユニークなアプローチを提供します。

概要

真核生物のDNAは、クロマチン1,2として知られる高次構造にパッケージ化されています。ヌクレオソームはクロマチンの基本単位であり、オクタメリックコアヒストンに巻き付いた約147 bpのDNAから構成されています3,4。クロマチンは真核細胞において重要な役割を果たします。例えば、コンパクトな構造は、内因性因子や外因性の脅威からDNAを保護します5。クロマチンの構造は、細胞周期の段階や環境刺激に応じてダイナミックに変化し、複製、転写、修復などのDNAトランザクションにおけるタンパク質のアクセスを制御しています6。クロマチン動態は、ゲノムの安定性やエピジェネティックな情報にとっても重要です。

クロマチンは、ヒストン尾部修飾やクロマチンリモデラー、ポリコーム群タンパク質、ヒストンシャペロンなどのクロマチンオーガナイザーなど、さまざまな要因によって動的に制御されています7。ヒストンシャペロンは、コアヒストンの堆積または剥離を介してヌクレオソームの組み立てと分解を調整します8,9。ヒストンシャペロンの欠損はゲノムの不安定性を誘発し、発達障害や癌を引き起こします9,10。様々なヒストンシャペロンは、ヌクレオソームを組み立てたり分解したりするためにATP加水分解のような化学的エネルギー消費を必要としません9,11,12,13。最近、研究者らは、ブロモドメインを含むAAA+(多様な細胞活性に関連するATPアーゼ)ATPアーゼが、ヒストンシャペロンとしてクロマチン動態に関与していることを報告しました14,15,16,17。ヒトATAD2(ATPaseファミリーAAAドメイン含有タンパク質2)は、クロマチンのアクセシビリティを促進し、遺伝子発現を増強する18。転写共調節因子として、ATAD2は発がん性転写因子のクロマチンを調節しており14、ATAD2の過剰発現は多くの種類の癌における予後不良と関連している19。ATAD2の出芽酵母(S. cerevisiae)ホモログであるYta7は、クロマチン15のヌクレオソーム密度を低下させる。対照的に、ATAD2の分裂分裂菌(S. pombe)ホモログであるAbo1は、ヌクレオソーム密度を増加させる16。独自の単一分子イメージング技術であるDNAカーテンを用いて、Abo1がヌクレオソームの組み立てまたは分解に寄与するかどうかが取り上げられる17,20。

従来、生体分子の生化学的特性は、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)や共免疫沈降(co-IP)などのバルク実験によって調べられており、多数の分子が調べられ、それらの平均特性が特徴付けられています21,22。バルク実験では、分子のサブステートはアンサンブル平均効果によってベールに包まれ、生体分子相互作用の探索は制限されます。対照的に、単一分子技術はバルク実験の限界を回避し、生体分子相互作用の詳細な特性評価を可能にします。特に、単一分子イメージング技術は、DNA-タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互作用の研究に広く使用されている23。そのような技術の1つが、マイクロ流体工学と全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)に基づく独自の単一分子イメージング技術であるDNAカーテンです24,25。DNAカーテンでは、何百もの個々のDNA分子が脂質二重層に固定されており、脂質の流動性によりDNA分子の2次元運動が可能になります。流体力学的流れが適用されると、DNA分子は二重層上の流れに沿って移動し、拡散障壁に引っかかり、そこで整列して引き伸ばされます。DNAをインターカレート剤で染色しながら、蛍光標識タンパク質を注入し、TIRFMを使用してタンパク質-DNA相互作用を1分子レベルでリアルタイムに可視化します23。DNAカーテンプラットフォームは、拡散、転座、衝突などのタンパク質の動きの観察を容易にします26,27,28。さらに、DNAカーテンは、定義された位置、配向、およびトポロジーを持つDNAのタンパク質マッピングに使用したり、タンパク質と核酸の相分離の研究に適用したりできます29,30,31。

この研究では、DNAカーテン技術を使用して、特定のタンパク質を直接可視化することにより、シャペロンの機能の証拠を提供します。さらに、DNAカーテンはハイスループットプラットフォームであるため、統計的信頼性に十分なデータ収集が容易になります。ここでは、 S. pombe bromodomain含有AAA+ ATPase Abo1の分子的役割を調べるためのDNAカーテンアッセイの実施方法について詳細に説明する。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1. フローセルの作製

  1. 以前に公開されたレポート25に従って、ナノトレンチパターンを含む洗浄済みの石英ガラススライドを準備します。
    1. ダイヤモンドコーティングされたドリルビットを使用して、洗浄済みの石英ガラススライド(図1A)に直径1 mmの穴を2つ開けます( 材料表を参照)。
    2. DCスパッタ32 ( 材料表参照)と10mTorrのアルゴンガスを使用して、250nmの厚いアルミニウム(Al)をスライド上に堆積させます。
    3. 厚さ310 nmの4%950Kポリメタクリル酸メチル(PMMA)( 材料表参照)を4,000rpmで1分間スピンコートし、180°Cのホットプレートで3分間焼きます。
    4. 80kVで0.724nAの電流で電子ビーム(ebeam)リソグラフィー33 を使用して、2つの穴の間のPMMA層にナノトレンチパターンを描画します。
      注:ナノトレンチパターンのアーキテクチャと寸法を 図1Aに示します。
    5. スライドを現像液(メチルイソブチルケトンとイソプロパノールの比率が1:3、 材料表を参照)に2分間浸漬して、電子ビーム露光されたPMMAを除去します。
    6. 塩素(Cl2)および三塩化ホウ素(BCl3)ガスを用いた誘導結合プラズマ反応性イオンエッチング(ICP-RIE)によるエッチングAl層。
      注:これら2つのガスは、ビームが露出した領域からAlを除去することができます。
    7. 四フッ化硫黄(SF4)、テトラフルオロメタン(CF4)、および酸素(O2)ガスを使用して、スライドにナノトレンチを刻みます( 材料表を参照)。
    8. スライドをAlエッチング液(AZ 300 MIF現像液、 材料表を参照)に10分間浸漬して、残りのAl層を除去します。
    9. 製造後、スライドを脱イオン水ですすぎ、浴式超音波処理装置を使用してアセトンで30分間超音波処理します。
    10. スライドを2%Hellmanex III溶液( 材料表参照)で磁気撹拌で少なくとも1日間洗浄します。
    11. スライドをアセトンで 30 分間、1 M NaOH で 30 分間連続して超音波処理します。
    12. スライドを脱イオン水ですすぎ、窒素(N2)ガスで乾燥させます。
  2. 両面テープの中央にきれいな紙(5mm×35mm)を貼ります。スライドの上にテープを貼り、2つの穴とナノパターンを紙で覆います。
  3. 清潔なブレードを使用して用紙を切除します(図1A)。
  4. 両面テープの上にガラス製のカバーガラスを置き、ピペットチップでカバーガラスをこすり、マイクロ流体チャンバーを形成します(図1A)。
  5. 組み立てたフローセルを2枚の顕微鏡スライドの間に置き、クリップで留めます。
  6. フローセルを120°Cの真空オーブンで45分間焼きます。
  7. ホットグルーガンを使用して、チップベースの分析用の流体コネクタ(ナノポート)を各開いた穴に取り付け( 材料表を参照)、ルアーロックチューブの2本のラインを接続します。
  8. 3 mLの脱イオン水を含むルアーロックシリンジを接続し、チャンバーを洗浄します。
  9. 3 mLの脂質緩衝液(20 mMのTris-HCl、pH 8.0、および100 mMのNaCl)でチャンバーをドロップバイドロップ接続 で 洗浄します。
    注意: ドロップバイドロップ接続は、チャンバーに気泡が注入されないように、すべてのシリンジをフローセルにリンクします。
  10. 脂質バッファー中の 0.04x ビオチン化脂質 1 mL をチャンバーに注入し、1 ショットあたり 5 分間のインキュベーションで 2 ショットで行います。
    注:1xビオチン化脂質ストックの調製は、以前に発表されたレポート34に記載されています。
  11. チャンバーを3 mLの脂質緩衝液で洗浄し、20分間インキュベートして、脂質二重層をスライド表面上で成熟させます。
  12. 1 mL の BSA バッファー(40 mM の Tris-HCl、pH 8.0、50 mM の NaCl、2 mM の MgCl2、0.2 mg/mL の BSA)を加え、5 分間インキュベートしてスライド表面を不動態化します。
    注:このステップにより、スライド表面へのタンパク質の非特異的結合を減らすことができます。
  13. 0.025 mg/mL のストレプトアビジンを 1 mL の BSA バッファーに 2 回のショットで注入し、1 ショットあたり 10 分間のインキュベーションを行います。
  14. 残留ストレプトアビジンを3 mLのBSA緩衝液で洗い流します。
  15. ~300 pM(30 μL)のビオチン化ラムダファージDNAを1 mLのBSAバッファーに2ショット、1ショットあたり10分間のインキュベーションでチャンバーに注入します。
    注:ビオチン化ラムダDNAの調製は、以前に発表されたレポート34に記載されています。

2. フローセルをマイクロ流体システムに接続し、顕微鏡にロードする

  1. Abo1イメージングバッファー(50 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM ATP、2 mM MgCl2、1.6%グルコース、0.1xグロキシー、材料 表を参照)を調製します。
    注:グロキシーは、蛍光染料の光退色を低減する酸素掃気システムです。グルコースオキシダーゼとカタラーゼによる100倍グロキシストックの調製については、参考文献35に記載されています。
  2. 10 mLのイメージングバッファーを含むシリンジをシリンジポンプに接続し、マイクロ流体システムのすべてのチューブラインで気泡を除去します。
  3. 準備したフローセルをドロップtoドロップ接続 で マイクロ流体システムと結合し、フローセルへの気泡注入を回避します(図1B)。
  4. フローセルとフローセルホルダーを組み立て、カスタムメイドのTIRF顕微鏡に取り付けます(図1C)。
    注意: フローセルを顕微鏡下に置くときは、対物レンズの高さを慎重に設定してください。フローセルは対物レンズに触れてはなりません。レンズが破損する恐れがあります。
  5. フローセルの中央にオイルに一致するインデックスを滴下し、オイルドロップにカスタムメイドのダブプリズム( 材料表を参照)を置きます。

3. DNAカーテンを用いたAbo1によるヒストン集合

  1. 5 nM の Abo1 と 12.5 nM の Cy5 標識 H3-H4 ヒストン二量体(Cy5-H3-H4)( 資料表参照)を 150 μL のイメージングバッファー中で混合します。すべてのタンパク質は、以前に発表されたレポート17に従って調製されました。
  2. 混合物を氷上で15分間インキュベートします。
    注:Cy5の光退色を避けるために、インキュベーションは暗所で行う必要があります。
  3. ~20 pM(2 μL)のYOYO-1色素をイメージングバッファーに注入し、100 μLのサンプルループを通してラムダDNA分子を染色します。
  4. イメージングソフトウェア( 材料表を参照)を実行し、488 nmレーザーをオンにして、DNAカーテンが整形されているかどうかを確認します。
    注:DNAカーテンが整形されている場合、YOYO-1で染色されたDNA分子は、流れの存在下でバリアに整列した線として表示されます。引き伸ばされたラインは、流れがオフになると反動してバリアから拡散します。
  5. 2 mLの高塩バッファー(200 mMのNaClと40 mMのMgCl2)を注入して、DNAからYOYO-1色素を除去します。
  6. YOYO-1色素を除去した後、インキュベートしたタンパク質サンプルを注入します。
  7. タンパク質がDNAカーテンに到達したら、シリンジポンプをオフにし、シャットオフバルブをオフにし、15分間インキュベートしてAbo1によるヒストンローディングを行います。
  8. 結合していないAbo1タンパク質とヒストンタンパク質を5分間洗い流します。
  9. シャットオフバルブをオンにして、フローインジェクションを再開します。
  10. 637 nmレーザーをオンにし、バッファーフローがオンの状態で蛍光タンパク質をイメージングします。
  11. バッファーフローを一過性にオフにして、ヒストンタンパク質がDNAにロードされているかどうかを確認します(図2C)。
  12. 画像取得プログラムでDNAカーテン画像を収集します( 材料表を参照)。
    注:バッファーフローが一過性に停止すると、DNAは全反射のエバネッセントフィールドから反跳し、DNAに結合した蛍光標識タンパク質は消失します。

4. データ分析

  1. 画像取得プログラムで撮影した画像を画像シーケンスとしてTIFF形式に変換します。
    注:すべてのデータは、参考文献20に記載されているように、Image J(NIH)を使用して分析されました。
  2. 画像シーケンスから単一のDNA分子を選択し、キモグラフを描きます。
    注:キモグラフは、単一のDNA分子に結合した各ヒストンタンパク質の蛍光強度の変化を時間の関数として表示することができます。
  3. キモグラフから蛍光強度プロファイルを作成し、複数のガウス関数で当てはめます。
  4. 蛍光強度プロファイルからピークの中心座標を収集します。この工程では、ヒストン蛍光の最小強度を得ることができる。
  5. プロファイルから収集したすべてのピーク強度を最小強度で割ります。DNAに結合したH3-H4二量体の数は、このステップで推定されます。
  6. 他のDNA分子について、ステップ4.2〜4.5を実行します。
  7. ビンサイズが 1 kbp の H3-H4 二量体の結合分布のヒストグラムを作成します。分析された分子の数は少なくとも300です。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

この研究では、DNAカーテンアッセイ用のフローセル調製手順について説明します(図1A)。DNAカーテンアッセイは、Abo1によるDNA上のヒストンH3-H4二量体集合の研究を容易にしました。まず、インターカレート色素であるYOYO-1でDNA分子を染色することにより、DNAカーテンの形成を確認しました。緑色の線が平行に配列され、YOYO-1がDNA分子に挿入され、流体力学的流れ下で拡散...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

単一分子イメージング技術として、DNAカーテンはDNA代謝反応を調べるために広く使用されている43。DNAカーテンは、脂質流動性、マイクロ流体工学、TIRFMを連結したハイブリッドシステムです。他の単一分子技術とは異なり、DNAカーテンはタンパク質-DNA相互作用のハイスループットなリアルタイム可視化を可能にします。したがって、DNAカーテン法は、配列特異的な会合、DN...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者らは、韓国のKAISTのJi-Joon Song教授、Carol Cho博士、Juwon Jang博士によるAbo1およびCy5-H3-H4への親切な支援に感謝します。この研究は、国立研究財団助成金(NRF-2020R1A2B5B01001792)、蔚山科学技術研究所の学内研究費(1.210115.01)、基礎科学研究所(IBS-R022-D1)の支援を受けています。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL luer-lock syringeBecktonDickinson301321
1' x 3' fused-silca slide glassG. Finkenbeiner1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PEAvanti870273This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PEAvanti880130This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302832
6-way sample injection valveIDEXMX series II
950K PMMAAll-resist671.04
AcetoneSAMCHUNA1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA2383
Aluminum (Al)TASCO, South KoreaLT50AI414Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
AmpicillinMbcellMB-A4128Antibiotics
AZ 300 MIF developerMerck10454110521Used for removing aluminum
BladeDORCODN5212 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3)UNIONGASPurity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
CatalaseSigmaC40-1gThis is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2)UNIONGASPurity: >99.99%
Clear double-sided tape3M313770
D-(+)-glucoseSigmaG7528
DC sputterSoronaSRM-120Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bitEurotoolDIB-211.00Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co. Ltd.1906-106Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
DrillDremelDremel 3000Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean LithographyNanobeam Ltd.NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)SigmaEDS-1KG
Fingertight fittingsIDEXF-300It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nutIDEXP-235It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOLLabogeneHC3110Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidaseSigmaG2133-50KUThis is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochlorideAcros Organics364790025
Hamilton syringeHamilton Company80065This syringe is used for sample injection
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrerCorningPC-420D
Hydrochloric acidSigmaH1759Used for Tris-HCl
Index matching oilZEISS444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etchingTop Technology Ltd.FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Glentham Life SciencesGC6586-100gUsed for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNANEBN0311
LB brothBD difco244610Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32IDEXP-659This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydratefisher bioreagentsBP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK)KAYAKU ADVANCED MATERIALSUsed for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslipMARIENFELD10114222 x 50 mm (No. 1)
Microscope slideDURAN GROUPDU.2355013Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
NanoportIDEXN-333-01
Objective lensNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WIImmersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC6060-03Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
PFA tubing naturalIDEX1512LIt is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche11359061001Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High ResolutionCytiva17-0584-01Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valveIDEXP-732
Sodium acetateSigma791741
Sodium chloride (NaCl)SigmaS3014
Sodium hydroxide (NaOH)Sigmas5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDaSpectrum laboratories132660
StreptavidinThermo Fisher ScientificS888
Sulfur tetralfluoride (SF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
Syringe pumpKD Scientific78-8210
Tetrafluoromethane (CF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
TritonX-100SigmaT9284
Trizma baseSigmaT1503Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715Used for FPLC (ion exchange)
Union assemblyIDEXP-760This connects tubings
UreaSigmaU5378
Vacuum ovenJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME)SigmaM6250

参考文献

  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
  3. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  4. McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
  5. Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622(2013).
  6. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  7. Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658(2013).
  8. Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
  9. Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
  10. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  11. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  12. Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
  13. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  14. Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
  15. Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
  16. Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
  17. Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764(2019).
  18. Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
  19. Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
  20. Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
  21. Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
  22. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
  23. Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
  24. Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
  25. Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
  26. Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
  27. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
  28. Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
  29. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  30. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
  31. Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
  32. Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
  33. Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001(2009).
  34. Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320(2020).
  35. Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  36. Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13(2010).
  37. Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
  38. Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
  39. Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
  40. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  41. Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
  42. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  43. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  44. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  45. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  46. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  47. Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

DNA DNA DNA 1 DNA TIRFM DNA Abo1 Schizosaccharomyces Pombe AAA ATP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved