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摘要

DNA curtain 是一种高通量单分子成像技术，为实时可视化各种蛋白质-DNA 相互作用提供了一个平台。本方案利用DNA帘技术研究了含有裂 殖酵 母的溴结构域AAA+ ATP酶Abo1的生物学作用和分子机制。

摘要

染色质是包装真核 DNA 的高级结构。染色质根据细胞周期阶段和响应环境刺激而发生动态变化。这些变化对于基因组完整性、表观遗传调控和 DNA 代谢反应（如复制、转录和修复）至关重要。染色质组装对染色质动力学至关重要，并由组蛋白伴侣催化。尽管进行了广泛的研究，但组蛋白伴侣使染色质组装的机制仍然难以捉摸。此外，对组蛋白伴侣组织的核小体的全局特征知之甚少。为了解决这些问题，本文描述了一种独特的单分子成像技术，称为DNA帘，该技术有助于研究组蛋白伴侣对核小体组装的分子细节。DNA 幕是一种混合技术，它结合了脂质流动性、微流体和全内反射荧光显微镜 （TIRFM），为各种蛋白质-DNA 相互作用的实时成像提供了一个通用平台。利用DNA帷幕，研究了含有AAA+ ATP酶的 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe bromodomain containing AAA+ ATPase）Abo1的组蛋白伴侣功能，并揭示了Abo1组蛋白组装的分子机制。DNA帷幕为研究染色质动力学提供了一种独特的方法。

引言

真核 DNA 被包装成称为染色质 1,2 的高级结构。核小体是染色质的基本单位，染色质由大约 147 bp 的 DNA 包裹在八聚体核心组蛋白周围 3,4 组成。染色质在真核细胞中起着关键作用;例如，紧凑的结构可保护 DNA 免受内源性因素和外源性威胁的影响 5。染色质结构根据细胞周期阶段和环境刺激而动态变化，这些变化控制 DNA 交易（如复制、转录和修复）过程中的蛋白质获取6。染色质动力学对于基因组稳定性和表观遗传信息也很重要。

染色质受多种因素的动态调控，包括组蛋白尾部修饰和染色质组织者，如染色质重塑因子、多梳基团蛋白和组蛋白伴侣7。组蛋白伴侣通过核心组蛋白的沉积或分离来协调核小体的组装和拆卸 8,9。组蛋白伴侣的缺陷诱导基因组不稳定并导致发育障碍和癌症 9,10。各种组蛋白伴侣不需要像 ATP 水解那样消耗化学能来组装或拆卸核小体9、11、12、13。最近，研究人员报告说，含有溴结构域的 AAA+（与多种细胞活动相关的 ATP 酶）ATP 酶作为组蛋白伴侣在染色质动力学中发挥作用 14,15,16,17。人 ATAD2（ATP 酶家族 AAA 结构域蛋白 2）促进染色质可及性以增强基因表达18。ATAD2 作为转录辅助调节因子，调节致癌转录因子14 的染色质，ATAD2 的过表达与许多类型癌症的不良预后有关19。Yta7 是 ATAD2 的酿酒酵母 （S. cerevisiae） 同源物，可降低染色质15 中的核小体密度。相反，ATAD2 的裂殖酵母 （S. pombe） 同源物 Abo1 增加了核小体密度16。使用独特的单分子成像技术，DNA幕，Abo1是否有助于核小体组装或分解，已得到解决17,20。

传统上，生物分子的生化性质是通过大量实验来检查的，例如电泳迁移率位移测定 （EMSA） 或免疫共沉淀 （co-IP），其中探测了大量分子，并表征了它们的平均性质21,22。在批量实验中，分子亚态被集成平均效应所掩盖，并且探测生物分子相互作用受到限制。相比之下，单分子技术规避了批量实验的局限性，并能够详细表征生物分子相互作用。特别是，单分子成像技术已被广泛用于研究DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用23。其中一种技术是 DNA 帷幕，这是一种基于微流体和全内反射荧光显微镜 （TIRFM） 的独特单分子成像技术24,25。在 DNA 幕中，数百个单独的 DNA 分子锚定在脂质双层上，由于脂质流动性，允许 DNA 分子进行二维运动。当施加流体动力流时，DNA分子沿着双层上的流动移动并卡在扩散屏障处，在那里它们被对齐和拉伸。当DNA用嵌入剂染色时，注入荧光标记的蛋白质，TIRFM用于在单分子水平23上实时可视化蛋白质-DNA相互作用。DNA幕平台有助于观察蛋白质运动，如扩散、易位和碰撞26,27,28。此外，DNA帷幕可用于DNA上具有明确位置、取向和拓扑结构的蛋白质图谱，或应用于蛋白质和核酸的相分离研究29,30,31。

在这项工作中，DNA幕技术用于通过对特定蛋白质的直接可视化来为伴侣的功能提供证据。此外，由于DNA幕是一个高通量平台，它有助于在一定程度上收集数据，足以达到统计可靠性。本文详细描述了如何进行DNA幕式测定，以研究含有 A.pombe 溴结构域的AAA+ ATPase Abo1的分子作用。

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研究方案

1. 流通池的制备

  1. 按照先前发布的报告25准备一个清洁的熔融石英载玻片，其中包含纳米沟槽图案。
    1. 使用金刚石涂层钻头在清洁的熔融石英载玻片（图 1A）中钻两个直径为 1 mm 的孔（参见 材料表）。
    2. 使用直流溅射32 （参见 材料表）和 10 mTorr 氩气在载玻片上沉积 250 nm 厚铝 （Al）。
    3. 在4,000rpm下旋涂310nm厚的4%950K聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）（参见 材料表）1分钟，然后在180°C的热板上烘烤3分钟。
    4. 使用电子束（ebeam）光刻33 在两个孔之间的PMMA层上绘制纳米沟槽图案，在80 kV时电流为0.724 nA。
      注:纳米沟槽图案的结构和尺寸如 图1A所示。
    5. 通过将载玻片浸泡在显影溶液（甲基异丁基酮和异丙醇的1:3比例，参见 材料表）中2分钟，除去暴露的电子束PMMA。
    6. 使用氯 （Cl2） 和三氯化硼 （BCl 3） 气体进行电感耦合等离子体离子蚀刻 （ICP-RIE） 的蚀刻 Al 层。
      注意:这两种气体可以从电子束暴露区域去除铝。
    7. 使用四氟化硫 （SF4）、四氟甲烷 （CF4） 和氧气 （O2） 气体在载玻片上雕刻纳米沟槽（参见 材料表）。
    8. 通过将载玻片浸泡在铝蚀刻剂（AZ 300 MIF显影剂，参见 材料表）中10分钟来去除剩余的Al层。
    9. 制备后，用去离子水冲洗载玻片，并使用浴式超声仪在丙酮中超声处理30分钟。
    10. 用磁力搅拌在2%Hellmanex III溶液（见 材料表）中清洁载玻片至少1天。
    11. 将载玻片在丙酮中超声处理30分钟，在1M NaOH中连续超声处理30分钟。
    12. 用去离子水冲洗载玻片并用氮气（N2）气体干燥。
  2. 将一张干净的纸（5 mm x 35 mm）放在双面胶带的中心。将胶带贴在载玻片上，用纸盖住两个孔和纳米图案。
  3. 使用干净的刀片切除纸张（图1A）。
  4. 将玻璃盖玻片放在双面胶带的顶部，并使用移液器吸头摩擦盖玻片以形成微流体室（图1A）。
  5. 将组装好的流通池放在两个显微镜载玻片之间并夹住它们。
  6. 将流通池在120°C真空烘箱中烘烤45分钟。
  7. 使用热胶枪将用于基于芯片的分析的流体连接器（Nanoport）（参见 材料表）连接到每个开孔，并连接两条鲁尔锁管线。
  8. 连接含有 3 mL 去离子水的鲁尔锁注射器并清洗腔室。
  9. 用 3 mL 脂质缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0 和 100 mM NaCl） 通过 滴滴连接洗涤腔室。
    注意: 逐滴连接将所有注射器连接到流通池，以避免将气泡注入腔室。
  10. 将脂质缓冲液中的 1 mL 0.04x 生物素化脂质分两次注射到腔室中，每次注射孵育 5 分钟。
    注:1x生物素化脂质原液的制备在先前发表的报告34中进行了描述。
  11. 用 3 mL 脂质缓冲液洗涤腔室并孵育 20 分钟，使脂质双层在载玻片表面上成熟。
  12. 加入 1 mL BSA 缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH 8.0、50 mM NaCl、2 mM MgCl2 和 0.2 mg/mL BSA）并孵育 5 分钟以钝化载玻片表面。
    注意:此步骤可以减少蛋白质与载玻片表面的非特异性结合。
  13. 将 0.025 mg/mL 链霉亲和素注射到 1 mL BSA 缓冲液中，两次注射，每次注射孵育 10 分钟。
  14. 用 3 mL BSA 缓冲液洗去残留的链霉亲和素。
  15. 将 ~300 pM （30 μL） 生物素化的 lambda 噬菌体 DNA 在 1 mL BSA 缓冲液中注入腔室，两次注射，每次注射孵育 10 分钟。
    注:生物素化λ DNA的制备在先前发表的报告34中进行了描述。

2. 将流通池连接到微流控系统并将其加载到显微镜上

  1. 制备Abo1成像缓冲液（50mM的Tris-HCl，pH 8.0,100mM的NaCl，1mM的DTT，1mM的ATP，2mM的MgCl 2,1.6%葡萄糖和0.1x的gloxy，参见材料表）。
    注意:Gloxy 是一种除氧系统，可减少荧光染料的光漂白。用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制备100x光氧原液的方法见参考文献35。
  2. 将含有 10 mL 成像缓冲液的注射器连接到注射泵，并去除微流控系统中所有管路中的气泡。
  3. 通过滴对滴连接将制备的流通池与微流体系统耦合，以避免气泡注入流通池（图1B）。
  4. 组装流通池和流通池支架，并将组件安装在定制的TIRF显微镜上（图1C）。
    注意:将流通池置于显微镜下时，请小心设置物镜的高度。流通池不得接触物镜。这会损坏镜头。
  5. 在流通池的中心滴上与油相匹配的指数，并在油滴上放置一个定制的鸽子棱镜（见 材料表）。

3. 使用 DNA 幕通过 Abo1 组装组蛋白

  1. 将 5 nM 的 Abo1 和 12.5 nM 的 Cy5 标记的 H3-H4 组蛋白二聚体 （Cy5-H3-H4）（参见 材料表）混合在 150 μL 成像缓冲液中。所有蛋白质均根据先前发表的报告17制备。
  2. 将混合物在冰上孵育15分钟。
    注意:为避免Cy5的光漂白，必须在黑暗中孵育。
  3. 通过 100 μL 样品环在成像缓冲液中注入 ~20 pM （2 μL） YOYO-1 染料以染色 lambda DNA 分子。
  4. 运行成像软件（见 材料表）并打开 488 nm 激光器以检查 DNA 幕是否形成良好。
    注意:如果DNA幕形成良好，则用YOYO-1染色的DNA分子在存在流动的情况下显示为屏障处的对齐线。当水流关闭时，拉伸的管线会反冲并扩散到远离屏障的地方。
  5. 进样 2 mL 高盐缓冲液（200 mM NaCl 和 40 mM MgCl2）以消除 DNA 中的 YOYO-1 染料。
  6. 去除YOYO-1染料后，注入预孵育的蛋白质样品。
  7. 当蛋白质到达 DNA 幕时，关闭注射泵，关闭截止阀，孵育 15 分钟，通过 Abo1 加载组蛋白。
  8. 洗出未结合的Abo1和组蛋白5分钟。
  9. 打开截止阀并恢复流量注入。
  10. 打开 637 nm 激光器，在缓冲液流开启时对荧光蛋白进行成像。
  11. 瞬时关闭缓冲液流以检查组蛋白是否加载到DNA上（图2C）。
  12. 使用图像采集程序收集DNA窗帘图像（参见 材料表）。
    注意:当缓冲液流动暂时停止时，DNA从全内反射的倏逝场中回退，与DNA结合的荧光标记蛋白质消失。

4. 数据分析

  1. 将图像采集程序拍摄的图像转换为TIFF格式作为图像序列。
    注:所有数据均使用参考文献20 中所述的图像 J （NIH） 进行分析。
  2. 从图像序列中挑选一个DNA分子并绘制一个kymograph。
    注意:kymograph可以显示与单个DNA分子结合的每种组蛋白的荧光强度随时间的变化。
  3. 从kymograph创建荧光强度曲线，并将其与多个高斯函数拟合。
  4. 从荧光强度分布中收集峰的中心坐标。在该步骤中，可以获得组蛋白荧光的最小强度。
  5. 将从剖面收集的所有峰强度除以最小强度。在此步骤中估计与DNA结合的H3-H4二聚体的数量。
  6. 对其他 DNA 分子执行步骤 4.2-4.5。
  7. 为 1 kbp bin 大小的 H3-H4 二聚体的结合分布创建直方图。分析的分子数量至少为 300 个。

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结果

本工作描述了用于DNA幕式测定的流通池制备程序（图1A）。DNA Curtain 测定有助于 Abo1 在 DNA 上研究组蛋白 H3-H4 二聚体组装。首先，通过用嵌入染料YOYO-1染色DNA分子来检查DNA窗帘的形成。绿线以平行阵列显示，表明 YOYO-1 插入到 DNA 分子中，这些分子在流体动力流下在扩散屏障处排列均匀和拉伸（图 2A）。为了排除 YOYO-1 阻碍 DNA 和组蛋白相互作用的可能性...

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讨论

作为一种单分子成像技术，DNA帘已被广泛用于探测DNA代谢反应43。DNA 帷幕是一种混合系统，将脂质流动性、微流控和 TIRFM 连接起来。与其他单分子技术不同，DNA curtain 能够实现蛋白质-DNA 相互作用的高通量实时可视化。因此，DNA帘技术适用于探究分子相互作用背后的机制，包括序列特异性关联、蛋白质与DNA一起运动以及DNA上的蛋白质-蛋白质碰撞17,20,26

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者感谢韩国科学技术院的Ji-Joon Song教授、Carol Cho博士和Juwon Jang博士对Abo1和Cy5-H3-H4的大力支持。这项工作得到了国家研究基金会资助（NRF-2020R1A2B5B01001792），蔚山国立科学技术研究所校内研究基金（1.210115.01）和基础科学研究所（IBS-R022-D1）的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL luer-lock syringeBecktonDickinson301321
1' x 3' fused-silca slide glassG. Finkenbeiner1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PEAvanti870273This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PEAvanti880130This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302832
6-way sample injection valveIDEXMX series II
950K PMMAAll-resist671.04
AcetoneSAMCHUNA1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA2383
Aluminum (Al)TASCO, South KoreaLT50AI414Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
AmpicillinMbcellMB-A4128Antibiotics
AZ 300 MIF developerMerck10454110521Used for removing aluminum
BladeDORCODN5212 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3)UNIONGASPurity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
CatalaseSigmaC40-1gThis is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2)UNIONGASPurity: >99.99%
Clear double-sided tape3M313770
D-(+)-glucoseSigmaG7528
DC sputterSoronaSRM-120Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bitEurotoolDIB-211.00Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co. Ltd.1906-106Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
DrillDremelDremel 3000Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean LithographyNanobeam Ltd.NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)SigmaEDS-1KG
Fingertight fittingsIDEXF-300It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nutIDEXP-235It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOLLabogeneHC3110Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidaseSigmaG2133-50KUThis is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochlorideAcros Organics364790025
Hamilton syringeHamilton Company80065This syringe is used for sample injection
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrerCorningPC-420D
Hydrochloric acidSigmaH1759Used for Tris-HCl
Index matching oilZEISS444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etchingTop Technology Ltd.FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Glentham Life SciencesGC6586-100gUsed for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNANEBN0311
LB brothBD difco244610Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32IDEXP-659This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydratefisher bioreagentsBP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK)KAYAKU ADVANCED MATERIALSUsed for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslipMARIENFELD10114222 x 50 mm (No. 1)
Microscope slideDURAN GROUPDU.2355013Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
NanoportIDEXN-333-01
Objective lensNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WIImmersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC6060-03Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
PFA tubing naturalIDEX1512LIt is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche11359061001Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High ResolutionCytiva17-0584-01Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valveIDEXP-732
Sodium acetateSigma791741
Sodium chloride (NaCl)SigmaS3014
Sodium hydroxide (NaOH)Sigmas5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDaSpectrum laboratories132660
StreptavidinThermo Fisher ScientificS888
Sulfur tetralfluoride (SF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
Syringe pumpKD Scientific78-8210
Tetrafluoromethane (CF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
TritonX-100SigmaT9284
Trizma baseSigmaT1503Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715Used for FPLC (ion exchange)
Union assemblyIDEXP-760This connects tubings
UreaSigmaU5378
Vacuum ovenJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME)SigmaM6250

参考文献

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