JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.

Özet

Kromatin, ökaryotik DNA'yı paketleyen daha yüksek dereceli bir yapıdır. Kromatin, hücre döngüsü fazına göre ve çevresel uyaranlara yanıt olarak dinamik değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler genomik bütünlük, epigenetik düzenleme ve replikasyon, transkripsiyon ve onarım gibi DNA metabolik reaksiyonları için gereklidir. Kromatin düzeneği, kromatin dinamiği için çok önemlidir ve histon şaperonları tarafından katalize edilir. Kapsamlı çalışmalara rağmen, histon şaperonlarının kromatin montajını mümkün kıldığı mekanizmalar belirsizliğini koruyor. Ayrıca, histon şaperonları tarafından düzenlenen nükleozomların küresel özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu sorunları ele almak için, bu çalışma, histon şaperonları tarafından nükleozom düzeneğinin moleküler ayrıntılarının araştırılmasını kolaylaştıran DNA perdesi adı verilen benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniğini açıklamaktadır. DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için evrensel bir platform sağlamak üzere lipid akışkanlığını, mikroakışkanları ve toplam iç yansıma floresan mikroskobunu (TIRFM) birleştiren hibrit bir tekniktir. DNA perdesi kullanılarak, Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA + ATPaz olan Abo1'in histon şaperon fonksiyonu araştırılır ve Abo1'in histon düzeneğinin altında yatan moleküler mekanizma ortaya çıkarılır. DNA perdesi, kromatin dinamiklerini incelemek için benzersiz bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Ökaryotik DNA, kromatin 1,2 olarak bilinen daha yüksek dereceli bir yapıda paketlenir. Nükleozom, oktamerik çekirdek histonları 3,4 etrafına sarılmış yaklaşık 147 bp DNA'dan oluşan kromatinin temel birimidir. Kromatin, ökaryotik hücrelerde kritik bir rol oynar; örneğin, kompakt yapı DNA'yı endojen faktörlerden ve dışsal tehditlerdenkorur 5. Kromatin yapısı, hücre siklus fazına ve çevresel uyaranlara göre dinamik olarak değişir ve bu değişiklikler, replikasyon, transkripsiyon ve onarım gibi DNA işlemleri sırasında protein erişimini kontrol eder6. Kromatin dinamiği, genomik stabilite ve epigenetik bilgi için de önemlidir.

Kromatin, histon kuyruğu modifikasyonları ve kromatin yeniden şekillendiriciler, policomb grubu proteinleri ve histon şaperonları7 gibi kromatin düzenleyicileri dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından dinamik olarak düzenlenir. Histon şaperonları, çekirdek histonlarınınbirikmesi veya ayrılması yoluyla nükleozomların birleştirilmesini ve sökülmesini koordine eder 8,9. Histon şaperonlarındaki kusurlar genom kararsızlığına neden olur ve gelişimsel bozukluklara ve kansere neden olur 9,10. Çeşitli histon şaperonları, nükleozomları 9,11,12,13 birleştirmek veya sökmek için ATP hidrolizi gibi kimyasal enerji tüketimine ihtiyaç duymaz. Son zamanlarda araştırmacılar, bromodomain içeren AAA + (çeşitli hücresel aktivitelerle ilişkili ATPaz) ATPazların, histon şaperonları 14,15,16,17 olarak kromatin dinamiklerinde rol oynadığını bildirdi. İnsan ATAD2 (ATPase ailesi AAA alanı içeren protein 2), gen ekspresyonunu geliştirmek için kromatin erişilebilirliğini teşvikeder 18. Transkripsiyonel bir yardımcı düzenleyici olarak ATAD2, onkojenik transkripsiyonel faktörlerin14 kromatinini düzenler ve ATAD2'nin aşırı ekspresyonu birçok kanser türünde kötü prognozile ilişkilidir 19. ATAD2'nin Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homoloğu olan Yta7, kromatin15'teki nükleozom yoğunluğunu azaltır. Buna karşılık, ATAD2'nin Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homoloğu olan Abo1, nükleozom yoğunluğunuarttırır 16. Benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniği olan DNA perdesi kullanılarak, Abo1'in nükleozom montajına veya sökülmesine katkıda bulunup bulunmadığıele alınmaktadır 17,20.

Geleneksel olarak, biyomoleküllerin biyokimyasal özellikleri, çok sayıda molekülün incelendiği elektroforetik hareketlilik kaydırma testi (EMSA) veya ko-immünopresipitasyon (co-IP) gibi toplu deneylerle incelenmiştir ve ortalama özellikleri karakterize edilmiştir21,22. Toplu deneylerde, moleküler alt durumlar, topluluk ortalaması etkisi ile örtülür ve biyomoleküler etkileşimlerin araştırılması kısıtlanır. Buna karşılık, tek moleküllü teknikler, toplu deneylerin sınırlamalarını ortadan kaldırır ve biyomoleküler etkileşimlerin ayrıntılı karakterizasyonunu sağlar. Özellikle, tek moleküllü görüntüleme teknikleri, DNA-protein ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır23. Böyle bir teknik, mikroakışkanlara ve toplam iç yansıma floresan mikroskobuna (TIRFM) dayanan benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniği olan DNA perdesidir24,25. Bir DNA perdesinde, yüzlerce ayrı DNA molekülü, lipid akışkanlığı nedeniyle DNA moleküllerinin iki boyutlu hareketine izin veren lipid çift tabakasına bağlanır. Hidrodinamik akış uygulandığında, DNA molekülleri çift tabaka üzerindeki akış boyunca hareket eder ve hizalandıkları ve gerildikleri bir difüzyon bariyerinde sıkışırlar. DNA, interkalasyon ajanları ile boyanırken, floresan etiketli proteinler enjekte edilir ve TIRFM, protein-DNA etkileşimlerini tek molekül seviyesinde gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için kullanılır23. DNA perde platformu, difüzyon, translokasyon ve çarpışma gibi protein hareketlerinin gözlemlenmesini kolaylaştırır 26,27,28. Ayrıca, DNA perdesi, tanımlanmış konumlar, yönelimler ve topolojiler ile DNA üzerinde protein haritalaması için kullanılabilir veya protein ve nükleik asitlerin faz ayrımı çalışmasına uygulanabilir 29,30,31.

Bu çalışmada, DNA perdesi tekniği, spesifik proteinlerin doğrudan görselleştirilmesi yoluyla şaperonların işlevine kanıt sağlamak için kullanılmıştır. Ayrıca, DNA perdesi yüksek verimli bir platform olduğundan, istatistiksel güvenilirlik için yeterli miktarda veri toplamayı kolaylaştırır. Burada, S. pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz Abo1'in moleküler rolünü araştırmak için DNA perdesi testinin nasıl yapılacağı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Akış hücresinin hazırlanması

  1. Daha önce yayınlanmış rapor25'i izleyerek nano hendek desenleri içeren temizlenmiş kaynaşmış bir silika lam hazırlayın.
    1. Elmas kaplı bir matkap ucu kullanarak temizlenmiş erimiş bir silika slaytta (Şekil 1A) 1 mm çapında iki delik açın (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. 10 mTorr argon gazı ile DC püskürtme32 ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak slayt üzerine 250 nm kalın alüminyum (Al) biriktirin.
    3. 310 nm kalınlığında %4 950K poli(metil metakrilat) (PMMA) (Malzeme Tablosuna bakınız) tabakasını 4.000 rpm'de 1 dakika döndürün ve 180 °C'de sıcak bir plaka üzerinde 3 dakika pişirin.
    4. 80 kV'da 0.724 nA akımla elektron ışını (ebeam) litografisi33 kullanarak iki delik arasındaki PMMA tabakası üzerindeki nano hendek desenlerini çizin.
      NOT: Nano hendek desenlerinin mimarisi ve boyutları Şekil 1A'da gösterilmiştir.
    5. Slaytları gelişmekte olan çözeltiye (1:3 oranında metil izobütil keton ve izopropanol, bkz. Malzeme Tablosu) 2 dakika bekleterek ebeam'e maruz kalan PMMA'yı çıkarın.
    6. Klor (Cl2) ve bor triklorür (BCl 3) gazları kullanılarak endüktif olarak eşleştirilmiş plazma-reaktif iyon aşındırma (ICP-RIE) ile aşındırma Al katmanları.
      NOT: Bu iki gaz, ışına maruz kalan alanlardan Al'ı çıkarabilir.
    7. Kükürt tetraflorür (SF4), tetraflorometan (CF4) ve oksijen (O2) gazları kullanarak slaytlar üzerinde nano hendekler açın (bkz.
    8. Slaytları 10 dakika boyunca Al etchant'ta (AZ 300 MIF geliştirici, Malzeme Tablosuna bakın) bekleterek kalan Al katmanını çıkarın.
    9. İmalattan sonra, slaytları deiyonize su ile durulayın ve banyo tipi bir sonikatör kullanarak 30 dakika boyunca asetonda sonikat yapın.
    10. Slaytları %2 Hellmanex III solüsyonunda (Malzeme Tablosuna bakınız) manyetik karıştırma ile en az 1 gün temizleyin.
    11. Slaytları asetonda 30 dakika ve 1 M NaOH'de art arda 30 dakika sonikleştirin.
    12. Slaytları deiyonize suyla durulayın ve nitrojen (N2) gazı ile kurulayın.
  2. Çift taraflı bandın ortasına temiz bir kağıt (5 mm x 35 mm) koyun. İki deliği ve nano desenleri kağıtla kapatmak için bandı slaydın üzerine yapıştırın.
  3. Temiz bir bıçak kullanarak kağıdı kesin (Şekil 1A).
  4. Çift taraflı bandın üzerine bir cam lamel koyun ve mikroakışkan bir oda oluşturmak için bir pipet ucu kullanarak lamel ovalayın (Şekil 1A).
  5. Birleştirilmiş akış hücresini iki mikroskop lamı arasına yerleştirin ve klipsleyin.
  6. Akış hücresini 120 °C vakumlu fırında 45 dakika pişirin.
  7. Çip bazlı analizler için sıvı konektörünü (Nanoport) (Malzeme Tablosuna bakın) bir sıcak tutkal tabancası kullanarak her bir açık deliğe takın ve iki sıra Luer kilit borusunu bağlayın.
  8. 3 mL deiyonize su içeren bir Luer kilit şırıngası bağlayın ve hazneyi yıkayın.
  9. Odayı damla damla bağlantı yoluyla 3 mL lipid tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 100 mM NaCl) ile yıkayın.
    NOT: Damla damla bağlantı, hazneye hava kabarcıkları enjekte edilmesini önlemek için tüm şırıngaları akış hücresine bağlar.
  10. Lipid tamponunda 1 mL 0.04x biyotinile lipid lipid enjekte edin, atış başına 5 dakikalık inkübasyon ile iki atışta odaya enjekte edin.
    NOT: 1x biyotinile lipid stoğunun hazırlanması daha önce yayınlanmış bir rapordaaçıklanmıştır 34.
  11. Hazneyi 3 mL lipid tamponu ile yıkayın ve lipid çift tabakasının slayt yüzeyinde olgunlaşması için 20 dakika inkübe edin.
  12. 1 mL BSA tamponu (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 2 mMMgCl2 ve 0.2 mg/mL BSA) ekleyin ve slayt yüzeyini pasifleştirmek için 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu adım, proteinlerin slayt yüzeyine spesifik olmayan bağlanmasını azaltabilir.
  13. İki atış ve atış başına 10 dakika inkübasyon ile 1 mL BSA tamponuna 0.025 mg / mL streptavidin enjekte edin.
  14. Kalan streptavidini 3 mL BSA tamponu ile yıkayın.
  15. 1 mL BSA tamponunda ~ 300 pM (30 μL) biyotinile lambda faj DNA'sını iki atış ve atış başına 10 dakika inkübasyon ile odaya enjekte edin.
    NOT: Biyotinile lambda DNA'sının hazırlanması daha önce yayınlanmış bir rapordaaçıklanmıştır 34.

2. Akış hücresinin mikroakışkan sisteme bağlanması ve mikroskoba yüklenmesi

  1. Abo1 görüntüleme tamponu hazırlayın (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2,% 1.6 glikoz ve 0.1x gloksi, Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Gloxy, floresan boyaların fotoağartmasını azaltan bir oksijen temizleme sistemidir. Glikoz oksidaz ve katalaz ile 100x gloksi stoğunun hazırlanması Referans35'te açıklanmıştır.
  2. 10 mL görüntüleme tamponu içeren bir şırıngayı bir şırınga pompasına bağlayın ve mikroakışkan sistemdeki tüm boru hatlarındaki kabarcıkları çıkarın.
  3. Akış hücresine kabarcık enjeksiyonunu önlemek için hazırlanan akış hücresini damladan damlaya bağlantı yoluyla mikroakışkan sistemle birleştirin (Şekil 1B).
  4. Akış hücresini ve akış hücresi tutucularını birleştirin ve düzeneği özel yapım bir TIRF mikroskobuna monte edin (Şekil 1C).
    DİKKAT: Akış hücresi mikroskop altına alındığında, objektif merceğin yüksekliğini dikkatlice ayarlayın. Akış hücresi objektif merceğe temas etmemelidir. Bu, lense zarar verebilir.
  5. Akış hücresinin ortasına indeks eşleşen yağı damlatın ve yağ damlasının üzerine özel yapım bir güvercin prizması (Malzeme Tablosuna bakın) koyun.

3. DNA perdesi kullanılarak Abo1 tarafından histon montajı

  1. 150 μL görüntüleme tamponunda 5 nM Abo1 ve 12.5 nM Cy5 etiketli H3-H4 histon dimer (Cy5-H3-H4) (Malzeme Tablosuna bakınız) karıştırın. Tüm proteinler daha önce yayınlanmışrapor 17'ye göre hazırlanmıştır.
  2. Karışımı buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Cy5'in foto ağartılmasını önlemek için, inkübasyon karanlıkta yapılmalıdır.
  3. Lambda DNA moleküllerini boyamak için 100 μL'lik bir numune döngüsünden görüntüleme tamponuna ~20 pM (2 μL) YOYO-1 boya enjekte edin.
  4. Görüntüleme yazılımını çalıştırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve DNA perdelerinin iyi biçimlendirilip biçimlendirilmediğini kontrol etmek için 488 nm lazeri açın.
    NOT: DNA perdeleri iyi biçimlendirilmişse, YOYO-1 ile boyanan DNA molekülleri, akış varlığında bir bariyerde hizalanmış çizgiler olarak gösterilir. Gerilmiş hatlar geri teper ve akış kapatıldığında bariyerden uzaklaşır.
  5. YOYO-1 boyasını DNA'dan çıkarmak için 2 mL yüksek tuz tamponu (200 mM NaCl ve 40 mM MgCl2) enjekte edin.
  6. YOYO-1 boyası çıkarıldıktan sonra, önceden inkübe edilmiş protein örneğini enjekte edin.
  7. Proteinler DNA perdesine ulaştığında, şırınga pompasını kapatın, kapatma vanasını kapatın ve Abo1 ile histon yüklemesi için 15 dakika inkübe edin.
  8. Bağlanmamış Abo1 ve histon proteinlerini 5 dakika boyunca yıkayın.
  9. Kapatma vanasını açın ve akış enjeksiyonuna devam edin.
  10. 637 nm lazeri açın ve tampon akışı açıkken floresan proteinleri görüntüleyin.
  11. Histon proteinlerinin DNA'ya yüklenip yüklenmediğini kontrol etmek için tampon akışını geçici olarak kapatın (Şekil 2C).
  12. Bir görüntü elde etme programı ile DNA perdesi görüntülerini toplayın (bkz.
    NOT: Tampon akışı geçici olarak durduğunda, DNA toplam iç yansımanın geçici alanından geri çekilir ve DNA'ya bağlı floresan etiketli proteinler kaybolur.

4. Veri analizi

  1. Görüntü alma programı tarafından çekilen görüntüleri, görüntü dizileri olarak TIFF formatına dönüştürün.
    NOT: Tüm veriler, Referans20'de açıklandığı gibi Resim J (NIH) kullanılarak analiz edilmiştir.
  2. Görüntü dizilerinden tek bir DNA molekülü seçin ve bir kimografi çizin.
    NOT: Kimografi, zamanın bir fonksiyonu olarak tek bir DNA molekülüne bağlı her histon proteininin floresan yoğunluğundaki değişimi gösterebilir.
  3. Kimografiden floresan yoğunluk profilini oluşturun ve birden fazla Gauss işleviyle eşleştirin.
  4. Floresan yoğunluk profilinden tepe noktalarının merkez koordinatlarını toplayın. Bu adımda, minimum histon floresan yoğunluğu elde edilebilir.
  5. Profillerden toplanan tüm tepe yoğunluklarını minimum yoğunluğa bölün. Bu adımda DNA'ya bağlı H3-H4 dimerlerinin sayısı tahmin edilir.
  6. Diğer DNA molekülleri için 4.2-4.5 adımlarını uygulayın.
  7. 1 kbp bölme boyutuna sahip H3-H4 dimerlerinin bağlanma dağılımı için bir histogram oluşturun. Analiz edilen molekül sayısı en az 300'dür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu çalışma, DNA perdesi testi için akış hücresi hazırlama prosedürünü açıklar (Şekil 1A). DNA perdesi testi, Abo1 ile DNA üzerinde histon H3-H4 dimer düzeneğinin incelenmesini kolaylaştırdı. İlk olarak, DNA molekülleri interkalasyon boyası olan YOYO-1 ile boyanarak DNA perdesi oluşumu kontrol edildi. Yeşil çizgiler paralel dizilerde gösterildi, bu da YOYO-1'in hidrodinamik akış altında bir difüzyon bariyerinde iyi hizalanmış ve gerilmiş DNA moleküllerine in...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olarak DNA perdesi, DNA metabolik reaksiyonlarını araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır43. DNA perdesi, lipid akışkanlığını, mikroakışkanları ve TIRFM'yi birleştiren hibrit bir sistemdir. Diğer tek moleküllü tekniklerin aksine, DNA perdesi, protein-DNA etkileşimlerinin yüksek verimli gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, DNA perdesi tekniği, diziye özgü ilişki, DNA ile birlikte protein hareketi v...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Güney Kore'deki KAIST'ten Profesör Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D. ve Juwon Jang, Ph.D.'nin Abo1 ve Cy5-H3-H4'e verdiği nazik desteği takdir ediyor. Bu çalışma, Ulusal Araştırma Vakfı Hibesi (NRF-2020R1A2B5B01001792), Ulsan Ulusal Bilim ve Teknoloji Enstitüsü'nün okul içi araştırma fonu (1.210115.01) ve Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R022-D1) tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL luer-lock syringeBecktonDickinson301321
1' x 3' fused-silca slide glassG. Finkenbeiner1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PEAvanti870273This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PEAvanti880130This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302832
6-way sample injection valveIDEXMX series II
950K PMMAAll-resist671.04
AcetoneSAMCHUNA1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA2383
Aluminum (Al)TASCO, South KoreaLT50AI414Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
AmpicillinMbcellMB-A4128Antibiotics
AZ 300 MIF developerMerck10454110521Used for removing aluminum
BladeDORCODN5212 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3)UNIONGASPurity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
CatalaseSigmaC40-1gThis is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2)UNIONGASPurity: >99.99%
Clear double-sided tape3M313770
D-(+)-glucoseSigmaG7528
DC sputterSoronaSRM-120Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bitEurotoolDIB-211.00Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co. Ltd.1906-106Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
DrillDremelDremel 3000Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean LithographyNanobeam Ltd.NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)SigmaEDS-1KG
Fingertight fittingsIDEXF-300It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nutIDEXP-235It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOLLabogeneHC3110Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidaseSigmaG2133-50KUThis is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochlorideAcros Organics364790025
Hamilton syringeHamilton Company80065This syringe is used for sample injection
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrerCorningPC-420D
Hydrochloric acidSigmaH1759Used for Tris-HCl
Index matching oilZEISS444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etchingTop Technology Ltd.FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Glentham Life SciencesGC6586-100gUsed for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNANEBN0311
LB brothBD difco244610Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32IDEXP-659This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydratefisher bioreagentsBP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK)KAYAKU ADVANCED MATERIALSUsed for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslipMARIENFELD10114222 x 50 mm (No. 1)
Microscope slideDURAN GROUPDU.2355013Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
NanoportIDEXN-333-01
Objective lensNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WIImmersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC6060-03Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
PFA tubing naturalIDEX1512LIt is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche11359061001Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High ResolutionCytiva17-0584-01Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valveIDEXP-732
Sodium acetateSigma791741
Sodium chloride (NaCl)SigmaS3014
Sodium hydroxide (NaOH)Sigmas5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDaSpectrum laboratories132660
StreptavidinThermo Fisher ScientificS888
Sulfur tetralfluoride (SF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
Syringe pumpKD Scientific78-8210
Tetrafluoromethane (CF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
TritonX-100SigmaT9284
Trizma baseSigmaT1503Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715Used for FPLC (ion exchange)
Union assemblyIDEXP-760This connects tubings
UreaSigmaU5378
Vacuum ovenJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME)SigmaM6250

Referanslar

  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
  3. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  4. McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
  5. Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622(2013).
  6. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  7. Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658(2013).
  8. Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
  9. Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
  10. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  11. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  12. Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
  13. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  14. Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
  15. Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
  16. Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
  17. Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764(2019).
  18. Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
  19. Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
  20. Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
  21. Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
  22. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
  23. Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
  24. Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
  25. Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
  26. Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
  27. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
  28. Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
  29. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  30. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
  31. Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
  32. Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
  33. Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001(2009).
  34. Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320(2020).
  35. Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  36. Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13(2010).
  37. Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
  38. Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
  39. Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
  40. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  41. Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
  42. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  43. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  44. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  45. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  46. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  47. Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler MekanizmaHiston D zene iDNA Perde Tekni iKromatinkaryotik DNADinamik De i ikliklerH cre D ng s Evresievresel UyaranlarGenomik B t nl kEpigenetik Reg lasyonDNA Metabolik ReaksiyonlarReplikasyonTranskripsiyonOnar mHiston aperonlarN kleozomlarTek Molek ll G r nt leme Tekni iDNA PerdesiLipid Ak kanlMikroak kanlarToplam Yans ma Floresan Mikroskobu TIRFMProtein DNA Etkile imleriAbo1Schizosaccharomyces Pombe Bromodomain i eren AAA ATPaz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır