JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول نهجا منهجيا خطوة بخطوة لتعريض خطوط الخلايا النقيلية العظمية وأورام العظام الأولية للعلاج الضوئي الديناميكي بوساطة حمض 5-أمينوليفولينيك (PDT). يتم أيضا تحليل التأثيرات على إمكانات هجرة الخلايا / الغزو ، والجدوى ، وموت الخلايا المبرمج ، وإمكانية الشيخوخة بعد التعرض للقضبان الصيفية.

Abstract

ترتبط النقائل العظمية بسوء التشخيص وانخفاض نوعية الحياة للمرضى المصابين. يظهر العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) كعلاج غير جراحي يمكنه استهداف آفات العظام النقيلية الموضعية. تقدم هذه الورقة طريقة في المختبر لدراسة تأثير PDT في خطوط الخلايا الملتصقة. تحقيقا لهذه الغاية ، نعرض نهجا خطوة بخطوة لإخضاع كل من خطوط الخلايا السرطانية الأولية (ورم عظم الخلية العملاقة) وخطوط الخلايا السرطانية النقيلية للعظام البشرية (المشتقة من سرطان الثدي الأقنوي الغازي الأولي وسرطان الكلى) إلى 5-حمض أمينوليفولينيك (5-ALA) PDT بوساطة 5-أمينوليفولينيك.

بعد 24 ساعة بعد تشعيع 5-ALA-PDT (الطول الموجي للضوء الأزرق 436 نانومتر) ، تم تقييم التأثير العلاجي من حيث إمكانات هجرة الخلايا ، والجدوى ، وخصائص موت الخلايا المبرمج ، وتوقف النمو الخلوي (الشيخوخة). بعد تشعيع 5-ALA-PDT ، تستجيب خطوط الخلايا المشتقة من العضلات والعظام بشكل مختلف لنفس الجرعات والتعرض ل PDT. اعتمادا على مدى الضرر الخلوي الناجم عن التعرض PDT ، لوحظ مصيران مختلفان للخلايا - موت الخلايا المبرمج والشيخوخة. توفر الحساسية المتغيرة لعلاج PDT بين خطوط خلايا سرطان العظام المختلفة معلومات مفيدة لاختيار إعدادات PDT أكثر ملاءمة في الإعدادات السريرية. تم تصميم هذا البروتوكول لتجسيد استخدام PDT في سياق خطوط الخلايا الورمية العضلية الهيكلية. يمكن تعديله للتحقيق في التأثير العلاجي ل PDT على خطوط الخلايا السرطانية المختلفة والعديد من المحسسات الضوئية ومصادر الضوء.

Introduction

لا تزال الخيارات العلاجية لنقائل العظام محدودة وصعبة على الرغم من التطورات المستمرة في علاج الأورام. الطريقة القياسية الحالية هي العلاج الإشعاعي ، والذي يرتبط بمضاعفات مثل الحمامي الموضعية ، وسمية الأعضاء الداخلية1 ، والكسور غير الكافية2. هناك حاجة إلى علاجات بديلة مضادة للأورام حيث يعاني المرضى الذين يعانون من نقائل العظام غالبا من الألم وفرط كالسيوم الدم والأعراض العصبية التي تؤدي إلى ضعف الحركة وانخفاض نوعية الحياة3. تظهر النتائج الحديثة أن PDT يوفر خيارا واعدا وبديلا للعلاج المضاد للأورام لاستهداف آفات العظام بشكل مباشر ، والتي يمكن استخدامها بمفردها أو بشكل داعم للعلاج الإشعاعي4.

تعتمد آلية PDT بشكل أساسي على نقل الطاقة من مركب حساس للضوء (محسس للضوء) إلى أكسجين الأنسجة. يعمل هذا المحسس الضوئي بشكل مشابه للمكثف على مستوى التنظير النانوي. يمكنه تخزين الطاقة في حالة الأرض عند تعريضه للإشعاع بطول موجي مناسب من الضوء ويطلق الطاقة المخزنة عندما يعود من حالة إثارة إلى الحالة الأرضيةالأصلية 5. تؤدي الطاقة المنبعثة إلى تفاعلين كيميائيين ضوئيين: أحدهما هو تحويل الأكسجين إلى جذور الأكسجين التفاعلية عن طريق نقل الهيدروجين أو الإلكترون. والثاني هو إنتاج جزيئات الأكسجين المفردة عن طريق نقل الطاقة الأفقية من ركيزة المحسس الضوئي إلى جزيئات الأكسجين الثلاثية المحلية6. جذور الأكسجين التفاعلية وجزيئات الأكسجين المفردة لها تأثيرات شديدة السمية للخلايا على الخلايا السرطانية المحلية وتحفز انسداد الأوعية الدموية والاستجابة الالتهابية الموضعية عن طريق موت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية للأوعية الدموية السرطانية7.

المحسسات الضوئية التقليدية هي مشتقات من عائلة البورفيرين مثل الهيماتوبورفيرين والبنزوبورفيرين8. يمكن أن يؤدي تطبيق مواد المحسسة للضوء ذات التقارب الأكبر مع أنسجة الورم إلى زيادة انتقائية PDT9 y. على وجه الخصوص ، يمكن أن يتراكم 5-ALA ، وهو مقدمة التخليق الحيوي للبروتوبورفيرين التاسع ، في الخلايا السرطانية مثل التقرن السفعي وسرطان الخلايا القاعدية وورم المثانة وسرطان الجهاز الهضمي5. يمكن أن تختلف طرق التوصيل المختلفة باستخدام 5-ALA أيضا في كفاءة PDT فيما يتعلق بتوطين الورم. وهكذا ، أصبح الاستخدام الموضعي ل 5-ALA مع تطبيق PDT هو الخط الأول للعلاج الجلدي ضد التقران السفعي10. تشير النتائج الحديثة للنقائل العظمية لخطوط خلايا سرطان الثدي الأقنية الغازية إلى احتمال تثبيط هجرة الخلايا وتحريض موت الخلايا المبرمج بعد التعرض ل PDT مع 5-ALA11. ومع ذلك ، فإن استخدام PDT في الأنسجة البشرية تحت اللفافة مثل أنسجة العظام لا يزال في مرحلته السريرية إلى المرحلة السريرية التجريبية حيث تحتاج الفعالية إلى تحسين. تظهر تطبيقات الجسيمات النانوية مع العلاج القائم على الضوء بالفعل تأثيرا كبيرا في طب الأسنان12. وبالتالي ، من المحتمل أن يؤدي الجمع بين استخدام الجسيمات النانوية مع PDT إلى توسيع نطاق تطبيقها نحو أورام العظام.

يصف البروتوكول التالي كيفية تحضير كلتا الخليتين الناشئتين من أورام العظام الأولية ونقائل العظام لخطوط الخلايا وإخضاعها ل PDT بوساطة 5-ALA للتعرض لفترة زمنية محددة مسبقا. يتم أيضا تضمين وصف مفصل لكيفية أداء وتقييم إمكانات الهجرة الخلوية والحيوية والشيخوخة بعد تشعيع 5-ALA-PDT. توفر الإرشادات خطوة بخطوة نهجا مباشرا وموجزا للحصول على بيانات موثوقة وقابلة للتكرار. تتم أيضا مناقشة المزايا والقيود والآفاق المستقبلية لنهج PDT لآفات الأورام العظمية.

Protocol

تم استخدام ثلاثة أنواع مختلفة من خطوط الخلايا: "MAM" - خط خلوي ينشأ من النقائل العظمية لسرطان الخلايا الكلوية ، و "MAC" - نقائل العظام لسرطان الثدي الأقنية الغازية ، و "17-1012" - ورم خلية عملاقة في العظام. تم استخدام الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من النخاع (MSCs) كمجموعة تحكم. تم الحصول على الموافقة المؤسسية والأخلاقية قبل بدء الدراسة (رقم المشروع: 008/2014BO2 لخطوط الخلايا السرطانية ورقم المشروع: 401/2013 BO2 للخلايا السرطانية).

1. زراعة الخلايا

ملاحظة: يمكن إعداد وسائط الثقافة مسبقا. يتكون وسط الاستزراع ل MAM و 17-1012 من RPMI مكمل بنسبة 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني (FBS) و 2 ملي مولار لجلوتامين. يتكون وسط استزراع MAC و MSCs من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع بديل الجلوتامين (انظر جدول المواد) ، و 4.5 جم / لتر D-glucose مكمل بنسبة 10٪ (v / v) FBS.

  1. حصاد الخلايا ومرورها حتى يتم تحقيق التقاء 80٪.
  2. اغسل الخلايا ب 5 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) وشفط PBS من القارورة باستخدام ماصة.
    ملاحظة: تضمن هذه الخطوة إزالة الوسط الكامل المتبقي الذي يحتوي على مثبطات البروتياز
  3. أضف 3 مل من 0.05٪ (حجم / حجم) التربسين-EDTA لفصل الخلايا الملتصقة عن قاع القارورة التي يتم زراعتها فيها.
  4. احتضان القوارير لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  5. راقب انفصال الخلية تحت مجهر تباين الطور.
    ملاحظة: يجب ضبط وقت الحضانة لكل نوع من أنواع الخلايا. منع تعرض الخلايا لمحلول التربسين لفترات أطول (>10 دقائق).
  6. أوقف التربسينية بإضافة إضافة 3 مل من وسط الاستزراع.
    ملاحظة: تأكد من إضافة وسيط الاستزراع المناسب لكل نوع خلية يحتوي على FBS بنسبة 10٪ (حجم/حجم).
  7. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي وقم بطردها لمدة 7 دقائق عند 350 × جم عند 7 درجات مئوية.
  8. تخلص من المادة الطافية.
  9. أعد تعليق الخلايا بيليه في 1 مل من وسط الثقافة وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم كما هو موضحسابقا 13.

2. إعداد PDT والتعرض

  1. قم بإعداد جهاز PDT (انظر جدول المواد) عن طريق توصيل جميع الكابلات والملحقات.
  2. قم بتعتيم الضوء في الغرفة لتجنب تبديد الضوء غير الضروري.
  3. ضع الألياف الضوئية وتثبيتها بمساعدة شريط لاصق مباشرة أعلى لوحة البئر.
    ملاحظة: مطلوب توزيع موحد للألياف الضوئية أعلى الآبار لضمان تعريض جميع الخلايا للإشعاع وتلقي نفس الكمية من الطاقة (الشكل 1).
  4. تأكد من عدم ثني الألياف الضوئية أو إتلافها بشدة لأن ذلك قد يؤدي إلى تقليل شدة الضوء.
  5. قم بتغطية ألواح البئر بورق الألمنيوم لتقليل تبديد الضوء.
  6. قم بتشغيل جهاز PDT بالضغط على زر مفتاح التشغيل / الإيقاف .
  7. أدخل البطاقة المقننة في الفتحة الموجودة في مقدمة جهاز PDT.
    ملاحظة: يتم توفير بطاقة واحدة مقننة مع الجهاز المقابل لوقت التعرض 300 ثانية. يتم دمج برنامج إضافي 2,000 ثانية تلقائيا داخل جهاز PDT. في كلا وقتي التعريض الضوئي ، يتم توصيل الضوء في وضع الإخراج المستمر للفترات المشار إليها.
  8. تأكد من أن المؤقت الموجود على شاشة العرض التعريفي الصيفي يتغير إلى الوقت المحدد الموضح على البطاقة المقننة.
  9. ابدأ علاج PDT بالضغط على دواسة القدم المدمجة.
    ملاحظة: تم دمج وظيفة الإيقاف التلقائي في الجهاز ، ويعمل النظام تلقائيا. لا تتوقف عن عملية الضوء أو تزيل الألياف الضوئية قبل الانتهاء من الدورة. عند الانتهاء من دورة الضوء ، يتم إغلاق غالق مصدر الضوء ، ولا يتم توصيل المزيد من الضوء.

3. مقايسة الهجرة

  1. خلايا البذور على النحو التالي: 2 × 104 خلايا - MAC ، 1 × 104 خلايا - MAM ، 3 × 104 - 17-1012 ، و 2.5 × 104 - MSCs في كل إدراج ثقافة من غرفتين مدمجة في ألواح F غير شفافة ، 6 آبار.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة. قم بإزالة الإدخالات بعد ذلك.
    ملاحظة: للحصول على نقطة مرجعية انطلاقية للترحيل وحجم الفجوة الأولي غير المتحيز ، يتم استخدام لوحة منفصلة ، والتي لن تخضع لمزيد من التعرض ل 5-ALA-PDT (الخطوات 3.3-3.4) ولكن بدلا من ذلك ملطخة مباشرة ومحددة كميا (الخطوات 3.5-3.12).
  3. استبدل الوسط بوسط جديد خال من FBS يحتوي على 1 ملي مولار من 5-ALA.
  4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 4 ساعات.
    ملاحظة: كعناصر تحكم ، يجب تغطية الآبار الإضافية في نفس الوقت بوسط بدون 5-ALA.
  5. إخضاع الخلايا للتوقيت الصيفي بالضوء الأزرق (436 نانومتر، 36 جول/سم2) في أسلوب خرج مستمر للأطر الزمنية المحددة مسبقا من 300 ثانية أو 000 2 ثانية، كما هو موضح في القسم 2.
    ملاحظة: يجب استخدام الألواح التي لا تخضع للتعرض PDT كضوابط.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: افحص الخلايا بشكل دوري لتقييم درجة الهجرة لكل نوع من أنواع الخلايا. يجب تحسين هذا لكل خط خلية.
  7. اغسل الخلايا ب 1.5 مل من PBS وقم بإزالة PBS تماما بعد ذلك.
  8. قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة الخلايا واحتضانها ب 1.5 مل من 4٪ (حجم / حجم) بارافورمالدهيد في PBS لمدة 10 دقائق.
  9. أضف 1.5 مل من 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول واحتضنه لمدة 10 دقائق.
  10. تخلص من الإيثانول واترك الألواح تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  11. احتضان الخلايا ب 1.5 مل من 0.2٪ (حجم / حجم) صبغة Coomassie الزرقاء في 90٪ (v / v) الإيثانول لمدة 20 دقيقة.
  12. اغسل الأطباق بالماء المقطر المزدوج.
    ملاحظة: لغسل الألواح جيدا وإزالة الحطام المتبقي ، اغمر الألواح بالكامل 2-3 مرات في ماء نظيف مقطر مزدوج.
  13. اترك الأطباق تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الأطباق المجففة في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع على الأقل.
  14. تصور وتصوير هجرة الخلايا إلى الفجوات باستخدام مجهر تباين الطور العكسي بتكبير 10 أضعاف.
    ملاحظة: راقب وصور هجرة الخلايا الحية لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد التعرض ل 5-ALA-PDT. ومع ذلك ، يمكن تخزين الخلايا الثابتة وتصويرها لاحقا.
  15. تصدير الصور بالتنسيق المطلوب وتحديد الفجوات باستخدام برنامج لمعالجة وتحليل الصور العلمية كما هو موضحسابقا 14.

4. فحص الجدوى

  1. قم بزرع جميع الخلايا بكثافة 1.5 × 104 في ألواح 96 بئرا في 50 ميكرولتر من وسط الاستزراع.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.
  3. أضف 50 ميكرولتر إضافي من وسط الاستزراع الخالي من FBS الذي يحتوي على 5-ALA بتركيز نهائي قدره 1 مليمتر.
  4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 4 ساعات في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.
    ملاحظة: استخدم تركيز 2x حيث أن الخلايا مغطاة بالفعل ب 50 ميكرولتر من وسط الاستزراع. يجب تضمين عنصر تحكم مع وسط الاستزراع.
  5. إخضاع الخلايا لتعرض PDT بالضوء الأزرق (436 نانومتر، 36 جول/سم2) في وضع الإخراج المستمر للأطر الزمنية المحددة مسبقا من 300 ثانية أو 2,000 ثانية، كما هو موضح في القسم 2.
    ملاحظة: يجب أيضا تضمين عنصر تحكم سلبي لا يخضع للتعرض للتوقيت الصيفي الصيفي العام.
  6. احتضان الخلايا المشعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.
  7. أضف 15 ميكرولتر من كاشف MTS على الخلايا واحتضن الخلايا لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  8. قم بقياس الامتصاص باستخدام قارئ مقياس الطيف الضوئي بطول موجي 490 نانومتر.

5. توقف النمو الخلوي / فحص الشيخوخة (نشاط β-Galactosidase (β-Gal)

ملاحظة: تم توفير جميع الكواشف والمخازن المؤقتة المستخدمة هنا في مجموعة الفحص (انظر جدول المواد).

  1. قم بزرع الخلايا بكثافة 1.5 × 104 في ألواح 96 بئرا في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة ، 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.
  2. أضف 100 ميكرولتر من الوسط الطازج الخالي من FBS مع 5-ALA بتركيز نهائي قدره 1 ملي مولار واحتضانه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    ملاحظة: كعناصر تحكم ، يجب تغطية الآبار المنفصلة بشكل متزامن بوسط جديد بدون محسس ضوئي 5-ALA.
  3. إخضاع الخلايا لتعرض PDT بالضوء الأزرق (436 نانومتر، 36 جول/سم2) في وضع الإخراج المستمر للأطر الزمنية المحددة مسبقا من 300 ثانية أو 2,000 ثانية، كما هو موضح في القسم 2.
    ملاحظة: يجب أيضا تضمين لوحة تحكم سلبية لا تتعرض ل PDT.
  4. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.
  5. تخلص من الوسيط واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.
  6. قم بتغطية الخلايا ب 100 ميكرولتر من 1x عازلة تحلل الخلية واحتضانها لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. جهاز الطرد المركزي المحللة عند 350 × جم 1 لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية.
  8. الماصة 50 ميكرولتر من المادة الطافية إلى صفيحة جديدة ذات 96 بئرا وإضافة 50 ميكرولتر أخرى من المخزن المؤقت للفحص 2x.
  9. ضع الصفيحة الجديدة المكونة من 96 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
    ملاحظة: يجب حماية الفطائر من الضوء لتجنب التبييض الضوئي.
  10. انقل 50 ميكرولتر من الخليط إلى طبق معتم الجدران مكون من 96 بئرا وأضف 200 ميكرولتر من محلول التوقف.
  11. قم بقياس الامتصاص باستخدام قارئ صفيحة دقيقة مضان عند إثارة 360 نانومتر / انبعاث 465 نانومتر.

النتائج

بعد التعرض ل 5-ALA PDT ، لم تظهر مجموعة التحكم في MSC أي تأثير ملحوظ من حيث الهجرة بعد تشعيع 5-ALA PDT (الشكل 2 أ ، أنا ، الخامس ، التاسع). في المقابل ، أظهرت خلايا MAC (الشكل 1 ب والشكل 2 أ ، الثالث ، السابع ، الحادي عشر) و...

Discussion

على الرغم من خيارات العلاج الحالية ، فإن الاستجابة العلاجية للسرطان متغيرة ، وتدعو إلى اتباع مناهج جديدة أو حتى علاجات مركبة لعلاج النقائل العظمية مع الحفاظ على بنية الأنسجة الأولية. في هذا السياق ، يعد PDT بديلا واعدا. من وجهة نظر مبسطة ، يتكون PDT من مكونين أساسيين: (1) صبغة...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

نشكر المؤلفين المشاركين من المنشورات الأصلية على مساعدتهم ودعمهم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
300 s metered card for PDTIlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USAn/ahttp://www.illuminoss.com
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizerSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAA779310 mg
6 Well platesGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany657160
8 Well Chamber SlidesSARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany94.6140.802
96 Well plates (F-buttom)Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany655180
CellTiter 96 Aqueous One
Solution Cell Proliferation
Assay (MTS-Assay)		Promega, Fitchburg,
Wisconsin, USA		G3580
Cellular Senescence AssayBiotrend Chemikalien GmbH, Köln, GermanyCBA-231Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA350550.5% (w/v)
Culture-Inserts 2Wellibidi GmbH, Gräfelfing, Germany80209
DMEM (1x) + GlutaMax-ILife Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA31966-021
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USAF7524
Fluorescence microplate readerPromega, Madison, Wisconsin, USAGlowMAx®,
GM3510
HemocytometerHecht Assistent, Sondheim, Deutschland4042
ImageJNational Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USAImageJ (version: 1.53a)Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/
Inverse phase-contrast microscopeLeica, Wetzlar, GermanyDM IMBRE 100
Methanol AnulaR NormapurVWR, Fontenay-Sous-Bois, France20847.307
ParaformaldehydSigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA158127Powder, 95% purity
PDT device (light box and accesories)IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USAn/aBlue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA15140-12210,000 U/mL Penicillin
10,000 μg/mL Streptomycin
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA10010-015
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA21875034
Spectrophotomete/ microplate readerBioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, GermanyEL800
Trypan Blue dye 0.4%Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USAT8154
Trypsin-EDTA 10xSigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USAT4174

References

  1. Milano, M. T., Constine, L. S., Okunieff, P. Normal tissue tolerance dose metrics for radiation therapy of major organs. Seminars in Radiation Oncology. 17 (2), 131-140 (2007).
  2. Higham, C. E., Faithfull, S. Bone health and pelvic radiotherapy. Clinical Oncology. 27 (11), 668-678 (2015).
  3. von Moos, R., et al. Pain and health-related quality of life in patients with advanced solid tumours and bone metastases: integrated results from three randomized, double-blind studies of denosumab and zoledronic acid. Supportive Care in Cancer. 21 (12), 3497-3507 (2013).
  4. Stewart, F., Baas, P., Star, W. What does photodynamic therapy have to offer radiation oncologists (or their cancer patients). Radiotherapy and Oncology. 48 (3), 233-248 (1998).
  5. Dolmans, D. E. J. G. J., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
  6. Kwiatkowski, S., et al. Photodynamic therapy-mechanisms, photosensitizers and combinations. Biomedicine and Pharmacotherapy. 106, 1098-1107 (2018).
  7. Huang, Z., et al. Photodynamic therapy for treatment of solid tumors--potential and technical challenges. Technology in Cancer Research and Treatment. 7 (4), 309-320 (2008).
  8. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  9. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Photodynamic therapy: novel third-generation photosensitizers one step closer. British Journal of Pharmacology. 154 (1), 1-3 (2008).
  10. Dragieva, G., et al. A randomized controlled clinical trial of topical photodynamic therapy with methyl aminolaevulinate in the treatment of actinic keratoses in transplant recipients. British Journal of Dermatology. 151 (1), 196-200 (2004).
  11. Sachsenmaier, S. M., et al. Assessment of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on bone metastases: an in vitro study. Biology. 10 (10), 1020 (2021).
  12. Mitsiadis, T. A., Woloszyk, A., Jiménez-Rojo, L. Nanodentistry: combining nanostructured materials and stem cells for dental tissue regeneration. Nanomedicine. 7 (11), 1743-1753 (2012).
  13. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e752 (2008).
  14. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  15. Dai, T., et al. Concepts and principles of photodynamic therapy as an alternative antifungal discovery platform. Frontiers in Microbiology. 3, 120 (2012).
  16. Chen, X., Zhao, P., Chen, F., Li, L., Luo, R. Effect and mechanism of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy in esophageal cancer. Lasers in Medical Science. 26 (1), 69-78 (2011).
  17. Bacellar, I. O., Tsubone, T. M., Pavani, C., Baptista, M. S. Photodynamic efficiency: from molecular photochemistry to cell death. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 20523-20559 (2015).
  18. Song, Y. S., Lee, B. Y., Hwang, E. S. Dinstinct ROS and biochemical profiles in cells undergoing DNA damage-induced senescence and apoptosis. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (5), 580-590 (2005).
  19. Faber, J., Fonseca, L. M. How sample size influences research outcomes. Dental Press Journal of Orthodontics. 19 (4), 27-29 (2014).
  20. Anker, H. S. Biological aspects of cancerby Julian Huxley. Review. Perspectives in Biology and Medicine. 2 (2), 246 (1959).
  21. Alizadeh, A. A., et al. Toward understanding and exploiting tumor heterogeneity. Nature Medicine. 21 (8), 846-853 (2015).
  22. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
  23. Dai, Z., et al. Research and application of single-cell sequencing in tumor heterogeneity and drug resistance of circulating tumor cells. Biomarker Research. 8 (1), 60 (2020).
  24. Barron, G. A., Moseley, H., Woods, J. A. Differential sensitivity in cell lines to photodynamic therapy in combination with ABCG2 inhibition. Journal of Photochemistry and Photobiology. 126, 87-96 (2013).
  25. Perry, R. R., et al. Sensitivity of different human lung cancer histologies to photodynamic therapy. Cancer Research. 50 (14), 4272-4276 (1990).
  26. Choi, B. -. H., Ryoo, I. -. G., Kang, H. C., Kwak, M. -. K. The sensitivity of cancer cells to pheophorbide a-based photodynamic therapy is enhanced by NRF2 silencing. PLoS One. 9 (9), 107158 (2014).
  27. Du, K. L., et al. Preliminary results of interstitial motexafin lutetiuç mediated PDT for prostate cancer. Lasers in Surgery and Medicine. 38 (5), 427-434 (2006).
  28. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy-current limitations and novel approaches. Frontiers in Chemistry. 9, 691697 (2021).
  29. Fisher, C., et al. Photodynamic therapy for the treatment of vertebral metastases: a phase I clinical trial. Clinical Cancer Research. 25 (19), 5766-5776 (2019).
  30. Cochrane, C., Mordon, S. R., Lesage, J. C., Koncar, V. New design of textile light diffusers for photodynamic therapy. Materials Science and Engineering: C. 33 (3), 1170-1175 (2013).
  31. Wen, J., et al. Mitochondria-targeted nanoplatforms for enhanced photodynamic therapy against hypoxia tumor. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 440 (2021).
  32. Li, W. -. P., Yen, C. -. J., Wu, B. -. S., Wong, T. -. W. Recent advances in photodynamic therapy for deep-seated tumors with the aid of nanomedicine. Biomedicines. 9 (1), 69 (2021).
  33. Ozdemir, T., Lu, Y. -. C., Kolemen, S., Tanriverdi-Ecik, E., Akkaya, E. U. Generation of singlet oxygen by persistent luminescent nanoparticle-photosensitizer conjugates: a proof of principle for photodynamic therapy without light. ChemPhotoChem. 1 (5), 183-187 (2017).
  34. Abrahamse, H., Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. The Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
  35. Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
  36. Saravana-Bawan, S., David, E., Sahgal, A., Chow, E. Palliation of bone metastases-exploring options beyond radiotherapy. Annals of Palliative Medicine. 8 (2), 168-177 (2019).
  37. Wise-Milestone, L., et al. Local treatment of mixed osteolytic/osteoblastic spinal metastases: is photodynamic therapy effective. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 899-908 (2012).
  38. Dentro, S. C., et al. Characterizing genetic intra-tumor heterogeneity across 2,658 human cancer genomes. Cell. 184 (8), 2239-2254 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

5 PDT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved