Terapia fotodinamica mediata dall'acido 5-aminolevulinico su linee cellulari di tumore osseo primario e metastasi ossee

Riepilogo

Questo protocollo presenta un approccio metodologico graduale all'esposizione di linee cellulari metastatiche ossee e tumori ossei primari alla terapia fotodinamica mediata dall'acido 5-aminolevulinico (PDT). Vengono analizzati anche gli effetti sul potenziale/invasività della migrazione cellulare, sulla vitalità, sull'apoptosi e sul potenziale di senescenza in seguito all'esposizione alla PDT.

Abstract

Le metastasi ossee sono associate a una prognosi infausta e a una bassa qualità di vita per i pazienti affetti. La terapia fotodinamica (PDT) emerge come una terapia non invasiva in grado di colpire le lesioni ossee metastatiche locali. Questo articolo presenta un metodo in vitro per studiare l'effetto della PDT in linee cellulari aderenti. A tal fine, dimostriamo un approccio passo-passo per sottoporre sia linee cellulari di cancro metastatico primario (tumore osseo a cellule giganti) che umane (derivate da un carcinoma mammario duttale invasivo primario e da un carcinoma renale) a PDT mediata da acido 5-aminolevulinico (5-ALA).

Dopo 24 ore dopo l'irradiazione 5-ALA-PDT (lunghezza d'onda della luce blu 436 nm), l'effetto terapeutico è stato valutato in termini di potenziale di migrazione cellulare, vitalità, caratteristiche apoptotiche e arresto della crescita cellulare (senescenza). Dopo l'irradiazione con 5-ALA-PDT, le linee cellulari di derivazione muscoloscheletrica rispondono in modo diverso alle stesse dosi ed esposizione di PDT. A seconda dell'entità del danno cellulare innescato dall'esposizione alla PDT, sono stati osservati due diversi destini cellulari: l'apoptosi e la senescenza. La sensibilità variabile alla terapia con PDT tra diverse linee cellulari di cancro osseo fornisce informazioni utili per selezionare impostazioni PDT più appropriate in ambito clinico. Questo protocollo è progettato per esemplificare l'uso della PDT nel contesto delle linee cellulari neoplastiche muscoloscheletriche. Può essere regolato per studiare l'effetto terapeutico della PDT su varie linee cellulari tumorali e vari fotosensibilizzatori e sorgenti luminose.

Introduzione

Le opzioni terapeutiche per le metastasi ossee sono ancora limitate e impegnative, nonostante i continui sviluppi nel trattamento oncologico. L'attuale metodo standard è la radioterapia, che è associata a complicanze come eritema locale, tossicità per gli organi interni¹ e fratture insufficienti². C'è bisogno di terapie antineoplastiche alternative poiché i pazienti con metastasi ossee spesso soffrono di dolore, ipercalcemia e sintomi neurologici che si traducono in mobilità ridotta e ridotta qualità della vita³. Recenti scoperte dimostrano che la PDT fornisce un'opzione di trattamento antineoplastico alternativa promettente per colpire direttamente le lesioni ossee, che può essere utilizzata da sola o in supporto alla radioterapia⁴.

Il meccanismo della PDT si basa essenzialmente su un trasferimento di energia da un composto fotosensibile eccitato dalla luce (fotosensibilizzatore) all'ossigeno dei tessuti. Questo fotosensibilizzatore funziona in modo simile a un condensatore a livello nanoscopico. Può immagazzinare energia in uno stato fondamentale quando viene irradiato con una lunghezza d'onda appropriata della luce e rilascia l'energia immagazzinata quando ritorna da uno stato eccitato allo stato fondamentale originale⁵. L'energia rilasciata porta a due reazioni fotochimiche: una è la trasformazione dell'ossigeno in radicali reattivi dell'ossigeno trasferendo idrogeno o un elettrone. Il secondo è la produzione di particelle di ossigeno singoletto mediante trasferimento orizzontale di energia dal substrato del fotosensibilizzatore alle particelle di ossigeno a triplette locali⁶. I radicali reattivi dell'ossigeno e le molecole di ossigeno singoletto hanno effetti altamente citotossici sulle cellule tumorali locali e inducono l'occlusione vascolare e la risposta infiammatoria locale mediante apoptosi delle cellule endoteliali dei vasi sanguigni tumorali⁷.

I fotosensibilizzanti convenzionali sono derivati della famiglia delle porfirine come le ematoporfirine e le benzoporfirine⁸. L'applicazione di sostanze fotosensibilizzanti con maggiore affinità al tessuto tumorale può aumentare la selettività della PDT⁹ anni. In particolare, il 5-ALA, che è un precursore biosintetico della protoporfirina IX, può accumularsi in cellule tumorali come la cheratosi attinica, il carcinoma basocellulare, il tumore della vescica e il cancro gastrointestinale⁵. Diversi approcci di somministrazione che utilizzano il 5-ALA possono anche variare l'efficienza della PDT in relazione alla localizzazione del tumore. Pertanto, l'uso topico di 5-ALA con l'applicazione di PDT è diventato la terapia dermatologica di prima linea contro la cheratosi attinica¹⁰. Risultati recenti per le metastasi ossee di linee cellulari di carcinoma mammario duttale invasivo indicano una possibile inibizione della migrazione cellulare e l'induzione dell'apoptosi dopo l'esposizione a PDT con 5-ALA¹¹. Tuttavia, l'uso della PDT nel tessuto umano sottofasciale come il tessuto osseo è ancora nella sua fase clinica da preclinica a sperimentale poiché l'efficacia deve essere migliorata. Le applicazioni delle nanoparticelle con la terapia basata sulla luce mostrano già un grande impatto in odontoiatria¹². Pertanto, è probabile che la combinazione dell'uso di nanoparticelle con la PDT amplierà la sua gamma di applicazioni verso l'oncologia ortopedica.

Il seguente protocollo descrive come preparare sia le cellule originate da tumori ossei primari che le linee cellulari di metastasi ossee e sottoporle a PDT mediata da 5-ALA per un tempo di esposizione predefinito. È inclusa anche una descrizione dettagliata di come eseguire e valutare il potenziale di migrazione cellulare, la vitalità e la senescenza dopo l'irradiazione con 5-ALA-PDT. Le istruzioni dettagliate forniscono un approccio semplice e conciso per acquisire dati affidabili e riproducibili. Vengono inoltre discussi i vantaggi, i limiti e le prospettive future dell'approccio PDT per le lesioni neoplastiche ossee.

Protocollo

Sono stati impiegati tre diversi tipi di linee cellulari: "MAM" - una linea cellulare originata da metastasi ossee di carcinoma a cellule renali, "MAC" - metastasi ossee di un carcinoma mammario duttale invasivo e "17-1012" - un tumore osseo a cellule giganti. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal midollo sono state utilizzate come gruppo di controllo. L'approvazione istituzionale ed etica è stata ottenuta prima dell'inizio dello studio (numero di progetto: 008/2014BO2 per le linee cellulari tumorali e numero di progetto: 401/2013 BO2 per le MSC).

1. Coltura cellulare

NOTA: I terreni di coltura possono essere preparati in anticipo. Il terreno di coltura per MAM e 17-1012 è costituito da RPMI integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) e 2 mM di L-glutammina. Il terreno di coltura per MAC e MSC è costituito dal terreno di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco con sostituto della glutammina (vedere la Tabella dei materiali), 4,5 g/L di D-glucosio integrati con il 10% (v/v) di FBS.

1. Raccogliere e passare le celle fino a raggiungere l'80% di confluenza.
2. Lavare le cellule con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aspirare il PBS dal matraccio utilizzando una pipetta.
   NOTA: Questa fase garantisce la rimozione del terreno completo residuo contenente inibitori della proteasi.
3. Aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% (v/v) per dissociare le cellule aderenti dal fondo del pallone in cui sono state coltivate.
4. Incubare i matracci per 5 minuti a 37 °C in atmosfera umidificata con CO₂ al 5%.
5. Osservare il distacco cellulare al microscopio a contrasto di fase.
   NOTA: Il tempo di incubazione deve essere regolato per ogni tipo di cellula. Prevenire l'esposizione cellulare alla soluzione di tripsina per periodi più lunghi (>10 min).
6. Arrestare la tripsinizzazione aggiungendo 3 ml di terreno di coltura.
   NOTA: Assicurarsi di aggiungere il terreno di coltura appropriato per ogni tipo di cellula contenente il 10% (v/v) di FBS.
7. Trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifugazione e centrifugarle per 7 minuti a 350 × g a 7 °C.
8. Scartare il surnatante.
9. Risospendere il pellet di cellule in 1 mL di terreno di coltura e contare le cellule utilizzando un emocitometro come descritto in precedenza¹³.

2. Configurazione ed esposizione PDT

1. Preparare il dispositivo PDT (vedere la tabella dei materiali) collegando tutti i cavi e gli accessori.
2. Attenuare la luce nella stanza per evitare un'inutile dispersione della luce.
3. Posizionare e stabilizzare la fibra leggera con l'aiuto di del nastro adesivo direttamente sopra la piastra a pozzetti.
   NOTA: Si desidera una distribuzione uniforme delle fibre leggere sulla parte superiore dei pozzetti per garantire che tutte le celle vengano irradiate e ricevano la stessa quantità di energia (Figura 1).
4. Assicurarsi di non piegare o danneggiare gravemente la fibra luminosa in quanto ciò potrebbe portare a una riduzione dell'intensità della luce.
5. Coprire le piastre dei pozzetti con un foglio di alluminio per ridurre al minimo la dissipazione della luce.
6. Accendere il dispositivo PDT premendo il pulsante dell'interruttore ON/OFF .
7. Inserire la scheda a consumo nello slot nella parte anteriore del dispositivo PDT.
   NOTA: Con il dispositivo viene fornita una scheda a consumo corrispondente a un tempo di esposizione di 300 s. Un ulteriore programma di 2.000 s viene integrato automaticamente all'interno del dispositivo PDT. Per entrambi i tempi di esposizione, la luce viene erogata in modalità di emissione continua per i periodi indicati.
8. Assicurarsi che il timer sul display della lightbox PDT cambi l'ora prescritta indicata sulla scheda a pagamento.
9. Iniziare il trattamento PDT premendo il pedale incorporato.
   NOTA: Nel dispositivo è incorporata una funzione di arresto automatico e il sistema funziona automaticamente. Non interrompere il processo di illuminazione né rimuovere la fibra leggera prima del completamento del ciclo. Al termine del ciclo di luce, l'otturatore della sorgente luminosa viene chiuso e non viene erogata ulteriore luce.

3. Saggio di migrazione

1. Seminare le cellule come segue: 2 × 10⁴ cellule - MAC, 1 × 10⁴ cellule - MAM, 3 x 10⁴ - 17-1012 e 2,5 × 10⁴ - MSC in ciascun inserto di coltura a 2 camere integrato in piastre opache a 6 pozzetti con fondo F.
2. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore. Rimuovere gli inserti in seguito.
   NOTA: Per avere un punto di riferimento iniziale per la migrazione e la dimensione iniziale del gap non distorta, viene utilizzata una piastra separata, che non sarà sottoposta a ulteriore esposizione a 5-ALA-PDT (fasi 3.3-3.4) ma invece direttamente colorata e quantificata (fasi 3.5-3.12).
3. Sostituire il terreno con un terreno fresco privo di FBS contenente 1 mM di 5-ALA.
4. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 4 ore.
   NOTA: Come controlli, i pozzetti aggiuntivi devono essere coperti contemporaneamente con terreno senza 5-ALA.
5. Sottoporre le celle a PDT con luce blu (436 nm, 36 J/cm²) in modalità di uscita continua per intervalli di tempo predefiniti di 300 s o 2.000 s, come indicato nella sezione 2.
   NOTA: Le lastre che non sono soggette a esposizione a PDT devono essere utilizzate come controlli.
6. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.
   NOTA: Controllare periodicamente le celle per valutare il grado di migrazione per ciascun tipo di cellula. Questo deve essere ottimizzato per ogni linea cellulare.
7. Lavare le cellule con 1,5 ml di PBS e successivamente rimuovere completamente il PBS.
8. Fissare le cellule aggiungendo e incubando le cellule con 1,5 mL di paraformaldeide al 4% (v/v) in PBS per 10 minuti.
9. Aggiungere 1,5 ml di etanolo al 70% (v/v) e incubare per 10 minuti.
10. Scartare l'etanolo e lasciare asciugare le piastre all'aria a temperatura ambiente per 10 minuti.
11. Incubare le cellule con 1,5 mL di colorante blu Coomassie allo 0,2% (v/v) in etanolo al 90% (v/v) per 20 minuti.
12. Lavare i piatti con acqua bidistillata.
    NOTA: Per lavare accuratamente le piastre e rimuovere i detriti rimanenti, immergere completamente le piastre 2-3 volte in acqua pulita a doppia distillazione.
13. Lasciare asciugare le piastre all'aria a temperatura ambiente per 24 ore.
    NOTA: A questo punto, le piastre essiccate possono essere conservate a temperatura ambiente per almeno diverse settimane.
14. Visualizza e fotografa la migrazione delle cellule negli spazi vuoti con un microscopio a contrasto di fase inverso con ingrandimento di 10 volte.
    NOTA: Osservare e fotografare la migrazione di cellule vive per un massimo di 24 ore dopo l'esposizione a 5-ALA-PDT. Tuttavia, le celle fisse possono essere conservate e fotografate in un secondo momento.
15. Esportare le immagini nel formato desiderato e quantificare le lacune utilizzando un software per l'elaborazione e l'analisi delle immagini scientifiche come descritto in precedenza¹⁴.

4. Saggio di vitalità

1. Seminare tutte le cellule a una densità di 1,5 × 10⁴ in piastre a 96 pozzetti in 50 μL di terreno di coltura.
2. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore in un incubatore per colture cellulari standard.
3. Aggiungere altri 50 μl di terreno di coltura privo di FBS contenente 5-ALA a una concentrazione finale di 1 mM.
4. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 4 ore in un incubatore per colture cellulari standard.
   NOTA: Utilizzare una concentrazione 2x poiché le cellule sono già ricoperte da 50 μL di terreno di coltura. Deve essere incluso un controllo con terreno di coltura.
5. Sottoporre le celle a un'esposizione PDT con luce blu (436 nm, 36 J/cm²) in modalità di uscita continua per intervalli di tempo predefiniti di 300 s o 2.000 s, come indicato nella sezione 2.
   NOTA: Deve essere incluso anche un controllo negativo che non è soggetto a esposizione a PDT.
6. Incubare le cellule irradiate a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore in un incubatore per colture cellulari standard.
7. Aggiungere 15 μl di reagente MTS sulle cellule e incubare le cellule per 90 minuti a 37 °C, 5% CO₂.
8. Misurare l'assorbanza con un lettore spettrofotometrico a una lunghezza d'onda di 490 nm.

5. Saggio di arresto/senescenza della crescita cellulare (attività della β-galattosidasi (β-Gal)

NOTA: Tutti i reagenti e i tamponi utilizzati in questo articolo sono stati forniti nel kit di analisi (vedere la Tabella dei materiali).

1. Seminare le cellule a una densità di 1,5 × 10⁴ in piastre a 96 pozzetti in 100 μL di terreno di coltura. Incubare le cellule per 24 ore, 37 °C, 5% CO₂ in un incubatore per colture cellulari standard.
2. Aggiungere 100 μl di terreno fresco privo di FBS con 5-ALA a una concentrazione finale di 1 mM e incubare per 4 ore a 37 °C, 5% CO₂.
   NOTA: Come controlli, i pozzetti separati devono essere coperti contemporaneamente con terreno fresco senza fotosensibilizzatore 5-ALA.
3. Sottoporre le celle a un'esposizione PDT con luce blu (436 nm, 36 J/cm²) in modalità di uscita continua per intervalli di tempo predefiniti di 300 s o 2.000 s, come indicato nella sezione 2.
   NOTA: Deve essere inclusa anche una piastra di controllo negativa non esposta alla PDT.
4. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C, 5% CO₂ in un incubatore per colture cellulari standard.
5. Scartare il terreno e lavare le celle due volte con PBS.
6. Coprire le cellule con 100 μL di tampone di lisi cellulare 1x e incubare per 5 minuti a 4 °C.
7. Centrifugare il lisato a 350 × g 1 per 10 min a 4 °C e raccogliere il surnatante.
8. Pipettare 50 μl di surnatante in una nuova piastra da 96 pozzetti e aggiungere altri 50 μl di tampone per saggio 2x.
9. Posizionare la nuova piastra a 96 pozzetti in un incubatore a 37 °C per 1,5 ore.
   NOTA: I paté devono essere protetti dalla luce per evitare il fotosbiancamento.
10. Trasferire 50 μl della miscela in una piastra a 96 pozzetti con pareti opache e aggiungere 200 μl di soluzione di stop.
11. Misurare l'assorbanza con un lettore di micropiastre a fluorescenza a 360 nm di eccitazione/465 nm di emissione.

Risultati

Dopo l'esposizione a 5-ALA PDT, il gruppo di controllo MSC non ha mostrato alcun effetto notevole in termini di migrazione dopo l'irradiazione con 5-ALA PDT (Figura 2A, i, v, ix). Al contrario, le cellule MAC (Figura 1B e Figura 2A, iii, vii, xi) e le cellule 17-1012 (Figura 1B e Figura 2A, ii, vi, ...

Discussione

Nonostante le attuali opzioni di trattamento, la risposta terapeutica del cancro è variabile, deponendo a favore di nuovi approcci o addirittura terapie combinate per trattare le metastasi ossee preservando la struttura tissutale iniziale. In questo contesto, la PDT è un'alternativa promettente. Da un punto di vista semplicistico, la PDT è composta da due componenti di base: (1) un colorante sensibile alla luce non tossico chiamato fotosensibilizzatore (PS) e (2) una sorgente luminosa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 s metered card for PDT	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	http://www.illuminoss.com
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizer	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7793	10 mg
6 Well plates	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	657160
8 Well Chamber Slides	SARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany	94.6140.802
96 Well plates (F-buttom)	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	655180
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay)	Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA	G3580
Cellular Senescence Assay	Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Germany	CBA-231	Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	35055	0.5% (w/v)
Culture-Inserts 2Well	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	80209
DMEM (1x) + GlutaMax-I	Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA	31966-021
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	F7524
Fluorescence microplate reader	Promega, Madison, Wisconsin, USA	GlowMAx®, GM3510
Hemocytometer	Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland	4042
ImageJ	National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA	ImageJ (version: 1.53a)	Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/
Inverse phase-contrast microscope	Leica, Wetzlar, Germany	DM IMBRE 100
Methanol AnulaR Normapur	VWR, Fontenay-Sous-Bois, France	20847.307
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	158127	Powder, 95% purity
PDT device (light box and accesories)	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	Blue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	15140-122	10,000 U/mL Penicillin 10,000 μg/mL Streptomycin
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	10010-015
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	21875034
Spectrophotomete/ microplate reader	BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany	EL800
Trypan Blue dye 0.4%	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T8154
Trypsin-EDTA 10x	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T4174