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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole présente une approche méthodologique étape par étape de l’exposition de lignées de cellules métastatiques osseuses et de tumeurs osseuses primaires à une thérapie photodynamique médiée par l’acide 5-aminolévulinique (PDT). Les effets sur le potentiel de migration cellulaire/invasivité, la viabilité, l’apoptose et le potentiel de sénescence sont également analysés après l’exposition à la PDT.

Résumé

Les métastases osseuses sont associées à un mauvais pronostic et à une faible qualité de vie pour les patients touchés. La thérapie photodynamique (PDT) apparaît comme une thérapie non invasive qui peut cibler les lésions osseuses métastatiques locales. Cet article présente une méthode in vitro pour étudier l’effet PDT dans des lignées cellulaires adhérentes. À cette fin, nous démontrons une approche étape par étape pour soumettre à la fois des lignées cellulaires primaires (tumeur osseuse à cellules géantes) et métastatiques osseuses humaines (dérivées d’un carcinome du sein canalaire invasif primaire et d’un carcinome rénal) à la PDT médiée par l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA).

Après 24 h après l’irradiation 5-ALA-PDT (longueur d’onde de la lumière bleue 436 nm), l’effet thérapeutique a été évalué en termes de potentiel de migration cellulaire, de viabilité, de caractéristiques apoptotiques et d’arrêt de la croissance cellulaire (sénescence). Après l’irradiation de la 5-ALA-PDT, les lignées cellulaires dérivées de l’appareil locomoteur réagissent différemment aux mêmes doses et à la même exposition à la PDT. Selon l’étendue des dommages cellulaires déclenchés par l’exposition à la PDT, deux destins cellulaires différents, l’apoptose et la sénescence, ont été notés. La sensibilité variable à la thérapie PDT entre différentes lignées cellulaires de cancer osseux fournit des informations utiles pour sélectionner des paramètres PDT plus appropriés en milieu clinique. Ce protocole est conçu pour illustrer l’utilisation de la PDT dans le contexte des lignées cellulaires néoplasiques musculo-squelettiques. Il peut être ajusté pour étudier l’effet thérapeutique de la PDT sur diverses lignées cellulaires cancéreuses et divers photosensibilisants et sources lumineuses.

Introduction

Les options thérapeutiques pour les métastases osseuses sont encore limitées et difficiles malgré les développements en cours dans le traitement oncologique. La méthode standard actuelle est la radiothérapie, qui est associée à des complications telles qu’un érythème local, une toxicité pour les organes internes1 et des fractures insuffisantes2. Il est nécessaire de recourir à des thérapies antinéoplasiques alternatives, car les patients atteints de métastases osseuses souffrent souvent de douleur, d’hypercalcémie et de symptômes neurologiques qui entraînent une mobilité réduite et une qualité de vieréduite3. Des découvertes récentes démontrent que la PDT offre une option de traitement antinéoplasique alternative prometteuse pour cibler directement les lésions osseuses, qui peut être utilisée seule ou en soutien à la radiothérapie4.

Le mécanisme de la PDT est essentiellement basé sur un transfert d’énergie d’un composé photosensible excité par la lumière (photosensibilisant) à l’oxygène tissulaire. Ce photosensibilisateur fonctionne de la même manière qu’un condensateur à un niveau nanoscopique. Il peut stocker de l’énergie dans un état fondamental lorsqu’il est irradié avec une longueur d’onde de lumière appropriée et libérer de l’énergie stockée lorsqu’il revient d’un état excité à l’état fondamental d’origine5. L’énergie libérée entraîne deux réactions photochimiques : l’une est la transformation de l’oxygène en radicaux oxygénés réactifs par transfert d’hydrogène ou d’un électron. La seconde est la production de particules d’oxygène singulet par transfert d’énergie horizontal du substrat photosensibilisant aux particules d’oxygène triplets locales6. Les radicaux réactifs de l’oxygène et les molécules d’oxygène singulet ont des effets hautement cytotoxiques sur les cellules tumorales locales et induisent une occlusion vasculaire et une réponse inflammatoire locale par apoptose des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins tumoraux7.

Les photosensibilisants conventionnels sont des dérivés de la famille des porphyrines tels que les hématoporphyrines et les benzoporphyrines8. L’application de substances photosensibilisantes ayant une affinité plus élevée pour le tissu tumoral peut augmenter la sélectivité de la PDTà 9 ans. En particulier, le 5-ALA, qui est un précurseur biosynthétique de la protoporphyrine IX, peut s’accumuler dans les cellules tumorales telles que la kératose actinique, le carcinome basocellulaire, la tumeur de la vessie et le cancer gastro-intestinal5. Différentes approches d’administration utilisant le 5-ALA peuvent également faire varier l’efficacité de la PDT par rapport à la localisation tumorale. Ainsi, l’utilisation topique de 5-ALA avec l’application de PDT est devenue le traitement dermatologique de première intention contre la kératose actinique10. Des résultats récents pour les métastases osseuses de lignées cellulaires invasives de cancer canalaire du sein indiquent une possible inhibition de la migration cellulaire et l’induction de l’apoptose après exposition à la PDT avec du 5-ALA11. Cependant, l’utilisation de la PDT dans les tissus humains subfasciaux tels que le tissu osseux en est encore à son stade préclinique à expérimental, car l’efficacité doit être améliorée. Les applications des nanoparticules avec la thérapie par la lumière montrent déjà un grand impact en dentisterie12. Ainsi, il est probable que la combinaison de l’utilisation de nanoparticules avec la PDT élargira son champ d’application vers l’oncologie orthopédique.

Le protocole suivant décrit comment préparer à la fois les cellules provenant de tumeurs osseuses primitives et de lignées cellulaires de métastases osseuses et les soumettre à une PDT médiée par le 5-ALA pour une exposition de temps prédéfinie. Une description détaillée de la façon d’effectuer et d’évaluer le potentiel de migration cellulaire, la vitalité et la sénescence après l’irradiation 5-ALA-PDT est également incluse. Les instructions étape par étape offrent une approche simple et concise pour acquérir des données fiables et reproductibles. Les avantages, les limites et les perspectives d’avenir de l’approche PDT pour les lésions néoplasiques osseuses sont également discutés.

Protocole

Trois types différents de lignées cellulaires ont été utilisés : « MAM » - une lignée cellulaire provenant de métastases osseuses d’un carcinome à cellules rénales, « MAC » - métastases osseuses d’un carcinome canalaire invasif du sein, et « 17-1012 » - une tumeur osseuse à cellules géantes. Des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées de la moelle épinière ont été utilisées comme groupe témoin. L’approbation institutionnelle et éthique a été obtenue avant le début de l’étude (numéro de projet : 008/2014BO2 pour les lignées cellulaires cancéreuses et numéro de projet : 401/2013 BO2 pour les CSM).

1. Culture cellulaire

REMARQUE : Les milieux de culture peuvent être préparés à l’avance. Le milieu de culture pour MAM et 17-1012 est constitué de RPMI complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 2 mM de L-glutamine. Le milieu de culture pour les CMA et les CSM est constitué d’un milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec substitut de glutamine (voir le tableau des matières), de 4,5 g/L de D-glucose complété par 10 % (v/v) de FBS.

  1. Récoltez et faites passer les cellules jusqu’à ce que 80 % de confluence soit atteint.
  2. Lavez les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et aspirez le PBS du flacon à l’aide d’une pipette.
    REMARQUE : Cette étape assure l’élimination du milieu complet résiduel contenant des inhibiteurs de protéase.
  3. Ajouter 3 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % (v/v) pour dissocier les cellules adhérentes du fond de la fiole dans laquelle elles sont cultivées.
  4. Incuber les flacons pendant 5 min à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
  5. Observez le détachement cellulaire à l’aide d’un microscope à contraste de phase.
    REMARQUE : Le temps d’incubation doit être ajusté pour chaque type de cellule. Prévenir l’exposition cellulaire à la solution de trypsine pendant de plus longues périodes (>10 min).
  6. Arrêtez la trypsinisation en ajoutant 3 mL de milieu de culture.
    REMARQUE : Assurez-vous d’ajouter le milieu de culture approprié pour chaque type de cellule contenant 10 % (v/v) de FBS.
  7. Transférez les cellules détachées dans un tube de centrifugation et centrifugez-les pendant 7 min à 350 × g à 7 °C.
  8. Jetez le surnageant.
  9. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre comme décrit précédemment13.

2. Configuration et exposition PDT

  1. Préparez l’appareil PDT (voir le tableau des matériaux) en branchant tous les câbles et accessoires.
  2. Tamisez la lumière dans la pièce pour éviter une dissipation inutile de la lumière.
  3. Positionnez et stabilisez la fibre légère à l’aide de ruban adhésif directement sur la plaque du puits.
    REMARQUE : Une répartition uniforme des fibres légères sur le dessus des puits est souhaitée pour s’assurer que toutes les cellules sont irradiées et reçoivent la même quantité d’énergie (Figure 1).
  4. Assurez-vous de ne pas plier ou endommager gravement la fibre lumineuse, car cela pourrait entraîner une réduction de l’intensité lumineuse.
  5. Couvrez les plaques de puits avec une feuille d’aluminium pour minimiser la dissipation de la lumière.
  6. Allumez l’appareil PDT en appuyant sur le bouton de commutation ON/OFF .
  7. Insérez la carte mesurée dans l’emplacement situé à l’avant de l’appareil PDT.
    REMARQUE : Une carte mesurée est fournie avec l’appareil correspondant à un temps d’exposition de 300 s. Un programme supplémentaire de 2 000 s est automatiquement intégré dans l’appareil PDT. Pour les deux temps d’exposition, la lumière est délivrée en mode de sortie continu pendant les périodes indiquées.
  8. Assurez-vous que la minuterie sur l’affichage de la boîte lumineuse PDT passe à l’heure prescrite indiquée sur la carte mesurée.
  9. Démarrez le traitement PDT en appuyant sur la pédale intégrée.
    REMARQUE : Une fonction d’arrêt automatique est intégrée à l’appareil et le système fonctionne automatiquement. N’arrêtez pas le processus d’éclairage et ne retirez pas la fibre lumineuse avant la fin du cycle. À la fin du cycle d’éclairage, l’obturateur de la source lumineuse est fermé et aucune autre lumière n’est délivrée.

3. Essai de migration

  1. Cellules d’amorçage comme suit : 2 × 104 cellules - MAC, 1 × 104 cellules - MAM, 3 x 104 - 17-1012 et 2,5 ×10 4 - MSC dans chaque insert de culture à 2 chambres intégré dans des plaques opaques à fond F à 6 puits.
  2. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % CO2 pendant 24 h. Retirez ensuite les inserts.
    REMARQUE : Pour avoir un point de référence de départ pour la migration et la taille initiale de l’espace non biaisé, une plaque séparée, qui ne sera pas soumise à une exposition supplémentaire au 5-ALA-PDT (étapes 3.3-3.4) mais qui sera directement colorée et quantifiée (étapes 3.5-3.12), est utilisée.
  3. Remplacer le milieu par un milieu frais exempt de FBS contenant 1 mM de 5-ALA.
  4. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % CO2 pendant 4 h.
    REMARQUE : À titre de mesures de contrôle, les puits supplémentaires doivent être recouverts en même temps d’un fluide sans 5-ALA.
  5. Soumettre les cellules à la TPD avec lumière bleue (436 nm, 36 J/cm2) en mode de sortie continue pendant des intervalles de temps prédéfinis de 300 s ou 2 000 s, comme indiqué au point 2.
    REMARQUE : Les plaques qui ne sont pas soumises à l’exposition à la PDT doivent être utilisées comme témoins.
  6. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % CO2 pendant 24 h.
    REMARQUE : Vérifiez les cellules périodiquement pour évaluer le degré de migration de chaque type de cellule. Celle-ci doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire.
  7. Lavez les cellules avec 1,5 ml de PBS et retirez complètement le PBS par la suite.
  8. Fixez les cellules en ajoutant et en incubant les cellules avec 1,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % (v/v) dans du PBS pendant 10 min.
  9. Ajouter 1,5 mL d’éthanol à 70 % (v/v) et incuber pendant 10 min.
  10. Jetez l’éthanol et laissez les plaques sécher à l’air libre à température ambiante pendant 10 min.
  11. Incuber les cellules avec 1,5 mL de colorant bleu Coomassie à 0,2 % (v/v) dans de l’éthanol à 90 % (v/v) pendant 20 min.
  12. Lavez les assiettes avec de l’eau doublement distillée.
    REMARQUE : Pour bien laver les plaques et enlever les débris restants, immergez-les complètement 2 à 3 fois dans de l’eau propre à double distillation.
  13. Laissez les plaques sécher à l’air libre à température ambiante pendant 24 h.
    REMARQUE : À ce stade, les plaques séchées peuvent être conservées à température ambiante pendant au moins plusieurs semaines.
  14. Visualisez et photographiez la migration des cellules dans les espaces à l’aide d’un microscope à contraste de phase inverse à un grossissement de 10 fois.
    REMARQUE : Observez et photographiez la migration des cellules vivantes jusqu’à 24 h après l’exposition au 5-ALA-PDT. Cependant, les cellules fixes peuvent être stockées et photographiées ultérieurement.
  15. Exporter les images dans le format souhaité et quantifier les lacunes à l’aide d’un logiciel de traitement et d’analyse des images scientifiques comme décrit précédemment14.

4. Essai de viabilité

  1. Ensemencer toutes les cellules à une densité de 1,5 × 104 dans des plaques de 96 puits dans 50 μL de milieu de culture.
  2. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire standard.
  3. Ajouter 50 μL supplémentaires de milieu de culture exempt de FBS contenant du 5-ALA à une concentration finale de 1 mM.
  4. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 4 h dans un incubateur de culture cellulaire standard.
    REMARQUE : Utilisez une concentration 2x car les cellules sont déjà recouvertes de 50 μL de milieu de culture. Un témoin avec milieu de culture doit être inclus.
  5. Soumettre les cellules à une exposition PDT à la lumière bleue (436 nm, 36 J/cm2) en mode de sortie continue pendant des intervalles de temps prédéfinis de 300 s ou 2 000 s, comme indiqué au point 2.
    REMARQUE : Un témoin négatif qui n’est pas soumis à l’exposition PDT doit également être inclus.
  6. Incuber les cellules irradiées à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire standard.
  7. Ajouter 15 μL de réactif MTS sur les cellules et incuber les cellules pendant 90 min à 37 °C, 5 % de CO2.
  8. Mesurez l’absorbance avec un lecteur de spectrophotomètre à une longueur d’onde de 490 nm.

5. Essai d’arrêt de croissance cellulaire/sénescence (activité de la β-galactosidase (β-gal))

REMARQUE : Tous les réactifs et tampons utilisés ici ont été fournis dans le kit de dosage (voir le tableau des matériaux).

  1. Ensemencer les cellules à une densité de 1,5 × 104 dans des plaques de 96 puits dans 100 μL de milieu de culture. Incuber les cellules pendant 24 h, 37 °C, 5 % de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire standard.
  2. Ajouter 100 μL de milieu frais sans FBS avec du 5-ALA à une concentration finale de 1 mM et incuber pendant 4 h à 37 °C, 5 % CO2.
    REMARQUE : À titre de témoins, les puits séparés doivent être recouverts en même temps d’un milieu frais sans photosensibilisant 5-ALA.
  3. Soumettre les cellules à une exposition PDT à la lumière bleue (436 nm, 36 J/cm2) en mode de sortie continue pendant des intervalles de temps prédéfinis de 300 s ou 2 000 s, comme indiqué au point 2.
    REMARQUE : Une plaque de contrôle négative qui n’est pas exposée à la PDT doit également être incluse.
  4. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire standard.
  5. Jetez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS.
  6. Couvrir les cellules avec 100 μL de 1x tampon de lyse cellulaire et incuber pendant 5 min à 4 °C.
  7. Centrifuger le lysat à 350 × g 1 pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant.
  8. Pipeter 50 μL du surnageant dans une nouvelle plaque à 96 puits et ajouter 50 μL supplémentaires de tampon de dosage.
  9. Placez la nouvelle plaque à 96 puits dans un incubateur à 37 °C pendant 1,5 h.
    REMARQUE : Les pâtés doivent être protégés de la lumière pour éviter le photoblanchiment.
  10. Transférez 50 μL du mélange dans une plaque à paroi opaque de 96 puits et ajoutez 200 μL de solution d’arrêt.
  11. Mesurez l’absorbance avec un lecteur de microplaques à fluorescence à 360 nm d’excitation/465 nm d’émission.

Résultats

Après une exposition à la PDT 5-ALA, le groupe témoin MSC n’a montré aucun effet notable en termes de migration après irradiation PDT 5-ALA (Figure 2A, i, v, ix). En revanche, les cellules MAC (figure 1B et figure 2A, iii, vii, xi) et les cellules 17-1012 (figure 1B et figure 2A, ii, vi, x

Discussion

Malgré les options de traitement actuelles, la réponse thérapeutique du cancer est variable, plaidant en faveur de nouvelles approches ou même de thérapies combinées pour traiter les métastases osseuses tout en préservant la structure tissulaire initiale. Dans ce contexte, la PDT est une alternative prometteuse. D’un point de vue simpliste, la PDT est composée de deux composants de base : (1) un colorant photosensible non toxique appelé photosensibilisateur (PS) et (2) une so...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions nos co-auteurs des publications originales pour leur aide et leur soutien.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
300 s metered card for PDTIlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USAn/ahttp://www.illuminoss.com
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizerSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAA779310 mg
6 Well platesGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany657160
8 Well Chamber SlidesSARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany94.6140.802
96 Well plates (F-buttom)Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany655180
CellTiter 96 Aqueous One
Solution Cell Proliferation
Assay (MTS-Assay)		Promega, Fitchburg,
Wisconsin, USA		G3580
Cellular Senescence AssayBiotrend Chemikalien GmbH, Köln, GermanyCBA-231Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA350550.5% (w/v)
Culture-Inserts 2Wellibidi GmbH, Gräfelfing, Germany80209
DMEM (1x) + GlutaMax-ILife Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA31966-021
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USAF7524
Fluorescence microplate readerPromega, Madison, Wisconsin, USAGlowMAx®,
GM3510
HemocytometerHecht Assistent, Sondheim, Deutschland4042
ImageJNational Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USAImageJ (version: 1.53a)Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/
Inverse phase-contrast microscopeLeica, Wetzlar, GermanyDM IMBRE 100
Methanol AnulaR NormapurVWR, Fontenay-Sous-Bois, France20847.307
ParaformaldehydSigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA158127Powder, 95% purity
PDT device (light box and accesories)IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USAn/aBlue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA15140-12210,000 U/mL Penicillin
10,000 μg/mL Streptomycin
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA10010-015
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA21875034
Spectrophotomete/ microplate readerBioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, GermanyEL800
Trypan Blue dye 0.4%Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USAT8154
Trypsin-EDTA 10xSigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USAT4174

Références

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