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Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Ce protocole présente une approche méthodologique étape par étape de l’exposition de lignées de cellules métastatiques osseuses et de tumeurs osseuses primaires à une thérapie photodynamique médiée par l’acide 5-aminolévulinique (PDT). Les effets sur le potentiel de migration cellulaire/invasivité, la viabilité, l’apoptose et le potentiel de sénescence sont également analysés après l’exposition à la PDT.
Les métastases osseuses sont associées à un mauvais pronostic et à une faible qualité de vie pour les patients touchés. La thérapie photodynamique (PDT) apparaît comme une thérapie non invasive qui peut cibler les lésions osseuses métastatiques locales. Cet article présente une méthode in vitro pour étudier l’effet PDT dans des lignées cellulaires adhérentes. À cette fin, nous démontrons une approche étape par étape pour soumettre à la fois des lignées cellulaires primaires (tumeur osseuse à cellules géantes) et métastatiques osseuses humaines (dérivées d’un carcinome du sein canalaire invasif primaire et d’un carcinome rénal) à la PDT médiée par l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA).
Après 24 h après l’irradiation 5-ALA-PDT (longueur d’onde de la lumière bleue 436 nm), l’effet thérapeutique a été évalué en termes de potentiel de migration cellulaire, de viabilité, de caractéristiques apoptotiques et d’arrêt de la croissance cellulaire (sénescence). Après l’irradiation de la 5-ALA-PDT, les lignées cellulaires dérivées de l’appareil locomoteur réagissent différemment aux mêmes doses et à la même exposition à la PDT. Selon l’étendue des dommages cellulaires déclenchés par l’exposition à la PDT, deux destins cellulaires différents, l’apoptose et la sénescence, ont été notés. La sensibilité variable à la thérapie PDT entre différentes lignées cellulaires de cancer osseux fournit des informations utiles pour sélectionner des paramètres PDT plus appropriés en milieu clinique. Ce protocole est conçu pour illustrer l’utilisation de la PDT dans le contexte des lignées cellulaires néoplasiques musculo-squelettiques. Il peut être ajusté pour étudier l’effet thérapeutique de la PDT sur diverses lignées cellulaires cancéreuses et divers photosensibilisants et sources lumineuses.
Les options thérapeutiques pour les métastases osseuses sont encore limitées et difficiles malgré les développements en cours dans le traitement oncologique. La méthode standard actuelle est la radiothérapie, qui est associée à des complications telles qu’un érythème local, une toxicité pour les organes internes1 et des fractures insuffisantes2. Il est nécessaire de recourir à des thérapies antinéoplasiques alternatives, car les patients atteints de métastases osseuses souffrent souvent de douleur, d’hypercalcémie et de symptômes neurologiques qui entraînent une mobilité réduite et une qualité de vieréduite3. Des découvertes récentes démontrent que la PDT offre une option de traitement antinéoplasique alternative prometteuse pour cibler directement les lésions osseuses, qui peut être utilisée seule ou en soutien à la radiothérapie4.
Le mécanisme de la PDT est essentiellement basé sur un transfert d’énergie d’un composé photosensible excité par la lumière (photosensibilisant) à l’oxygène tissulaire. Ce photosensibilisateur fonctionne de la même manière qu’un condensateur à un niveau nanoscopique. Il peut stocker de l’énergie dans un état fondamental lorsqu’il est irradié avec une longueur d’onde de lumière appropriée et libérer de l’énergie stockée lorsqu’il revient d’un état excité à l’état fondamental d’origine5. L’énergie libérée entraîne deux réactions photochimiques : l’une est la transformation de l’oxygène en radicaux oxygénés réactifs par transfert d’hydrogène ou d’un électron. La seconde est la production de particules d’oxygène singulet par transfert d’énergie horizontal du substrat photosensibilisant aux particules d’oxygène triplets locales6. Les radicaux réactifs de l’oxygène et les molécules d’oxygène singulet ont des effets hautement cytotoxiques sur les cellules tumorales locales et induisent une occlusion vasculaire et une réponse inflammatoire locale par apoptose des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins tumoraux7.
Les photosensibilisants conventionnels sont des dérivés de la famille des porphyrines tels que les hématoporphyrines et les benzoporphyrines8. L’application de substances photosensibilisantes ayant une affinité plus élevée pour le tissu tumoral peut augmenter la sélectivité de la PDTà 9 ans. En particulier, le 5-ALA, qui est un précurseur biosynthétique de la protoporphyrine IX, peut s’accumuler dans les cellules tumorales telles que la kératose actinique, le carcinome basocellulaire, la tumeur de la vessie et le cancer gastro-intestinal5. Différentes approches d’administration utilisant le 5-ALA peuvent également faire varier l’efficacité de la PDT par rapport à la localisation tumorale. Ainsi, l’utilisation topique de 5-ALA avec l’application de PDT est devenue le traitement dermatologique de première intention contre la kératose actinique10. Des résultats récents pour les métastases osseuses de lignées cellulaires invasives de cancer canalaire du sein indiquent une possible inhibition de la migration cellulaire et l’induction de l’apoptose après exposition à la PDT avec du 5-ALA11. Cependant, l’utilisation de la PDT dans les tissus humains subfasciaux tels que le tissu osseux en est encore à son stade préclinique à expérimental, car l’efficacité doit être améliorée. Les applications des nanoparticules avec la thérapie par la lumière montrent déjà un grand impact en dentisterie12. Ainsi, il est probable que la combinaison de l’utilisation de nanoparticules avec la PDT élargira son champ d’application vers l’oncologie orthopédique.
Le protocole suivant décrit comment préparer à la fois les cellules provenant de tumeurs osseuses primitives et de lignées cellulaires de métastases osseuses et les soumettre à une PDT médiée par le 5-ALA pour une exposition de temps prédéfinie. Une description détaillée de la façon d’effectuer et d’évaluer le potentiel de migration cellulaire, la vitalité et la sénescence après l’irradiation 5-ALA-PDT est également incluse. Les instructions étape par étape offrent une approche simple et concise pour acquérir des données fiables et reproductibles. Les avantages, les limites et les perspectives d’avenir de l’approche PDT pour les lésions néoplasiques osseuses sont également discutés.
Trois types différents de lignées cellulaires ont été utilisés : « MAM » - une lignée cellulaire provenant de métastases osseuses d’un carcinome à cellules rénales, « MAC » - métastases osseuses d’un carcinome canalaire invasif du sein, et « 17-1012 » - une tumeur osseuse à cellules géantes. Des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées de la moelle épinière ont été utilisées comme groupe témoin. L’approbation institutionnelle et éthique a été obtenue avant le début de l’étude (numéro de projet : 008/2014BO2 pour les lignées cellulaires cancéreuses et numéro de projet : 401/2013 BO2 pour les CSM).
1. Culture cellulaire
REMARQUE : Les milieux de culture peuvent être préparés à l’avance. Le milieu de culture pour MAM et 17-1012 est constitué de RPMI complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 2 mM de L-glutamine. Le milieu de culture pour les CMA et les CSM est constitué d’un milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec substitut de glutamine (voir le tableau des matières), de 4,5 g/L de D-glucose complété par 10 % (v/v) de FBS.
2. Configuration et exposition PDT
3. Essai de migration
4. Essai de viabilité
5. Essai d’arrêt de croissance cellulaire/sénescence (activité de la β-galactosidase (β-gal))
REMARQUE : Tous les réactifs et tampons utilisés ici ont été fournis dans le kit de dosage (voir le tableau des matériaux).
Après une exposition à la PDT 5-ALA, le groupe témoin MSC n’a montré aucun effet notable en termes de migration après irradiation PDT 5-ALA (Figure 2A, i, v, ix). En revanche, les cellules MAC (figure 1B et figure 2A, iii, vii, xi) et les cellules 17-1012 (figure 1B et figure 2A, ii, vi, x
Malgré les options de traitement actuelles, la réponse thérapeutique du cancer est variable, plaidant en faveur de nouvelles approches ou même de thérapies combinées pour traiter les métastases osseuses tout en préservant la structure tissulaire initiale. Dans ce contexte, la PDT est une alternative prometteuse. D’un point de vue simpliste, la PDT est composée de deux composants de base : (1) un colorant photosensible non toxique appelé photosensibilisateur (PS) et (2) une so...
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Nous remercions nos co-auteurs des publications originales pour leur aide et leur soutien.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
300 s metered card for PDT | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | http://www.illuminoss.com |
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizer | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7793 | 10 mg |
6 Well plates | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
8 Well Chamber Slides | SARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany | 94.6140.802 | |
96 Well plates (F-buttom) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay) | Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA | G3580 | |
Cellular Senescence Assay | Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Germany | CBA-231 | Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay |
Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 35055 | 0.5% (w/v) |
Culture-Inserts 2Well | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 80209 | |
DMEM (1x) + GlutaMax-I | Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | F7524 | |
Fluorescence microplate reader | Promega, Madison, Wisconsin, USA | GlowMAx®, GM3510 | |
Hemocytometer | Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland | 4042 | |
ImageJ | National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA | ImageJ (version: 1.53a) | Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/ |
Inverse phase-contrast microscope | Leica, Wetzlar, Germany | DM IMBRE 100 | |
Methanol AnulaR Normapur | VWR, Fontenay-Sous-Bois, France | 20847.307 | |
Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 158127 | Powder, 95% purity |
PDT device (light box and accesories) | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | Blue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15140-122 | 10,000 U/mL Penicillin 10,000 μg/mL Streptomycin |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10010-015 | |
RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21875034 | |
Spectrophotomete/ microplate reader | BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany | EL800 | |
Trypan Blue dye 0.4% | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | T8154 | |
Trypsin-EDTA 10x | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | T4174 |
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