5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法治疗原发性骨肿瘤和骨转移细胞系

摘要

该方案提出了一种循序渐进的方法，将骨转移细胞系和原发性骨肿瘤暴露于 5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法 （PDT）。还分析了 PDT 暴露后对细胞迁移电位/侵袭性、活力、细胞凋亡和衰老潜力的影响。

摘要

骨转移与受影响患者的不良预后和低生活质量有关。光动力疗法 （PDT） 是一种无创疗法，可以针对局部转移性骨病变。本文 提出了一种体外 方法来研究贴壁细胞系中 PDT 效应。为此，我们展示了一种循序渐进的方法，将原发性（巨细胞骨肿瘤）和人骨转移性癌细胞系（来源于原发性浸润性导管乳腺癌和肾癌）置于 5-氨基乙酰丙酸 （5-ALA） 介导的 PDT 中。

5-ALA-PDT 照射后 24 小时（蓝光波长 436 nm）后，根据细胞迁移电位、活力、凋亡特征和细胞生长停滞（衰老）评估治疗效果。5-ALA-PDT 照射后，肌肉骨骼衍生的细胞系对相同剂量和暴露的 PDT 反应不同。根据 PDT 暴露触发的细胞损伤程度，注意到两种不同的细胞命运 - 细胞凋亡和衰老。不同骨癌细胞系对 PDT 治疗的敏感性不同，为在临床环境中选择更合适的 PDT 设置提供了有用的信息。该协议旨在举例说明在肌肉骨骼肿瘤细胞系背景下使用 PDT。可以对其进行调整以研究 PDT 对各种癌细胞系和各种光敏剂和光源的治疗效果。

引言

尽管肿瘤治疗不断发展，但骨转移的治疗选择仍然有限且具有挑战性。目前的标准方法是放疗，它与局部红斑、对内脏器官的毒性¹ 和骨折不足² 等并发症有关。需要替代的抗肿瘤疗法，因为骨转移患者经常患有疼痛、高钙血症和神经系统症状，导致活动能力受损和生活质量下降³。最近的研究结果表明，PDT 提供了一种有前途的替代抗肿瘤治疗选择，可以直接针对骨病变，可以单独使用或支持放疗⁴。

PDT 的机制本质上是基于从光激发的光敏化合物（光敏剂）到组织氧的能量转移。这种光敏剂的工作原理类似于纳米级的电容器。当用适当波长的光照射时，它可以在基态存储能量，当它从激发态返回到原始基态时，它可以释放存储的能量⁵。释放的能量导致两个光化学反应：一个是通过转移氢或电子将氧转化为活性氧自由基。第二种是通过从光敏剂底物向局部三重态氧粒子的水平能量转移来产生单重态氧颗粒⁶。活性氧自由基和单线态氧分子对局部肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用，并通过肿瘤血管内皮细胞凋亡诱导血管闭塞和局部炎症反应⁷。

常规光敏剂是卟啉家族的衍生物，例如血卟啉和苯并卟啉⁸。将具有较高亲和力的光敏剂物质应用于肿瘤组织可以增加 PDT⁹ y 的选择性。特别是，5-ALA 是原卟啉 IX 的生物合成前体，可在光化性角化病、基底细胞癌、膀胱瘤和胃肠道癌等肿瘤细胞中积累⁵。使用 5-ALA 的不同递送方法也会改变 PDT 与肿瘤定位相关的效率。因此，局部使用 5-ALA 并应用 PDT 成为针对光化性角化病的一线皮肤病疗法¹⁰。侵袭性导管乳腺癌细胞系骨转移的最新结果表明，暴露于 5-ALA¹¹ 的 PDT 后可能抑制细胞迁移和诱导细胞凋亡。 然而，由于疗效有待提高，在筋膜下组织（如骨组织）中使用 PDT 仍处于临床前到实验临床阶段。纳米颗粒与基于光的疗法的应用已经在牙科中显示出巨大的影响¹²。因此，纳米颗粒与 PDT 的结合可能会将其应用范围扩大到骨科肿瘤学。

以下方案描述了如何制备源自原发性骨肿瘤和骨转移细胞系的细胞，并将它们进行 5-ALA 介导的 PDT 以获得预定的暴露时间。还包括有关如何执行和评估 5-ALA-PDT 照射后细胞迁移潜力、活力和衰老的详细说明。分步说明提供了一种简单明了的方法来获取可靠且可重现的数据。还讨论了 PDT 方法治疗骨肿瘤病变的优势、局限性和未来前景。

研究方案

采用了三种不同类型的细胞系：“MAM”——起源于肾细胞癌骨转移的细胞系，“MAC”——浸润性导管乳腺癌的骨转移，和“17-1012”——骨巨细胞瘤。以骨髓间充质干细胞 （MSCs） 为对照组。在研究开始前已获得机构和伦理批准（项目编号：008/2014BO2-用于癌细胞系，项目编号：401/2013 BO2 用于 MSC）。

1. 细胞培养

注意：培养基可以提前制备。MAM 和 17-1012 的培养基由补充有 10% （v/v） 胎牛血清 （FBS） 和 2 mM L-谷氨酰胺的 RPMI 组成。MAC 和 MSC 的培养基由含谷氨酰胺替代品的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）（参见 材料表）、补充有 10% （v/v） FBS 的 4.5 g/L D-葡萄糖组成。

1. 收获并传代细胞，直至达到 80% 汇合。
2. 用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞，并使用移液管从培养瓶中吸出 PBS。
   注：此步骤可确保去除残留的含有蛋白酶抑制剂的完全培养基。
3. 加入 3 mL 0.05% （v/v） 胰蛋白酶-EDTA，使贴壁细胞从培养瓶底部解离。
4. 将培养瓶在 37 °C 下，在 5% CO₂ 的潮湿环境中孵育 5 分钟。
5. 在相差显微镜下观察细胞脱离。
   注：必须针对每种细胞类型调整孵育时间。防止细胞长时间暴露于胰蛋白酶溶液中（>10 分钟）。
6. 通过添加 3 mL 培养基来终止胰蛋白酶消化。
   注：确保为含有 10% （v/v） FBS 的每种细胞类型添加合适的培养基。
7. 将分离的细胞转移到离心管中，并在 7 °C 下以 350 × g 离心 7 分钟。
8. 丢弃上清液。
9. 重悬细胞沉淀在 1 mL 培养基中，并使用血细胞计数器对细胞进行计数，如前所述¹³。

2. PDT 设置和曝光

1. 通过插入所有电缆和附件来准备 PDT 设备（参见 材料表）。
2. 调暗房间内的光线，以避免不必要的光线消散。
3. 借助管道胶带直接在孔板顶部定位和稳定轻纤维。
   注意：需要光纤维均匀分布在孔的顶部，以确保所有细胞都受到照射并接收相同数量的能量（图 1）。
4. 确保不要严重弯曲或损坏光纤，因为这可能会导致光强度降低。
5. 用铝箔覆盖孔板，以尽量减少光耗散。
6. 按下 ON/OFF 开关按钮打开 PDT 设备。
7. 将按流量计费的卡插入 PDT 设备正面的插槽中。
   注意： 设备随附一张对应于 300 秒曝光时间的测光卡。额外的 2,000 s 程序自动集成到 PDT 设备中。对于这两个曝光时间，光线在指定时间内以连续输出模式传输。
8. 确保 PDT 灯箱显示屏上的计时器更改为计量卡上指示的规定时间。
9. 通过踩下内置的脚踏板开始 PDT 治疗。
   注意： 设备中集成了自动停止功能，系统会自动运行。在循环完成之前，请勿停止光过程或移除光光纤。在光周期结束时，光源快门关闭，不再提供光线。

3. 迁移测定

1. 接种细胞如下：将 2 × 10⁴ 个细胞 - MAC、1 × 10^{个 4} 细胞 - MAM、3 x 10⁴ - 17-1012 和 2.5 × 10⁴ - MSC 接种到每个 2 室培养插入物中，整合到不透明的 F 底 6 孔板中。
2. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 24 小时。之后取下插件。
   注意：为了获得迁移和初始无偏间隙大小的起始参考点，采用一个单独的板，该板不会进一步进行 5-ALA-PDT 暴露（步骤 3.3-3.4），而是直接染色和定量（步骤 3.5-3.12）。
3. 用含有 1 mM 5-ALA 的新鲜无 FBS 培养基替换培养基。
4. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 4 小时。
   注意：作为对照，额外的孔应同时用不含 5-ALA 的培养基覆盖。
5. 如第 2 节所示，在连续输出模式下用蓝光（436 nm，36 J/cm²）对细胞进行 PDT，预定的时间范围为 300 秒或 2,000 秒。
   注：应使用未经 PDT 暴露的板作为对照。
6. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 24 小时。
   注意：定期检查细胞以评估每种细胞类型的迁移程度。这必须针对每个细胞系进行优化。
7. 用 1.5 mL PBS 洗涤细胞，然后完全去除 PBS。
8. 通过添加细胞并用 1.5 mL 4% （v/v） 多聚甲醛的 PBS 溶液孵育 10 分钟来固定细胞。
9. 加入 1.5 mL 70% （v/v） 乙醇并孵育 10 分钟。
10. 丢弃乙醇，让板在室温下风干 10 分钟。
11. 将细胞与 1.5 mL 的 0.2% （v/v） 考马斯蓝染料在 90% （v/v） 乙醇中孵育 20 分钟。
12. 用双蒸水清洗板。
    注意：要彻底清洗板并清除残留的碎屑，请将板完全浸入干净的双蒸水中 2-3 次。
13. 让板在室温下风干 24 小时。
    注意：在此阶段，干燥的板可以在室温下储存至少几周。
14. 使用反相差显微镜以 10 倍放大倍率观察和拍摄细胞迁移到间隙中的过程。
    注意：在 5-ALA-PDT 暴露后长达 24 小时内观察和拍摄活细胞的迁移。但是，固定的细胞可以储存并在以后拍照。
15. 如前所述，以所需格式导出图像并使用用于处理和分析科学图像的软件量化差距¹⁴。

4. 活力检测

1. 将所有细胞以 1.5 × 10⁴ 的密度接种在 50 μL 培养基中的 96 孔板中。
2. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 下在标准细胞培养箱中孵育 24 小时。
3. 再添加 50 μL 不含 FBS 的培养基，其中含有终浓度为 1 mM 的 5-ALA。
4. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 下在标准细胞培养箱中孵育 4 小时。
   注：使用 2 倍浓度，因为细胞已经被 50 μL 培养基覆盖。应包括含培养基的对照品。
5. 如第 2 节所示，在连续输出模式下用蓝光（436 nm，36 J/cm²）对细胞进行 PDT 暴露，预定的时间范围为 300 秒或 2,000 秒。
   注意：还应包括未受 PDT 暴露的阴性对照。
6. 将辐照细胞在 37 °C、5% CO₂ 下在标准细胞培养箱中孵育 24 小时。
7. 将 15 μL MTS 试剂添加到细胞上，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育细胞 90 分钟。
8. 用分光光度计读数器在 490 nm 的波长下测量吸光度。

5. 细胞生长停滞/衰老测定（β-半乳糖苷酶 （β-Gal） 活性）

注：此处使用的所有试剂和缓冲液均在检测试剂盒中提供（参见 材料表）。

1. 在 100 μL 培养基中，以 1.5 × 10⁴ 的密度在 96 孔板中接种细胞。将细胞在标准细胞培养箱中孵育 24 小时，37 °C，5% CO₂ 。
2. 加入 100 μL 新鲜的无 FBS 培养基和终浓度为 1 mM 的 5-ALA，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 4 小时。
   注意：作为对照，单独的孔应同时用不含 5-ALA 光敏剂的新鲜培养基覆盖。
3. 如第 2 节所示，在连续输出模式下用蓝光（436 nm，36 J/cm²）对细胞进行 PDT 暴露，预定的时间范围为 300 秒或 2,000 秒。
   注意：还应包括未暴露于 PDT 的阴性对照板。
4. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 下在标准细胞培养箱中孵育 24 小时。
5. 丢弃培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。
6. 用 100 μL 的 1x 细胞裂解缓冲液覆盖细胞，并在 4 °C 下孵育 5 分钟。
7. 将裂解物在 4 °C 下以 350 × g 1 离心 10 分钟，并收集上清液。
8. 将 50 μL 上清液移液到新的 96 孔板中，再加入 50 μL 2x 检测缓冲液。
9. 将新的 96 孔板置于 37 °C 培养箱中 1.5 小时。
   注意：应避光保护肉馅饼以避免光漂白。
10. 将 50 μL 混合物转移到壁不透明的 96 孔板中，并加入 200 μL 终止液。
11. 用荧光酶标仪在 360 nm 激发/465 nm 发射下测量吸光度。

结果

在 5-ALA PDT 暴露后，MSC 对照组在 5-ALA PDT 照射后的迁移方面没有显示出显着影响（图 2A、i、v、ix）。相比之下，MAC 细胞 （图 1B 和 图 2A， iii， vii， 习） 和 17-1012 （图 1B 和 图 2A， ii， vi， x） 细胞在 300 秒或 2,000 秒曝?...

讨论

尽管目前的治疗方案多种多样，但癌症治疗反应是可变的，倡导采用新方法甚至联合疗法来治疗骨转移，同时保留初始组织结构。在这种情况下，PDT 是一个很有前途的替代方案。简单来说，PDT 由两个基本成分组成：（1） 一种称为光敏剂 （PS） 的无毒光敏染料和 （2） 与 PS 的吸收光谱相匹配的适当波长的外部光源并激活它¹⁵。在这项研究中，我们研究?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 s metered card for PDT	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	http://www.illuminoss.com
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizer	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7793	10 mg
6 Well plates	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	657160
8 Well Chamber Slides	SARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany	94.6140.802
96 Well plates (F-buttom)	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	655180
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay)	Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA	G3580
Cellular Senescence Assay	Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Germany	CBA-231	Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	35055	0.5% (w/v)
Culture-Inserts 2Well	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	80209
DMEM (1x) + GlutaMax-I	Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA	31966-021
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	F7524
Fluorescence microplate reader	Promega, Madison, Wisconsin, USA	GlowMAx®, GM3510
Hemocytometer	Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland	4042
ImageJ	National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA	ImageJ (version: 1.53a)	Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/
Inverse phase-contrast microscope	Leica, Wetzlar, Germany	DM IMBRE 100
Methanol AnulaR Normapur	VWR, Fontenay-Sous-Bois, France	20847.307
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	158127	Powder, 95% purity
PDT device (light box and accesories)	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	Blue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	15140-122	10,000 U/mL Penicillin 10,000 μg/mL Streptomycin
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	10010-015
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	21875034
Spectrophotomete/ microplate reader	BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany	EL800
Trypan Blue dye 0.4%	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T8154
Trypsin-EDTA 10x	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T4174