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Method Article
* Estes autores contribuíram igualmente
Este protocolo apresenta uma abordagem metodológica passo a passo da exposição de linhagens de células metastáticas ósseas e tumores ósseos primários à terapia fotodinâmica (PDT) mediada por ácido 5-aminolevulínico. Os efeitos sobre o potencial de migração celular / invasividade, viabilidade, apoptose e potencial de senescência também são analisados após a exposição à PDT.
As metástases ósseas estão associadas a mau prognóstico e baixa qualidade de vida para os pacientes afetados. A terapia fotodinâmica (TFD) surge como uma terapia não invasiva que pode atingir lesões ósseas metastáticas locais. Este trabalho apresenta um método in vitro para estudar o efeito da TFD em linhagens celulares aderentes. Para este fim, demonstramos uma abordagem passo a passo para submeter linhagens celulares de câncer metastático primário (tumor ósseo de células gigantes) e ósseo humano (derivadas de um carcinoma ductal primário invasivo de mama e carcinoma renal) a PDT mediada por ácido 5-aminolevulínico (5-ALA).
Após 24 h após a irradiação de 5-ALA-PDT (comprimento de onda de luz azul de 436 nm), o efeito terapêutico foi avaliado em termos de potencial de migração celular, viabilidade, características apoptóticas e parada do crescimento celular (senescência). Após a irradiação de 5-ALA-PDT, as linhagens celulares derivadas do músculo-esqueleto respondem de maneira diferente às mesmas doses e exposição à PDT. Dependendo da extensão do dano celular desencadeado pela exposição à PDT, dois destinos celulares diferentes - apoptose e senescência foram observados. A sensibilidade variável à terapia PDT entre diferentes linhagens celulares de câncer ósseo fornece informações úteis para selecionar configurações de PDT mais apropriadas em ambientes clínicos. Este protocolo foi desenvolvido para exemplificar o uso de PDT no contexto de linhagens celulares neoplásicas musculoesqueléticas. Pode ser ajustado para investigar o efeito terapêutico da PDT em várias linhagens de células cancerígenas e vários fotossensibilizadores e fontes de luz.
As opções terapêuticas para metástases ósseas ainda são limitadas e desafiadoras, apesar dos desenvolvimentos contínuos no tratamento oncológico. O método padrão atual é a radioterapia, que está associada a complicações como eritema local, toxicidade para órgãos internos1 e fraturas insuficientes2. Há necessidade de terapias antineoplásicas alternativas, pois pacientes com metástases ósseas frequentemente sofrem de dor, hipercalcemia e sintomas neurológicos que resultam em mobilidade prejudicada e redução da qualidade de vida3. Descobertas recentes demonstram que a TFD oferece uma opção de tratamento antineoplásico alternativa e promissora para atingir diretamente as lesões ósseas, que podem ser usadas isoladamente ou de suporte à radioterapia4.
O mecanismo da TFD é essencialmente baseado em uma transferência de energia de um composto fotossensível excitado pela luz (fotossensibilizador) para o oxigênio do tecido. Este fotossensibilizador funciona de forma semelhante a um capacitor em nível nanoscópico. Ele pode armazenar energia em um estado fundamental quando irradiado com um comprimento de onda apropriado de luz e libera energia armazenada quando retorna de um estado excitado para o estado fundamental original5. A energia liberada leva a duas reações fotoquímicas: uma é a transformação do oxigênio em radicais reativos de oxigênio pela transferência de hidrogênio ou um elétron. A segunda é a produção de partículas de oxigênio singlete por transferência horizontal de energia do substrato fotossensibilizador para partículas locais de oxigênio tripleto6. Os radicais reativos de oxigênio e as moléculas singlete de oxigênio têm efeitos altamente citotóxicos nas células tumorais locais e induzem oclusão vascular e resposta inflamatória local por apoptose de células endoteliais de vasos sanguíneos tumorais7.
Os fotossensibilizadores convencionais são derivados da família das porfirinas, como as hematoporfirinas e as benzoporfirinas8. A aplicação de substâncias fotossensibilizadoras com maior afinidade ao tecido tumoral pode aumentar a seletividade da TFD9 anos. Em particular, o 5-ALA, que é um precursor biossintético da protoporfirina IX, pode se acumular em células tumorais, como ceratose actínica, carcinoma basocelular, tumor de bexiga e câncer gastrointestinal5. Diferentes abordagens de entrega usando 5-ALA também podem variar a eficiência da PDT em relação à localização do tumor. Assim, o uso tópico de 5-ALA com a aplicação de TFD tornou-se a terapia dermatológica de primeira linha contra a ceratose actínica10. Resultados recentes para metástases ósseas de linhagens celulares invasivas de câncer de mama ductal indicam possível inibição da migração celular e indução de apoptose após exposição à TFD com 5-ALA11. No entanto, o uso de PDT em tecido humano subfascial, como tecido ósseo, ainda está em seu estágio clínico pré-clínico a experimental, pois a eficácia precisa ser melhorada. Aplicações de nanopartículas com terapia à base de luz já apresentam grande impacto na odontologia12. Assim, é provável que a combinação do uso de nanopartículas com PDT expanda sua gama de aplicações para a oncologia ortopédica.
O protocolo a seguir descreve como preparar células originárias de tumores ósseos primários e linhas celulares de metástases ósseas e submetê-las a PDT mediada por 5-ALA por um tempo de exposição predefinido. Uma descrição detalhada de como realizar e avaliar o potencial de migração celular, vitalidade e senescência após a irradiação de 5-ALA-PDT também está incluída. As instruções passo a passo fornecem uma abordagem direta e concisa para adquirir dados confiáveis e reprodutíveis. As vantagens, limitações e perspectivas futuras da abordagem da TFD para lesões neoplásicas ósseas também são discutidas.
Três tipos diferentes de linhagens celulares foram empregadas: "MAM" - uma linha celular originada de metástases ósseas de carcinoma de células renais, "MAC" - metástases ósseas de um carcinoma ductal invasivo de mama e "17-1012" - um tumor de células gigantes do osso. Células-tronco mesenquimais derivadas da medula (MSCs) foram usadas como grupo controle. A aprovação institucional e ética foi obtida antes do início do estudo (número do projeto: 008/2014BO2 - para as linhagens de células cancerígenas e número do projeto: 401/2013 BO2 para MSCs).
1. Cultura de células
NOTA: Os meios de cultura podem ser preparados com antecedência. O meio de cultura para MAM e 17-1012 consiste em RPMI suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 2 mM de L-glutamina. O meio de cultura para CAM e MSCs consiste no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com substituto de glutamina (ver Tabela de Materiais), 4,5 g/L de D-glicose suplementado com 10% (v/v) de FBS.
2. Configuração e exposição do PDT
3. Ensaio de migração
4. Ensaio de viabilidade
5. Ensaio de parada / senescência do crescimento celular (atividade de β-galactosidase (β-Gal))
NOTA: Todos os reagentes e tampões usados aqui foram fornecidos no kit de ensaio (consulte a Tabela de Materiais).
Após a exposição ao 5-ALA PDT, o grupo controle MSC não mostrou nenhum efeito notável em termos de migração após a irradiação do 5-ALA PDT (Figura 2A, i, v, ix). Em contraste, as células MAC (Figura 1B e Figura 2A, iii, vii, xi) e 17-1012 (Figura 1B e Figura 2A, ii, vi, x) exibir...
Apesar das opções de tratamento atuais, a resposta terapêutica do câncer é variável, defendendo novas abordagens ou mesmo terapias combinadas para tratar metástases ósseas, preservando a estrutura inicial do tecido. Nesse contexto, a TFD é uma alternativa promissora. De um ponto de vista simplista, a PDT é composta por dois componentes básicos: (1) um corante sensível à luz não tóxico denominado fotossensibilizador (PS) e (2) uma fonte de luz externa de comprimento de onda...
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecemos aos nossos coautores das publicações originais por sua ajuda e apoio.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
300 s metered card for PDT | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | http://www.illuminoss.com |
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizer | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7793 | 10 mg |
6 Well plates | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
8 Well Chamber Slides | SARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany | 94.6140.802 | |
96 Well plates (F-buttom) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay) | Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA | G3580 | |
Cellular Senescence Assay | Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Germany | CBA-231 | Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay |
Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 35055 | 0.5% (w/v) |
Culture-Inserts 2Well | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 80209 | |
DMEM (1x) + GlutaMax-I | Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | F7524 | |
Fluorescence microplate reader | Promega, Madison, Wisconsin, USA | GlowMAx®, GM3510 | |
Hemocytometer | Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland | 4042 | |
ImageJ | National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA | ImageJ (version: 1.53a) | Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/ |
Inverse phase-contrast microscope | Leica, Wetzlar, Germany | DM IMBRE 100 | |
Methanol AnulaR Normapur | VWR, Fontenay-Sous-Bois, France | 20847.307 | |
Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 158127 | Powder, 95% purity |
PDT device (light box and accesories) | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | Blue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15140-122 | 10,000 U/mL Penicillin 10,000 μg/mL Streptomycin |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10010-015 | |
RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21875034 | |
Spectrophotomete/ microplate reader | BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany | EL800 | |
Trypan Blue dye 0.4% | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | T8154 | |
Trypsin-EDTA 10x | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | T4174 |
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