Terapia fotodinâmica mediada por ácido 5-aminolevulínico em linhas celulares de tumor ósseo primário e metástases ósseas

Resumo

Este protocolo apresenta uma abordagem metodológica passo a passo da exposição de linhagens de células metastáticas ósseas e tumores ósseos primários à terapia fotodinâmica (PDT) mediada por ácido 5-aminolevulínico. Os efeitos sobre o potencial de migração celular / invasividade, viabilidade, apoptose e potencial de senescência também são analisados após a exposição à PDT.

Resumo

As metástases ósseas estão associadas a mau prognóstico e baixa qualidade de vida para os pacientes afetados. A terapia fotodinâmica (TFD) surge como uma terapia não invasiva que pode atingir lesões ósseas metastáticas locais. Este trabalho apresenta um método in vitro para estudar o efeito da TFD em linhagens celulares aderentes. Para este fim, demonstramos uma abordagem passo a passo para submeter linhagens celulares de câncer metastático primário (tumor ósseo de células gigantes) e ósseo humano (derivadas de um carcinoma ductal primário invasivo de mama e carcinoma renal) a PDT mediada por ácido 5-aminolevulínico (5-ALA).

Após 24 h após a irradiação de 5-ALA-PDT (comprimento de onda de luz azul de 436 nm), o efeito terapêutico foi avaliado em termos de potencial de migração celular, viabilidade, características apoptóticas e parada do crescimento celular (senescência). Após a irradiação de 5-ALA-PDT, as linhagens celulares derivadas do músculo-esqueleto respondem de maneira diferente às mesmas doses e exposição à PDT. Dependendo da extensão do dano celular desencadeado pela exposição à PDT, dois destinos celulares diferentes - apoptose e senescência foram observados. A sensibilidade variável à terapia PDT entre diferentes linhagens celulares de câncer ósseo fornece informações úteis para selecionar configurações de PDT mais apropriadas em ambientes clínicos. Este protocolo foi desenvolvido para exemplificar o uso de PDT no contexto de linhagens celulares neoplásicas musculoesqueléticas. Pode ser ajustado para investigar o efeito terapêutico da PDT em várias linhagens de células cancerígenas e vários fotossensibilizadores e fontes de luz.

Introdução

As opções terapêuticas para metástases ósseas ainda são limitadas e desafiadoras, apesar dos desenvolvimentos contínuos no tratamento oncológico. O método padrão atual é a radioterapia, que está associada a complicações como eritema local, toxicidade para órgãos internos¹ e fraturas insuficientes². Há necessidade de terapias antineoplásicas alternativas, pois pacientes com metástases ósseas frequentemente sofrem de dor, hipercalcemia e sintomas neurológicos que resultam em mobilidade prejudicada e redução da qualidade de vida³. Descobertas recentes demonstram que a TFD oferece uma opção de tratamento antineoplásico alternativa e promissora para atingir diretamente as lesões ósseas, que podem ser usadas isoladamente ou de suporte à radioterapia⁴.

O mecanismo da TFD é essencialmente baseado em uma transferência de energia de um composto fotossensível excitado pela luz (fotossensibilizador) para o oxigênio do tecido. Este fotossensibilizador funciona de forma semelhante a um capacitor em nível nanoscópico. Ele pode armazenar energia em um estado fundamental quando irradiado com um comprimento de onda apropriado de luz e libera energia armazenada quando retorna de um estado excitado para o estado fundamental original⁵. A energia liberada leva a duas reações fotoquímicas: uma é a transformação do oxigênio em radicais reativos de oxigênio pela transferência de hidrogênio ou um elétron. A segunda é a produção de partículas de oxigênio singlete por transferência horizontal de energia do substrato fotossensibilizador para partículas locais de oxigênio tripleto⁶. Os radicais reativos de oxigênio e as moléculas singlete de oxigênio têm efeitos altamente citotóxicos nas células tumorais locais e induzem oclusão vascular e resposta inflamatória local por apoptose de células endoteliais de vasos sanguíneos tumorais⁷.

Os fotossensibilizadores convencionais são derivados da família das porfirinas, como as hematoporfirinas e as benzoporfirinas⁸. A aplicação de substâncias fotossensibilizadoras com maior afinidade ao tecido tumoral pode aumentar a seletividade da TFD⁹ anos. Em particular, o 5-ALA, que é um precursor biossintético da protoporfirina IX, pode se acumular em células tumorais, como ceratose actínica, carcinoma basocelular, tumor de bexiga e câncer gastrointestinal⁵. Diferentes abordagens de entrega usando 5-ALA também podem variar a eficiência da PDT em relação à localização do tumor. Assim, o uso tópico de 5-ALA com a aplicação de TFD tornou-se a terapia dermatológica de primeira linha contra a ceratose actínica¹⁰. Resultados recentes para metástases ósseas de linhagens celulares invasivas de câncer de mama ductal indicam possível inibição da migração celular e indução de apoptose após exposição à TFD com 5-ALA¹¹. No entanto, o uso de PDT em tecido humano subfascial, como tecido ósseo, ainda está em seu estágio clínico pré-clínico a experimental, pois a eficácia precisa ser melhorada. Aplicações de nanopartículas com terapia à base de luz já apresentam grande impacto na odontologia¹². Assim, é provável que a combinação do uso de nanopartículas com PDT expanda sua gama de aplicações para a oncologia ortopédica.

O protocolo a seguir descreve como preparar células originárias de tumores ósseos primários e linhas celulares de metástases ósseas e submetê-las a PDT mediada por 5-ALA por um tempo de exposição predefinido. Uma descrição detalhada de como realizar e avaliar o potencial de migração celular, vitalidade e senescência após a irradiação de 5-ALA-PDT também está incluída. As instruções passo a passo fornecem uma abordagem direta e concisa para adquirir dados confiáveis e reprodutíveis. As vantagens, limitações e perspectivas futuras da abordagem da TFD para lesões neoplásicas ósseas também são discutidas.

Protocolo

Três tipos diferentes de linhagens celulares foram empregadas: "MAM" - uma linha celular originada de metástases ósseas de carcinoma de células renais, "MAC" - metástases ósseas de um carcinoma ductal invasivo de mama e "17-1012" - um tumor de células gigantes do osso. Células-tronco mesenquimais derivadas da medula (MSCs) foram usadas como grupo controle. A aprovação institucional e ética foi obtida antes do início do estudo (número do projeto: 008/2014BO2 - para as linhagens de células cancerígenas e número do projeto: 401/2013 BO2 para MSCs).

1. Cultura de células

NOTA: Os meios de cultura podem ser preparados com antecedência. O meio de cultura para MAM e 17-1012 consiste em RPMI suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 2 mM de L-glutamina. O meio de cultura para CAM e MSCs consiste no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com substituto de glutamina (ver Tabela de Materiais), 4,5 g/L de D-glicose suplementado com 10% (v/v) de FBS.

1. Colher e passar células até atingir 80% de confluência.
2. Lave as células com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e aspire o PBS do frasco usando uma pipeta.
   NOTA: Esta etapa garante a remoção do meio completo residual contendo inibidores de protease.
3. Adicione 3 mL de tripsina-EDTA a 0,05% (v / v) para dissociar as células aderentes do fundo do frasco em que são cultivadas.
4. Incubar os frascos durante 5 min a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO₂.
5. Observe o descolamento da célula sob um microscópio de contraste de fase.
   NOTA: O tempo de incubação deve ser ajustado para cada tipo de célula. Prevenir a exposição celular à solução de tripsina por períodos mais longos (>10 min).
6. Pare a tripsinização adicionando 3 mL de meio de cultura.
   NOTA: Certifique-se de adicionar o meio de cultura apropriado para cada tipo de célula contendo 10% (v/v) de FBS.
7. Transferir as células separadas para um tubo de centrifugação e centrifugá-las durante 7 min a 350 × g a 7 °C.
8. Descarte o sobrenadante.
9. Ressuspenda o pellet de células em 1 mL de meio de cultura e conte as células usando um hemocitômetro conforme descrito anteriormente¹³.

2. Configuração e exposição do PDT

1. Prepare o dispositivo PDT (consulte a Tabela de Materiais) conectando todos os cabos e acessórios.
2. Diminua a luz na sala para evitar dissipação de luz desnecessária.
3. Posicione e estabilize a fibra leve com o auxílio de fita adesiva diretamente no topo da placa do poço.
   NOTA: Uma distribuição uniforme das fibras leves no topo dos poços é desejada para garantir que todas as células sejam irradiadas e recebam a mesma quantidade de energia (Figura 1).
4. Certifique-se de não dobrar ou danificar severamente a fibra leve, pois isso pode levar a uma redução na intensidade da luz.
5. Cubra as placas do poço com papel alumínio para minimizar a dissipação de luz.
6. Ligue o dispositivo PDT pressionando o botão ON/OFF .
7. Insira o cartão medido no slot na parte frontal do dispositivo PDT.
   NOTA: Um cartão medido é fornecido com o dispositivo correspondente ao tempo de exposição de 300 s. Um programa adicional de 2.000 s é integrado automaticamente ao dispositivo PDT. Para ambos os tempos de exposição, a luz é fornecida em modo de saída contínua durante os períodos indicados.
8. Certifique-se de que o temporizador no visor da caixa de luz PDT mude para o tempo prescrito indicado no cartão medido.
9. Inicie o tratamento PDT pressionando o pedal incorporado.
   NOTA: Uma função de parada automática é incorporada ao dispositivo e o sistema funciona automaticamente. Não interrompa o processo de luz ou remova a fibra leve antes da conclusão do ciclo. Na conclusão do ciclo de luz, o obturador da fonte de luz é fechado e nenhuma outra luz é fornecida.

3. Ensaio de migração

1. Células-semente da seguinte forma: 2 × 10⁴ células - MAC, 1 × 10⁴ células - MAM, 3 x 10⁴ - 17-1012 e 2,5 × 10⁴ - MSCs em cada inserção de cultura de 2 câmaras integrada em placas opacas de fundo F de 6 poços.
2. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO₂ por 24 h. Remova as inserções depois.
   NOTA: Para ter um ponto de referência inicial para a migração e o tamanho inicial da lacuna imparcial, uma placa separada, que não será submetida a mais exposição a 5-ALA-PDT (etapas 3.3-3.4), mas diretamente corada e quantificada (etapas 3.5-3.12), é empregada.
3. Substitua o meio por meio fresco sem FBS contendo 1 mM de 5-ALA.
4. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 4 h.
   NOTA: Como controles, poços adicionais devem ser cobertos concomitantemente com meio sem 5-ALA.
5. Sujeitar as células a PDT com luz azul (436 nm, 36 J/^cm2) em modo de saída contínua para períodos de tempo predefinidos de 300 s ou 2.000 s, conforme indicado na seção 2.
   NOTA: As placas que não estão sujeitas à exposição à PDT devem ser empregadas como controles.
6. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO₂ por 24 h.
   NOTA: Verifique as células periodicamente para avaliar o grau de migração para cada tipo de célula. Isso deve ser otimizado para cada linha celular.
7. Lave as células com 1,5 mL de PBS e remova completamente o PBS depois.
8. Fixe as células adicionando e incubando as células com 1,5 mL de paraformaldeído a 4% (v / v) em PBS por 10 min.
9. Adicione 1,5 mL de etanol a 70% (v/v) e incube por 10 min.
10. Descarte o etanol e deixe as placas secarem ao ar livre em temperatura ambiente por 10 min.
11. Incubar as células com 1,5 mL de corante azul de Coomassie a 0,2% (v/v) em etanol a 90% (v/v) por 20 min.
12. Lave as placas com água bidestilada
    NOTA: Para lavar bem as placas e remover os detritos restantes, mergulhe-as totalmente 2 a 3 vezes em água limpa e bidestilada
13. Deixe as placas secarem ao ar livre em temperatura ambiente por 24 h.
    NOTA: Nesta fase, as placas secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente por pelo menos várias semanas.
14. Visualize e fotografe a migração de células para lacunas com um microscópio de contraste de fase inversa com ampliação de 10 vezes.
    NOTA: Observe e fotografe a migração de células vivas por até 24 h após a exposição ao 5-ALA-PDT. No entanto, as células fixas podem ser armazenadas e fotografadas posteriormente.
15. Exportar as imagens no formato desejado e quantificar as lacunas usando um software para processamento e análise de imagens científicas, conforme descrito anteriormente¹⁴.

4. Ensaio de viabilidade

1. Semeie todas as células a uma densidade de 1,5 × 10⁴ em placas de 96 poços em 50 μL de meio de cultura.
2. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h numa incubadora de cultura de células padrão.
3. Adicione mais 50 μL de meio de cultura livre de FBS contendo 5-ALA a uma concentração final de 1 mM.
4. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 4 h numa incubadora de cultura celular padrão.
   NOTA: Use concentração 2x, pois as células já estão cobertas com 50 μL de meio de cultura. Deve ser incluído um controlo com meio de cultura.
5. Sujeitar as células à exposição PDT com luz azul (436 nm, 36 J/^cm2) em modo de saída contínua para períodos de tempo predefinidos de 300 s ou 2,000 s, conforme indicado na seção 2.
   NOTA: Um controle negativo que não esteja sujeito à exposição à PDT também deve ser incluído.
6. Incubar as células irradiadas a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h numa incubadora de cultura de células padrão.
7. Adicione 15 μL de reagente MTS nas células e incube as células por 90 min a 37 °C, 5% de CO₂.
8. Medir a absorvância com um leitor de espectrofotómetro no comprimento de onda de 490 nm.

5. Ensaio de parada / senescência do crescimento celular (atividade de β-galactosidase (β-Gal))

NOTA: Todos os reagentes e tampões usados aqui foram fornecidos no kit de ensaio (consulte a Tabela de Materiais).

1. Semeie as células a uma densidade de 1,5 × 10⁴ em placas de 96 poços em 100 μL de meio de cultura. Incubar as células durante 24 h, 37 °C, 5% de CO₂ numa incubadora de cultura celular padrão.
2. Adicionar 100 μL de meio fresco isento de FBS com 5-ALA a uma concentração final de 1 mM e incubar por 4 h a 37 °C, 5% de CO₂.
   NOTA: Como controles, os poços separados devem ser cobertos concomitantemente com meio fresco sem fotossensibilizador 5-ALA.
3. Sujeitar as células à exposição PDT com luz azul (436 nm, 36 J/^cm2) em modo de saída contínua para períodos de tempo predefinidos de 300 s ou 2,000 s, conforme indicado na seção 2.
   NOTA: Uma placa de controle negativo que não seja exposta à PDT também deve ser incluída.
4. Incubar as células durante 24 h a 37 °C, 5% de CO₂ numa incubadora de cultura de células padrão.
5. Descarte o meio e lave as células duas vezes com PBS.
6. Cubra as células com 100 μL de tampão de lise celular 1x e incube por 5 min a 4 ° C.
7. Centrifugar o lisado a 350 × g 1 durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante.
8. Pipete 50 μL do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços e adicione mais 50 μL de tampão de ensaio 2x.
9. Coloque a nova placa de 96 poços em uma incubadora de 37 °C por 1,5 h.
   NOTA: Os patês devem ser protegidos da luz para evitar o fotobranqueamento.
10. Transfira 50 μL da mistura para uma placa de 96 poços de parede opaca e adicione 200 μL de solução de parada.
11. Medir a absorvância com um leitor de microplacas de fluorescência a uma excitação de 360 nm/emissão de 465 nm.

Resultados

Após a exposição ao 5-ALA PDT, o grupo controle MSC não mostrou nenhum efeito notável em termos de migração após a irradiação do 5-ALA PDT (Figura 2A, i, v, ix). Em contraste, as células MAC (Figura 1B e Figura 2A, iii, vii, xi) e 17-1012 (Figura 1B e Figura 2A, ii, vi, x) exibir...

Discussão

Apesar das opções de tratamento atuais, a resposta terapêutica do câncer é variável, defendendo novas abordagens ou mesmo terapias combinadas para tratar metástases ósseas, preservando a estrutura inicial do tecido. Nesse contexto, a TFD é uma alternativa promissora. De um ponto de vista simplista, a PDT é composta por dois componentes básicos: (1) um corante sensível à luz não tóxico denominado fotossensibilizador (PS) e (2) uma fonte de luz externa de comprimento de onda...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 s metered card for PDT	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	http://www.illuminoss.com
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizer	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7793	10 mg
6 Well plates	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	657160
8 Well Chamber Slides	SARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany	94.6140.802
96 Well plates (F-buttom)	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	655180
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay)	Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA	G3580
Cellular Senescence Assay	Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Germany	CBA-231	Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	35055	0.5% (w/v)
Culture-Inserts 2Well	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	80209
DMEM (1x) + GlutaMax-I	Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA	31966-021
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	F7524
Fluorescence microplate reader	Promega, Madison, Wisconsin, USA	GlowMAx®, GM3510
Hemocytometer	Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland	4042
ImageJ	National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA	ImageJ (version: 1.53a)	Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/
Inverse phase-contrast microscope	Leica, Wetzlar, Germany	DM IMBRE 100
Methanol AnulaR Normapur	VWR, Fontenay-Sous-Bois, France	20847.307
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	158127	Powder, 95% purity
PDT device (light box and accesories)	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	Blue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	15140-122	10,000 U/mL Penicillin 10,000 μg/mL Streptomycin
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	10010-015
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	21875034
Spectrophotomete/ microplate reader	BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany	EL800
Trypan Blue dye 0.4%	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T8154
Trypsin-EDTA 10x	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T4174