원발성 골종양 및 뼈 전이 세포주에 대한 5-Aminolevulinic Acid 매개 광역학 요법

요약

이 프로토콜은 뼈 전이 세포주와 원발성 골 종양을 5-아미노레불린산 매개 광역학 요법(PDT)에 노출시키는 단계별 방법론적 접근 방식을 제시합니다. PDT 노출 후 세포 이동 가능성/침습성, 생존력, 세포사멸 및 노화 가능성에 대한 영향도 분석됩니다.

초록

뼈 전이는 영향을 받은 환자의 나쁜 예후 및 낮은 삶의 질과 관련이 있습니다. 광역학 요법(PDT)은 국소 전이성 뼈 병변을 표적으로 할 수 있는 비침습적 치료법으로 부상하고 있습니다. 이 논문은 부착 세포주에서 PDT 효과를 연구하기 위한 in vitro 방법을 제시합니다. 이를 위해 원발성(거대세포골종양) 및 인간 뼈 전이성 암 세포주(원발성 침습성 유방암 및 신장암에서 유래)를 모두 5-아미노레불린산(5-ALA) 매개 PDT에 적용하는 단계별 접근 방식을 보여줍니다.

5-ALA-PDT 조사 후 24시간 후(청색광 파장 436nm) 후 세포 이동 가능성, 생존력, 자가사멸 특징 및 세포 성장 정지(노화) 측면에서 치료 효과를 평가했습니다. 5-ALA-PDT 방사선 조사 후, 근골격계 유래 세포주는 PDT의 동일한 용량과 노출에 대해 다르게 반응합니다. PDT 노출에 의해 유발된 세포 손상의 정도에 따라 두 가지 다른 세포 운명(세포사멸)과 노화(senescence)가 관찰되었습니다. 다양한 골암 세포주에 따른 PDT 요법에 대한 다양한 민감도는 임상 환경에서 보다 적절한 PDT 설정을 선택하는 데 유용한 정보를 제공합니다. 이 프로토콜은 근골격계 종양 세포주와 관련하여 PDT의 사용을 예시하기 위해 고안되었습니다. 다양한 암 세포주 및 다양한 광감작제 및 광원에 대한 PDT의 치료 효과를 조사하기 위해 조정될 수 있습니다.

서문

뼈 전이에 대한 치료 옵션은 종양학 치료의 지속적인 발전에도 불구하고 여전히 제한적이고 도전적입니다. 현재 표준 방법은 방사선 요법이며, 이는 국소 홍반, 내부 장기에 대한 독성¹, 불충분한 골절²과 같은 합병증과 관련이 있다. 뼈 전이가 있는 환자는 통증, 고칼슘혈증, 신경학적 증상으로 인해 이동성이 저하되고 삶의 질이 저하되는 경우가 많기 때문에 대체 항종양 요법이 필요하다³. 최근의 연구 결과에 따르면 PDT는 뼈 병변을 직접 표적으로 삼을 수 있는 유망한 대체 항종양 치료 옵션을 제공하며, 이는 단독으로 또는 방사선 요법과 보조적으로 사용될 수 있다⁴.

PDT의 메커니즘은 본질적으로 광 여기 감광성 화합물(광감작제)에서 조직 산소로의 에너지 전달을 기반으로 합니다. 이 광감작제는 나노 수준의 커패시터와 유사하게 작동합니다. 적절한 파장의 광을 조사하면 바닥 상태로 에너지를 저장할 수 있으며, 여기 상태에서 원래 바닥 상태로 돌아올 때 저장된 에너지를 방출할 수 있습니다⁵. 방출된 에너지는 두 가지 광화학 반응을 일으키는데, 하나는 수소 또는 전자를 전달하여 산소를 활성 산소 라디칼로 변환하는 것입니다. 두 번째는 광감작제 기질에서 국소 삼중항 산소 입자⁶로의 수평 에너지 전달에 의한 일중항 산소 입자의 생산입니다. 활성산소라디칼(reactive oxygen radicals)과 일중항(singlet) 산소 분자는 국소 종양세포에 높은 세포독성 효과를 미치며, 종양혈관의 내피세포(endothelial cell)의 세포사멸(apoptosis)에 의해 혈관 폐색(vascular occlusion) 및 국소 염증 반응을 유도한다⁷.

종래의 광감작제는 헤마토포르피린(hematoporphyrins) 및 벤조포르피린(benzoporphyrins)과 같은 포르피린(porphyrin) 계열의 유도체이다⁸. 종양 조직에 더 높은 친화성을 가진 광감작 물질을 적용하면 PDT⁹ y의 선택성을 높일 수 있습니다. 특히 프로토포르피린 IX의 생합성 전구체인 5-ALA는 광선각화증, 기저세포암, 방광종양, 위장암 등의 종양세포에 축적될 수 있다⁵. 5-ALA를 사용하는 다양한 전달 접근법은 종양 국소화와 관련하여 PDT의 효율성을 변화시킬 수도 있습니다. 따라서, PDT를 적용하면서 5-ALA를 국소적으로 사용하는 것이 광선 각화증에 대한 1차 피부과 요법이 되었다¹⁰. 침습성 유관 유방암 세포주의 뼈 전이에 대한 최근 결과는 5-ALA¹¹로 PDT에 노출된 후 세포 이동을 억제하고 세포사멸을 유도할 수 있음을 시사합니다. 그러나 뼈 조직과 같은 근막하 인체 조직에 PDT를 사용하는 것은 효능 개선이 필요하기 때문에 아직 전임상에서 실험 임상 단계에 있습니다. 광 기반 요법과 함께 나노 입자의 응용은 이미 치과 분야에서 큰 영향을 미치고 있습니다¹². 따라서 나노 입자와 PDT의 사용을 결합하면 정형외과 종양학으로 적용 범위가 확장될 가능성이 높습니다.

다음 프로토콜은 원발성 골종양과 뼈 전이 세포주에서 유래한 세포를 모두 준비하고 사전 정의된 시간 노출을 위해 5-ALA 매개 PDT를 적용하는 방법을 설명합니다. 5-ALA-PDT 방사선 조사 후 세포 이동 가능성, 활력 및 노화를 수행하고 평가하는 방법에 대한 자세한 설명도 포함되어 있습니다. 단계별 지침은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 획득하기 위한 간단하고 간결한 접근 방식을 제공합니다. 뼈 종양 병변에 대한 PDT 접근법의 장점, 한계 및 향후 전망에 대해서도 논의합니다.

프로토콜

세 가지 유형의 세포주가 사용되었는데, 신세포암의 뼈 전이에서 유래한 세포주인 "MAM", 침습성 유관 유방암의 뼈 전이인 "MAC", 뼈의 거대세포 종양인 "17-1012"가 그것입니다. 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSC)를 대조군으로 사용하였다. 연구가 시작되기 전에 제도적 및 윤리적 승인을 받았습니다(암 세포주의 경우 프로젝트 번호: 008/2014BO2, MSC의 경우 프로젝트 번호: 401/2013 BO2).

1. 세포 배양

참고: 배양 배지는 미리 준비할 수 있습니다. MAM 및 17-1012에 대한 배양 배지는 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)과 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI로 구성됩니다. MAC 및 MSC에 대한 배양 배지는 글루타민 대체물( 재료 표 참조)을 함유한 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM), 10%(v/v) FBS가 보충된 4.5g/L D-포도당으로 구성됩니다.

1. 80% confluence가 달성될 때까지 세포를 수확하고 통과시킵니다.
2. 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하고 피펫을 사용하여 플라스크에서 PBS를 흡인합니다.
   참고: 이 단계는 프로테아제 억제제를 포함하는 잔류 완전 배지의 제거를 보장합니다.
3. 0.05%(v/v) 트립신-EDTA 3mL를 첨가하여 부착 세포를 배양된 플라스크 바닥에서 분리합니다.
4. 플라스크를 5 % CO₂ 로 가습 된 분위기에서 37 ° C에서 5 분 동안 배양합니다.
5. 위상차 현미경으로 세포 분리를 관찰합니다.
   참고: 배양 시간은 각 세포 유형에 맞게 조정해야 합니다. 세포가 트립신 용액에 더 장기간(>10분) 노출되는 것을 방지합니다.
6. 배양 배지 3mL를 첨가하여 트립신화를 중지합니다.
   참고: 10%(v/v) FBS를 포함하는 각 세포 유형에 적합한 배양 배지를 추가해야 합니다.
7. 분리된 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 7°C에서 350 × g 으로 7분 동안 원심분리합니다.
8. 상등액을 버리십시오.
9. 세포 펠렛을 1mL의 배양 배지에 재현탁시키고 앞서 설명한 바와 같이 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다¹³.

2. PDT 설정 및 노출

1. 모든 케이블과 액세서리를 연결하여 PDT 장치( 재료 표 참조)를 준비합니다.
2. 불필요한 빛 발산을 방지하기 위해 실내 조명을 어둡게 하십시오.
3. 웰 플레이트 바로 위에 덕트 테이프를 사용하여 광섬유를 배치하고 안정화합니다.
   참고: 모든 세포가 방사선 조사되고 동일한 양의 에너지를 받을 수 있도록 웰 상단에 있는 광 섬유의 균일한 분포가 필요합니다(그림 1).
4. 광섬유를 심하게 구부리거나 손상시키면 광도가 감소할 수 있으므로 주의하세요.
5. 광 발산을 최소화하기 위해 우물 플레이트를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
6. ON/OFF 스위치 버튼을 눌러 PDT 장치를 켭니다.
7. 측정량 판독된 카드를 PDT 장치 전면의 슬롯에 삽입합니다.
   참고: 300초의 노출 시간에 해당하는 장치와 함께 하나의 측광 카드가 제공됩니다. 추가 2,000초 프로그램이 PDT 장치 내에 자동으로 통합됩니다. 두 노출 시간 모두 빛은 표시된 기간 동안 연속 출력 모드로 전달됩니다.
8. PDT 라이트박스 디스플레이의 타이머가 측정된 카드에 표시된 지정된 시간으로 변경되는지 확인합니다.
9. 통합된 풋 페달을 눌러 PDT 치료를 시작합니다.
   알림: 자동 정지 기능이 장치에 통합되어 있으며 시스템이 자동으로 실행됩니다. 사이클이 완료되기 전에 광 프로세스를 중지하거나 광섬유를 제거하지 마십시오. 광 주기가 완료되면 광원 셔터가 닫히고 더 이상 빛이 전달되지 않습니다.

3. 이동 분석

1. 종자 세포는 다음과 같습니다 : 2 × 10⁴ 세포 - MAC, 1 × 10⁴ 세포 - MAM, 3 x 10⁴ - 17-1012 및 2.5 × 10⁴ - MSC를 불투명 한 F-bottom, 6-well plate에 통합 된 각 2 챔버 배양 삽입물에 넣습니다.
2. 세포를 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 24 시간 동안 배양합니다. 나중에 인서트를 제거하십시오.
   참고: 마이그레이션 및 초기 비편향 갭 크기에 대한 시작 기준점을 갖기 위해 추가 5-ALA-PDT 노출(단계 3.3-3.4)을 받지 않고 대신 직접 염색 및 정량화(단계 3.5-3.12)되는 별도의 플레이트가 사용됩니다.
3. 배지를 1mM의 5-ALA를 함유한 새로운 FBS가 없는 배지로 교체합니다.
4. 세포를 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 4 시간 동안 배양합니다.
   참고: 대조군으로, 추가 웰은 동시에 5-ALA가 없는 매체로 덮어야 합니다.
5. 섹션 2에 표시된 대로 300초 또는 2,000초의 사전 정의된 시간 프레임에 대해 연속 출력 모드에서 청색광(436nm, 36J/cm²)으로 셀을 PDT에 적용합니다.
   알림: PDT 노출되지 않은 플레이트를 대조군으로 사용해야 합니다.
6. 세포를 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 24 시간 동안 배양합니다.
   참고: 세포를 주기적으로 점검하여 각 세포 유형에 대한 이동 정도를 평가합니다. 이는 각 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다.
7. 1.5mL의 PBS로 세포를 세척하고 나중에 PBS를 완전히 제거합니다.
8. PBS에 1.5mL의 4%(v/v) 파라포름알데히드를 첨가하고 10분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.
9. 70%(v/v) 에탄올 1.5mL를 넣고 10분 동안 배양합니다.
10. 에탄올을 버리고 플레이트를 실온에서 10분 동안 자연 건조시킵니다.
11. 90%(v/v) 에탄올에 0.2%(v/v) 쿠마시 블루 염료 1.5mL를 20분 동안 배양합니다.
12. 이중 증류수로 접시를 씻으십시오.
    알림: 플레이트를 철저히 세척하고 남아 있는 이물질을 제거하려면 깨끗한 이중 증류수에 플레이트를 2-3회 완전히 담그십시오.
13. 접시를 실온에서 24시간 동안 자연 건조시킵니다.
    알림: 이 단계에서 건조된 플레이트는 최소 몇 주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.
14. 세포가 틈새로 이동하는 것을 10배 배율의 역위상차 현미경으로 시각화하고 촬영할 수 있습니다.
    참고: 5-ALA-PDT 노출 후 최대 24시간 동안 살아있는 세포의 이동을 관찰하고 사진을 찍습니다. 그러나 고정된 세포는 나중에 저장하고 사진을 찍을 수 있습니다.
15. 원하는 형식으로 이미지를 내보내고 앞서 설명한 대로 과학 이미지를 처리하고 분석하기 위한 소프트웨어를 사용하여 갭을 정량화합니다¹⁴.

4. 생존력 분석

1. 모든 세포를 1.5 × 10⁴ 의 밀도로 50μL의 배양 배지에 있는 96웰 플레이트에 파종합니다.
2. 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37°C, 5% CO₂ 에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
3. 1mM의 최종 농도에서 5-ALA를 함유하는 FBS가 없는 50μL의 배양 배지를 추가로 추가합니다.
4. 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37°C, 5% CO₂ 에서 4시간 동안 세포를 배양합니다.
   참고: 세포가 이미 50μL의 배양 배지로 덮여 있으므로 2배 농도를 사용하십시오. 배양 배지가 있는 대조군이 포함되어야 합니다.
5. 섹션 2에 표시된 대로 300초 또는 2,000초의 사전 정의된 시간 프레임에 대해 연속 출력 모드에서 세포를 청색광(436nm, 36J/cm²)으로 PDT에 노출시킵니다.
   알림: PDT 노출을 받지 않는 음성 대조군도 포함되어야 합니다.
6. 방사선 조사된 세포를 표준 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ 에서 배양합니다.
7. 15μL의 MTS 시약을 세포에 추가하고 37°C, 5% CO₂에서 90분 동안 세포를 배양합니다.
8. 490nm의 파장에서 분광 광도계 판독기로 흡광도를 측정합니다.

5. 세포 성장 정지/노화 분석(β-Galactosidase(β-Gal) 활성)

참고: 여기에 사용된 모든 시약과 완충액은 분석 키트에 제공되었습니다( 재료 표 참조).

1. 100 μL의 배양 배지에 있는 96웰 플레이트에 1.5 × 10⁴ 의 밀도로 세포를 파종합니다. 표준 세포 배양 인큐베이터에서 24시간, 37°C, 5% CO₂ 동안 세포를 배양합니다.
2. 1mM의 최종 농도에서 5-ALA가 포함된 100μL의 새로운 FBS가 없는 배지를 추가하고 37°C, 5% CO₂에서 4시간 동안 배양합니다.
   참고: 대조군으로, 별도의 웰은 5-ALA 광감작제가 없는 새로운 배지로 동시에 덮어야 합니다.
3. 섹션 2에 표시된 대로 300초 또는 2,000초의 사전 정의된 시간 프레임에 대해 연속 출력 모드에서 세포를 청색광(436nm, 36J/cm²)으로 PDT에 노출시킵니다.
   참고: PDT에 노출되지 않는 음극 제어판도 포함되어야 합니다.
4. 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37°C, 5% CO₂ 에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
5. 배지를 버리고 PBS로 세포를 두 번 씻습니다.
6. 100 μL의 1x 세포 용해 완충액으로 세포를 덮고 4 °C에서 5분 동안 배양합니다.
7. 용해물을 350 × g 1에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 수집합니다.
8. 상층액 50μL를 새로운 96웰 플레이트에 피펫팅하고 50μL의 2x 분석 완충액을 추가합니다.
9. 새 96웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 1.5시간 동안 놓습니다.
   알림: 페이트는 광표백을 방지하기 위해 빛으로부터 보호되어야 합니다.
10. 혼합물 50μL를 불투명 벽의 96웰 플레이트로 옮기고 200μL의 정지 용액을 추가합니다.
11. 형광 마이크로플레이트 리더로 360nm 여기/465nm 방출에서 흡광도를 측정합니다.

결과

5-ALA PDT 노출 후, MSC-대조군은 5-ALA PDT 조사 후 이동 측면에서 주목할 만한 효과를 보이지 않았습니다(그림 2A, i, v, ix). 대조적으로, MAC 세포(그림 1B 및 그림 2A, iii, vii, xi) 및 17-1012(그림 1B 및 그림 2A, ii, vi, x) 세포는 300초 또?...

토론

현재의 치료 옵션에도 불구하고 암 치료 반응은 다양하며, 초기 조직 구조를 보존하면서 뼈 전이를 치료하기 위해 새로운 접근법 또는 병용 요법을 선호합니다. 이러한 맥락에서 PDT는 유망한 대안입니다. 단순한 관점에서 PDT는 두 가지 기본 구성 요소로 구성됩니다 : (1) 광감작제 (PS)라고하는 무독성 감광성 염료와 (2) PS의 흡수 스펙트럼과 일치하고 그것을 활성화하는 적...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 s metered card for PDT	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	http://www.illuminoss.com
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizer	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7793	10 mg
6 Well plates	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	657160
8 Well Chamber Slides	SARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany	94.6140.802
96 Well plates (F-buttom)	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	655180
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay)	Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA	G3580
Cellular Senescence Assay	Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Germany	CBA-231	Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	35055	0.5% (w/v)
Culture-Inserts 2Well	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	80209
DMEM (1x) + GlutaMax-I	Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA	31966-021
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	F7524
Fluorescence microplate reader	Promega, Madison, Wisconsin, USA	GlowMAx®, GM3510
Hemocytometer	Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland	4042
ImageJ	National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA	ImageJ (version: 1.53a)	Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/
Inverse phase-contrast microscope	Leica, Wetzlar, Germany	DM IMBRE 100
Methanol AnulaR Normapur	VWR, Fontenay-Sous-Bois, France	20847.307
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	158127	Powder, 95% purity
PDT device (light box and accesories)	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	Blue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	15140-122	10,000 U/mL Penicillin 10,000 μg/mL Streptomycin
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	10010-015
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	21875034
Spectrophotomete/ microplate reader	BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany	EL800
Trypan Blue dye 0.4%	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T8154
Trypsin-EDTA 10x	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T4174