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Method Article
* Estos autores han contribuido por igual
Este protocolo presenta un enfoque metodológico paso a paso para exponer líneas de células óseas metastásicas y tumores óseos primarios a la terapia fotodinámica mediada por ácido 5-aminolevulínico (TFD). También se analizan los efectos sobre el potencial de migración/invasividad celular, la viabilidad, la apoptosis y el potencial de senescencia después de la exposición a PDT.
Las metástasis óseas se asocian con un mal pronóstico y baja calidad de vida para los pacientes afectados. La terapia fotodinámica (TFD) surge como una terapia no invasiva que puede dirigirse a las lesiones óseas metastásicas locales. En este trabajo se presenta un método in vitro para estudiar el efecto de la TFD en líneas celulares adherentes. Con este fin, demostramos un enfoque paso a paso para someter líneas celulares de cáncer metastásico primario (tumor óseo de células gigantes) y óseas humanas metastásicas (derivadas de un carcinoma de mama ductal invasivo primario y un carcinoma renal) a una TFD mediada por ácido 5-aminolevulínico (5-ALA).
Después de 24 h después de la irradiación de 5-ALA-PDT (longitud de onda de luz azul 436 nm), se evaluó el efecto terapéutico en términos de potencial de migración celular, viabilidad, características apoptóticas y detención del crecimiento celular (senescencia). Después de la irradiación con 5-ALA-PDT, las líneas celulares derivadas de la musculoesquelética responden de manera diferente a las mismas dosis y exposición a la PDT. Dependiendo de la extensión del daño celular desencadenado por la exposición a PDT, se observaron dos destinos celulares diferentes: apoptosis y senescencia. La sensibilidad variable a la terapia de TFD entre diferentes líneas celulares de cáncer de hueso proporciona información útil para seleccionar los entornos de TFD más apropiados en entornos clínicos. Este protocolo está diseñado para ejemplificar el uso de PDT en el contexto de líneas celulares neoplásicas musculoesqueléticas. Se puede ajustar para investigar el efecto terapéutico de la TFD en varias líneas celulares cancerosas y varios fotosensibilizadores y fuentes de luz.
Las opciones terapéuticas para las metástasis óseas siguen siendo limitadas y desafiantes a pesar de los avances en curso en el tratamiento oncológico. El método estándar actual es la radioterapia, que se asocia con complicaciones como eritema local, toxicidad para los órganos internos1 y fracturas insuficientes2. Existe la necesidad de terapias antineoplásicas alternativas, ya que los pacientes con metástasis óseas a menudo sufren dolor, hipercalcemia y síntomas neurológicos que resultan en un deterioro de la movilidad y una disminución de la calidad de vida3. Hallazgos recientes demuestran que la TFD proporciona una opción de tratamiento antineoplásico alternativa prometedora para dirigirse directamente a las lesiones óseas, que puede usarse sola o como soporte de la radioterapia4.
El mecanismo de la TFD se basa esencialmente en una transferencia de energía de un compuesto fotosensible excitado por la luz (fotosensibilizador) al oxígeno tisular. Este fotosensibilizador funciona de manera similar a un condensador a nivel nanoscópico. Puede almacenar energía en un estado fundamental cuando se irradia con una longitud de onda de luz apropiada y libera energía almacenada cuando regresa de un estado excitado al estado fundamental original5. La energía liberada conduce a dos reacciones fotoquímicas: una es la transformación del oxígeno en radicales reactivos de oxígeno mediante la transferencia de hidrógeno o un electrón. La segunda es la producción de partículas de oxígeno singlete por transferencia horizontal de energía desde el sustrato fotosensibilizador a las partículas de oxígeno triplete locales6. Los radicales reactivos de oxígeno y las moléculas de oxígeno singlete tienen efectos altamente citotóxicos sobre las células tumorales locales e inducen la oclusión vascular y la respuesta inflamatoria local por apoptosis de las células endoteliales de los vasos sanguíneos tumorales7.
Los fotosensibilizadores convencionales son derivados de la familia de las porfirinas como las hematoporfirinas y las benzoporfirinas8. La aplicación de sustancias fotosensibilizantes con mayor afinidad al tejido tumoral puede aumentar la selectividad de la TFDa 9 años. En particular, el 5-ALA, que es un precursor biosintético de la protoporfirina IX, puede acumularse en células tumorales como la queratosis actínica, el carcinoma basocelular, el tumor de vejiga y el cáncer gastrointestinal5. Los diferentes enfoques de administración que utilizan 5-ALA también pueden variar la eficiencia de la TFD en relación con la localización del tumor. Así, el uso tópico de 5-ALA con la aplicación de TFD se convirtió en la terapia dermatológica de primera línea contra la queratosis actínica10. Los resultados recientes de metástasis óseas de líneas celulares de cáncer de mama ductal invasivo indican una posible inhibición de la migración celular e inducción de la apoptosis después de la exposición a PDT con 5-ALA11. Sin embargo, el uso de la TFD en tejido humano subfascial, como el tejido óseo, aún se encuentra en su etapa clínica preclínica a experimental, ya que es necesario mejorar la eficacia. Las aplicaciones de las nanopartículas con la terapia basada en la luz ya muestran un gran impacto en odontología12. Por lo tanto, es probable que la combinación del uso de nanopartículas con PDT amplíe su rango de aplicación hacia la oncología ortopédica.
El siguiente protocolo describe cómo preparar tanto las células que se originan en tumores óseos primarios como las líneas celulares de metástasis óseas y someterlas a PDT mediada por 5-ALA durante un tiempo de exposición predefinido. También se incluye una descripción detallada de cómo realizar y evaluar el potencial de migración celular, la vitalidad y la senescencia después de la irradiación con 5-ALA-PDT. Las instrucciones paso a paso proporcionan un enfoque sencillo y conciso para adquirir datos fiables y reproducibles. También se discuten las ventajas, limitaciones y perspectivas futuras del abordaje de la TFD para las lesiones neoplásicas óseas.
Se emplearon tres tipos diferentes de líneas celulares: "MAM", una línea celular que se origina a partir de metástasis óseas de carcinoma de células renales, "MAC" (metástasis óseas de un carcinoma de mama ductal invasivo) y "17-1012", un tumor óseo de células gigantes. Se utilizaron células madre mesenquimales (MSC) derivadas de la médula ósea como grupo de control. Se obtuvo la aprobación institucional y ética antes del inicio del estudio (número de proyecto: 008/2014BO2 para las líneas celulares cancerosas y número de proyecto: 401/2013 BO2 para MSCs).
1. Cultivo celular
NOTA: Los medios de cultivo se pueden preparar de antemano. El medio de cultivo para MAM y 17-1012 consiste en RPMI suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) y 2 mM de L-glutamina. El medio de cultivo para MAC y MSC consiste en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con sustituto de glutamina (ver la Tabla de Materiales), 4,5 g/L de D-glucosa suplementada con FBS al 10% (v/v).
2. Configuración y exposición de PDT
3. Ensayo de migración
4. Ensayo de viabilidad
5. Ensayo de detención del crecimiento celular/senescencia (actividad de β-galactosidasa (β-Gal))
NOTA: Todos los reactivos y tampones utilizados aquí se proporcionaron en el kit de ensayo (consulte la Tabla de materiales).
Después de la exposición a 5-ALA PDT, el grupo de control de MSC no mostró ningún efecto notable en términos de migración después de la irradiación con 5-ALA PDT (Figura 2A, i, v, ix). En contraste, las celdas MAC (Figura 1B y Figura 2A, iii, vii, xi) y 17-1012 (Figura 1B y Figura 2A, ii, vi...
A pesar de las opciones de tratamiento actuales, la respuesta terapéutica del cáncer es variable, abogando a favor de enfoques novedosos o incluso terapias combinadas para tratar las metástasis óseas mientras se preserva la estructura tisular inicial. En este contexto, la PDT es una alternativa prometedora. Desde un punto de vista simplista, la PDT se compone de dos componentes básicos: (1) un tinte sensible a la luz no tóxico denominado fotosensibilizador (PS) y (2) una fuente de ...
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecemos a nuestros coautores de las publicaciones originales por su ayuda y apoyo.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
300 s metered card for PDT | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | http://www.illuminoss.com |
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizer | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7793 | 10 mg |
6 Well plates | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
8 Well Chamber Slides | SARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany | 94.6140.802 | |
96 Well plates (F-buttom) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay) | Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA | G3580 | |
Cellular Senescence Assay | Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Germany | CBA-231 | Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay |
Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 35055 | 0.5% (w/v) |
Culture-Inserts 2Well | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 80209 | |
DMEM (1x) + GlutaMax-I | Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | F7524 | |
Fluorescence microplate reader | Promega, Madison, Wisconsin, USA | GlowMAx®, GM3510 | |
Hemocytometer | Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland | 4042 | |
ImageJ | National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA | ImageJ (version: 1.53a) | Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/ |
Inverse phase-contrast microscope | Leica, Wetzlar, Germany | DM IMBRE 100 | |
Methanol AnulaR Normapur | VWR, Fontenay-Sous-Bois, France | 20847.307 | |
Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 158127 | Powder, 95% purity |
PDT device (light box and accesories) | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | Blue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15140-122 | 10,000 U/mL Penicillin 10,000 μg/mL Streptomycin |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10010-015 | |
RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21875034 | |
Spectrophotomete/ microplate reader | BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany | EL800 | |
Trypan Blue dye 0.4% | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | T8154 | |
Trypsin-EDTA 10x | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | T4174 |
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