Terapia fotodinámica mediada por ácido 5-aminolevulínico en líneas celulares de tumores óseos primarios y metástasis óseas

Resumen

Este protocolo presenta un enfoque metodológico paso a paso para exponer líneas de células óseas metastásicas y tumores óseos primarios a la terapia fotodinámica mediada por ácido 5-aminolevulínico (TFD). También se analizan los efectos sobre el potencial de migración/invasividad celular, la viabilidad, la apoptosis y el potencial de senescencia después de la exposición a PDT.

Resumen

Las metástasis óseas se asocian con un mal pronóstico y baja calidad de vida para los pacientes afectados. La terapia fotodinámica (TFD) surge como una terapia no invasiva que puede dirigirse a las lesiones óseas metastásicas locales. En este trabajo se presenta un método in vitro para estudiar el efecto de la TFD en líneas celulares adherentes. Con este fin, demostramos un enfoque paso a paso para someter líneas celulares de cáncer metastásico primario (tumor óseo de células gigantes) y óseas humanas metastásicas (derivadas de un carcinoma de mama ductal invasivo primario y un carcinoma renal) a una TFD mediada por ácido 5-aminolevulínico (5-ALA).

Después de 24 h después de la irradiación de 5-ALA-PDT (longitud de onda de luz azul 436 nm), se evaluó el efecto terapéutico en términos de potencial de migración celular, viabilidad, características apoptóticas y detención del crecimiento celular (senescencia). Después de la irradiación con 5-ALA-PDT, las líneas celulares derivadas de la musculoesquelética responden de manera diferente a las mismas dosis y exposición a la PDT. Dependiendo de la extensión del daño celular desencadenado por la exposición a PDT, se observaron dos destinos celulares diferentes: apoptosis y senescencia. La sensibilidad variable a la terapia de TFD entre diferentes líneas celulares de cáncer de hueso proporciona información útil para seleccionar los entornos de TFD más apropiados en entornos clínicos. Este protocolo está diseñado para ejemplificar el uso de PDT en el contexto de líneas celulares neoplásicas musculoesqueléticas. Se puede ajustar para investigar el efecto terapéutico de la TFD en varias líneas celulares cancerosas y varios fotosensibilizadores y fuentes de luz.

Introducción

Las opciones terapéuticas para las metástasis óseas siguen siendo limitadas y desafiantes a pesar de los avances en curso en el tratamiento oncológico. El método estándar actual es la radioterapia, que se asocia con complicaciones como eritema local, toxicidad para los órganos internos¹ y fracturas insuficientes². Existe la necesidad de terapias antineoplásicas alternativas, ya que los pacientes con metástasis óseas a menudo sufren dolor, hipercalcemia y síntomas neurológicos que resultan en un deterioro de la movilidad y una disminución de la calidad de vida³. Hallazgos recientes demuestran que la TFD proporciona una opción de tratamiento antineoplásico alternativa prometedora para dirigirse directamente a las lesiones óseas, que puede usarse sola o como soporte de la radioterapia⁴.

El mecanismo de la TFD se basa esencialmente en una transferencia de energía de un compuesto fotosensible excitado por la luz (fotosensibilizador) al oxígeno tisular. Este fotosensibilizador funciona de manera similar a un condensador a nivel nanoscópico. Puede almacenar energía en un estado fundamental cuando se irradia con una longitud de onda de luz apropiada y libera energía almacenada cuando regresa de un estado excitado al estado fundamental original⁵. La energía liberada conduce a dos reacciones fotoquímicas: una es la transformación del oxígeno en radicales reactivos de oxígeno mediante la transferencia de hidrógeno o un electrón. La segunda es la producción de partículas de oxígeno singlete por transferencia horizontal de energía desde el sustrato fotosensibilizador a las partículas de oxígeno triplete locales⁶. Los radicales reactivos de oxígeno y las moléculas de oxígeno singlete tienen efectos altamente citotóxicos sobre las células tumorales locales e inducen la oclusión vascular y la respuesta inflamatoria local por apoptosis de las células endoteliales de los vasos sanguíneos tumorales⁷.

Los fotosensibilizadores convencionales son derivados de la familia de las porfirinas como las hematoporfirinas y las benzoporfirinas⁸. La aplicación de sustancias fotosensibilizantes con mayor afinidad al tejido tumoral puede aumentar la selectividad de la TFD^{a 9} años. En particular, el 5-ALA, que es un precursor biosintético de la protoporfirina IX, puede acumularse en células tumorales como la queratosis actínica, el carcinoma basocelular, el tumor de vejiga y el cáncer gastrointestinal⁵. Los diferentes enfoques de administración que utilizan 5-ALA también pueden variar la eficiencia de la TFD en relación con la localización del tumor. Así, el uso tópico de 5-ALA con la aplicación de TFD se convirtió en la terapia dermatológica de primera línea contra la queratosis actínica¹⁰. Los resultados recientes de metástasis óseas de líneas celulares de cáncer de mama ductal invasivo indican una posible inhibición de la migración celular e inducción de la apoptosis después de la exposición a PDT con 5-ALA¹¹. Sin embargo, el uso de la TFD en tejido humano subfascial, como el tejido óseo, aún se encuentra en su etapa clínica preclínica a experimental, ya que es necesario mejorar la eficacia. Las aplicaciones de las nanopartículas con la terapia basada en la luz ya muestran un gran impacto en odontología¹². Por lo tanto, es probable que la combinación del uso de nanopartículas con PDT amplíe su rango de aplicación hacia la oncología ortopédica.

El siguiente protocolo describe cómo preparar tanto las células que se originan en tumores óseos primarios como las líneas celulares de metástasis óseas y someterlas a PDT mediada por 5-ALA durante un tiempo de exposición predefinido. También se incluye una descripción detallada de cómo realizar y evaluar el potencial de migración celular, la vitalidad y la senescencia después de la irradiación con 5-ALA-PDT. Las instrucciones paso a paso proporcionan un enfoque sencillo y conciso para adquirir datos fiables y reproducibles. También se discuten las ventajas, limitaciones y perspectivas futuras del abordaje de la TFD para las lesiones neoplásicas óseas.

Protocolo

Se emplearon tres tipos diferentes de líneas celulares: "MAM", una línea celular que se origina a partir de metástasis óseas de carcinoma de células renales, "MAC" (metástasis óseas de un carcinoma de mama ductal invasivo) y "17-1012", un tumor óseo de células gigantes. Se utilizaron células madre mesenquimales (MSC) derivadas de la médula ósea como grupo de control. Se obtuvo la aprobación institucional y ética antes del inicio del estudio (número de proyecto: 008/2014BO2 para las líneas celulares cancerosas y número de proyecto: 401/2013 BO2 para MSCs).

1. Cultivo celular

NOTA: Los medios de cultivo se pueden preparar de antemano. El medio de cultivo para MAM y 17-1012 consiste en RPMI suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) y 2 mM de L-glutamina. El medio de cultivo para MAC y MSC consiste en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con sustituto de glutamina (ver la Tabla de Materiales), 4,5 g/L de D-glucosa suplementada con FBS al 10% (v/v).

1. Recolección y paso de celdas hasta alcanzar el 80% de confluencia.
2. Lave las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y aspire el PBS del matraz con una pipeta.
   NOTA: Este paso asegura la eliminación del medio completo residual que contiene inhibidores de la proteasa.
3. Añadir 3 mL de tripsina-EDTA al 0,05% (v/v) para disociar las células adherentes del fondo del matraz en el que se cultivan.
4. Incubar los matraces durante 5 min a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO₂.
5. Observe el desprendimiento de células bajo un microscopio de contraste de fase.
   NOTA: El tiempo de incubación debe ajustarse para cada tipo de célula. Evite la exposición de las células a la solución de tripsina durante períodos prolongados (>10 min).
6. Detenga la tripsinización añadiendo 3 mL de medio de cultivo.
   NOTA: Asegúrese de agregar el medio de cultivo adecuado para cada tipo de celda que contenga 10% (v/v) de FBS.
7. Transfiera las células separadas a un tubo de centrifugación y centrifugue durante 7 min a 350 × g a 7 °C.
8. Deseche el sobrenadante.
9. Resuspender el pellet de células en 1 mL de medio de cultivo y contar las células con un hemocitómetro como se describió anteriormente¹³.

2. Configuración y exposición de PDT

1. Prepare el dispositivo PDT (consulte la Tabla de materiales) conectando todos los cables y accesorios.
2. Atenúe la luz de la habitación para evitar la disipación innecesaria de la luz.
3. Coloque y estabilice la fibra ligera con la ayuda de cinta adhesiva directamente sobre la placa del pocillo.
   NOTA: Se desea una distribución uniforme de las fibras ligeras en la parte superior de los pocillos para garantizar que todas las células sean irradiadas y reciban la misma cantidad de energía (Figura 1).
4. Asegúrese de no doblar o dañar severamente la fibra ligera, ya que esto podría provocar una reducción en la intensidad de la luz.
5. Cubra las placas de los pocillos con papel de aluminio para minimizar la disipación de la luz.
6. Encienda el dispositivo PDT pulsando el botón del interruptor ON/OFF .
7. Inserte la tarjeta con medidor en la ranura en la parte frontal del dispositivo PDT.
   NOTA: Se proporciona una tarjeta medida con el dispositivo correspondiente a un tiempo de exposición de 300 s. Un programa adicional de 2.000 s se integra automáticamente en el dispositivo PDT. Para ambos tiempos de exposición, la luz se emite en un modo de salida continua durante los períodos indicados.
8. Asegúrese de que el temporizador en la pantalla de la caja de luz PDT cambie al tiempo prescrito indicado en la tarjeta medida.
9. Inicie el tratamiento PDT presionando el pedal incorporado.
   NOTA: El dispositivo incorpora una función de parada automática y el sistema funciona automáticamente. No detenga el proceso de luz ni retire la fibra ligera antes de completar el ciclo. Al finalizar el ciclo de luz, el obturador de la fuente de luz se cierra y no se emite más luz.

3. Ensayo de migración

1. Células de siembra de la siguiente manera: 2 × 10⁴ células - MAC, 1 × 10⁴ células - MAM, 3 x 10⁴ - 17-1012 y 2,5 × 10⁴ - MSC en cada inserto de cultivo de 2 cámaras integrado en placas opacas de 6 pocillos con fondo F.
2. Incubar las células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h. Retire los insertos después.
   NOTA: Para tener un punto de referencia inicial para la migración y el tamaño de espacio inicial no sesgado, se emplea una placa separada, que no se someterá a una exposición adicional al 5-ALA-PDT (pasos 3.3-3.4), sino que se teñirá y cuantificará directamente (pasos 3.5-3.12).
3. Reemplace el medio con un medio nuevo sin FBS que contenga 1 mM de 5-ALA.
4. Incubar las células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 4 h.
   NOTA: Como controles, los pocillos adicionales deben cubrirse concomitantemente con medio sin 5-ALA.
5. Someta las células a PDT con luz azul (436 nm, 36 J/^cm2) en un modo de salida continua durante períodos de tiempo predefinidos de 300 s o 2.000 s, como se indica en la sección 2.
   NOTA: Las placas que no están sujetas a la exposición a PDT deben emplearse como controles.
6. Incubar las células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h.
   NOTA: Revise las celdas periódicamente para evaluar el grado de migración de cada tipo de celda. Esto debe optimizarse para cada línea celular.
7. Lave las células con 1,5 ml de PBS y retire completamente el PBS después.
8. Fije las células añadiendo e incubando las células con 1,5 mL de paraformaldehído al 4% (v/v) en PBS durante 10 min.
9. Añadir 1,5 mL de etanol al 70% (v/v) e incubar durante 10 min.
10. Deseche el etanol y deje que las placas se sequen al aire a temperatura ambiente durante 10 minutos.
11. Incubar las células con 1,5 mL de colorante azul de Coomassie al 0,2% (v/v) en etanol al 90% (v/v) durante 20 min.
12. Lave los platos con agua bidestilada.
    NOTA: Para lavar a fondo las placas y eliminar los residuos restantes, sumerja completamente las placas 2-3 veces en agua limpia y doble destilada.
13. Deje que las placas se sequen al aire a temperatura ambiente durante 24 h.
    NOTA: En esta etapa, las placas secas pueden almacenarse a temperatura ambiente durante al menos varias semanas.
14. Visualice y fotografíe la migración de las células en los huecos con un microscopio de contraste de fase inversa con un aumento de 10 veces.
    NOTA: Observe y fotografíe la migración de células vivas hasta 24 horas después de la exposición a 5-ALA-PDT. Sin embargo, las celdas fijas se pueden almacenar y fotografiar más tarde.
15. Exporte las imágenes en el formato deseado y cuantifique las brechas utilizando software para el procesamiento y análisis de imágenes científicas como se describió anteriormente¹⁴.

4. Ensayo de viabilidad

1. Siembre todas las células a una densidad de 1,5 × 10⁴ en placas de 96 pocillos en 50 μL de medio de cultivo.
2. Incubar las células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h en una incubadora de cultivo celular estándar.
3. Añadir 50 μL adicionales de medio de cultivo libre de FBS que contenga 5-ALA a una concentración final de 1 mM.
4. Incubar las células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 4 h en una incubadora de cultivo celular estándar.
   NOTA: Utilice una concentración de 2x ya que las células ya están cubiertas con 50 μL de medio de cultivo. Se debe incluir un control con medio de cultivo.
5. Someta las células a una exposición PDT con luz azul (436 nm, 36 J/^cm2) en un modo de salida continua durante períodos de tiempo predefinidos de 300 s o 2.000 s, como se indica en la sección 2.
   NOTA: También se debe incluir un control negativo que no esté sujeto a la exposición a PDT.
6. Incubar las células irradiadas a 37 °C, 5% de CO₂ durante 24 h en una incubadora de cultivo celular estándar.
7. Añadir 15 μL de reactivo MTS a las células e incubar las células durante 90 min a 37 °C, 5% de CO₂.
8. Mida la absorbancia con un lector de espectrofotómetro a una longitud de onda de 490 nm.

5. Ensayo de detención del crecimiento celular/senescencia (actividad de β-galactosidasa (β-Gal))

NOTA: Todos los reactivos y tampones utilizados aquí se proporcionaron en el kit de ensayo (consulte la Tabla de materiales).

1. Siembre las células a una densidad de 1,5 × 10⁴ en placas de 96 pocillos en 100 μL de medio de cultivo. Incubar las células durante 24 h, 37 °C, 5% de CO₂ en una incubadora de cultivo celular estándar.
2. Añadir 100 μL de medio fresco libre de FBS con 5-ALA a una concentración final de 1 mM e incubar durante 4 h a 37 °C, 5% de CO₂.
   NOTA: Como controles, los pocillos separados deben cubrirse concomitantemente con medio fresco sin fotosensibilizador de 5-ALA.
3. Someta las células a una exposición PDT con luz azul (436 nm, 36 J/^cm2) en un modo de salida continua durante períodos de tiempo predefinidos de 300 s o 2.000 s, como se indica en la sección 2.
   NOTA: También se debe incluir una placa de control negativa que no esté expuesta a PDT.
4. Incubar las células durante 24 h a 37 °C, 5% de CO₂ en una incubadora de cultivo celular estándar.
5. Deseche el medio y lave las celdas dos veces con PBS.
6. Cubrir las células con 100 μL de tampón de lisis celular 1x e incubar durante 5 min a 4 °C.
7. Centrifugar el lisado a 350 × g 1 durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante.
8. Pipetear 50 μL del sobrenadante en una nueva placa de 96 pocillos y añadir otros 50 μL de tampón de ensayo 2x.
9. Coloque la nueva placa de 96 pocillos en una incubadora a 37 °C durante 1,5 h.
   NOTA: Los patés deben protegerse de la luz para evitar el fotoblanqueo.
10. Transfiera 50 μL de la mezcla a una placa de 96 pocillos de paredes opacas y agregue 200 μL de solución de parada.
11. Mida la absorbancia con un lector de microplacas de fluorescencia a 360 nm de excitación/465 nm de emisión.

Resultados

Después de la exposición a 5-ALA PDT, el grupo de control de MSC no mostró ningún efecto notable en términos de migración después de la irradiación con 5-ALA PDT (Figura 2A, i, v, ix). En contraste, las celdas MAC (Figura 1B y Figura 2A, iii, vii, xi) y 17-1012 (Figura 1B y Figura 2A, ii, vi...

Discusión

A pesar de las opciones de tratamiento actuales, la respuesta terapéutica del cáncer es variable, abogando a favor de enfoques novedosos o incluso terapias combinadas para tratar las metástasis óseas mientras se preserva la estructura tisular inicial. En este contexto, la PDT es una alternativa prometedora. Desde un punto de vista simplista, la PDT se compone de dos componentes básicos: (1) un tinte sensible a la luz no tóxico denominado fotosensibilizador (PS) y (2) una fuente de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 s metered card for PDT	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	http://www.illuminoss.com
5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizer	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7793	10 mg
6 Well plates	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	657160
8 Well Chamber Slides	SARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany	94.6140.802
96 Well plates (F-buttom)	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	655180
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay)	Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA	G3580
Cellular Senescence Assay	Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Germany	CBA-231	Quantitative senescence-associated ß-galactosidase assay
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	35055	0.5% (w/v)
Culture-Inserts 2Well	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	80209
DMEM (1x) + GlutaMax-I	Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA	31966-021
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	F7524
Fluorescence microplate reader	Promega, Madison, Wisconsin, USA	GlowMAx®, GM3510
Hemocytometer	Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland	4042
ImageJ	National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA	ImageJ (version: 1.53a)	Software for processing and analyzing scientific images; https://imagej.net/
Inverse phase-contrast microscope	Leica, Wetzlar, Germany	DM IMBRE 100
Methanol AnulaR Normapur	VWR, Fontenay-Sous-Bois, France	20847.307
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	158127	Powder, 95% purity
PDT device (light box and accesories)	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	Blue light 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	15140-122	10,000 U/mL Penicillin 10,000 μg/mL Streptomycin
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	10010-015
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	21875034
Spectrophotomete/ microplate reader	BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany	EL800
Trypan Blue dye 0.4%	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T8154
Trypsin-EDTA 10x	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T4174