نهج الزرع الرجعي لوضع قسطرة غسيل الكلى البريتوني في الفئران

Summary

توضح هذه المقالة تعديلات على إجراء لزرع قسطرة غسيل الكلى البريتوني في نموذج الفئران لتجنب المشكلات الفنية الرئيسية التي لوحظت مع التقنيات التقليدية.

Abstract

يتم استخدام نماذج الفئران لاستكشاف جوانب مختلفة من غسيل الكلى البريتوني (PD) ، مثل التهاب الصفاق والتليف. تؤدي هذه الأحداث إلى فشل الغشاء البريتوني لدى البشر ، والذي لا يزال مجالا للتحقيق المكثف بسبب آثاره السريرية العميقة في إدارة المرضى الذين يعانون من مرض الكلى في المرحلة النهائية (ESKD). على الرغم من الأهمية السريرية لمرض باركنسون والمضاعفات المرتبطة به، فإن نماذج الفئران التجريبية الحالية تعاني من تحديات تقنية رئيسية تؤثر على أداء النماذج. وتشمل هذه هجرة قسطرة PD والالتواء وعادة ما تستدعي إزالة القسطرة في وقت مبكر. تدفع هذه القيود أيضا الحاجة إلى عدد أكبر من الحيوانات لإكمال الدراسة. لمعالجة هذه العيوب ، تقدم هذه الدراسة تحسينات تقنية وفروق جراحية دقيقة لمنع مضاعفات قسطرة PD التي لوحظت بشكل شائع في نموذج الفئران. علاوة على ذلك ، يتم التحقق من صحة هذا النموذج المعدل عن طريق إحداث التهاب الصفاق والتليف باستخدام حقن عديد السكاريد الدهني. في جوهرها ، تصف هذه الورقة طريقة محسنة لإنشاء نموذج تجريبي ل PD.

Introduction

المرحلة النهائية من عبء مرض الكلى
مرض الكلى المزمن (CKD) هو مشكلة صحية في جميع أنحاء العالم¹. تشير التقديرات الحالية إلى أن أكثر من 850 مليون شخص في جميع أنحاء العالم يعانون من أمراض الكلى. يضاعف انتشار أمراض الكلى تقريبا عدد مرضى السكري (422 مليون) وهو أكثر من 20 ضعف معدل انتشار السرطان (42 مليون) أو فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز (36.7 مليون) في جميع أنحاء العالم². ما يقرب من واحد من كل سبعة أمريكيين يعانون من مرض الكلى المزمن ، واثنان من كل 1000 أمريكي لديهم ESKD تتطلب زراعة الكلى أو دعم غسيل الكلى³. بالنظر إلى العبء المتصاعد ل ESKD في جميع أنحاء العالم ، فإن تحسين تقنية غسيل الكلى أمر بالغ الأهمية³.

غسيل الكلى البريتوني
PD هي طريقة غير مستغلة بشكل كبير لعلاج ESKD في الولايات المتحدة. وفقا لنظام بيانات الكلى بالولايات المتحدة (USRDS) ، كانت النسبة المئوية لمرضى PD السائدين 11٪ فقط في عام 2020 ^4,5. يمنح PD العديد من المزايا على غسيل الكلى في المركز (HD) ، بما في ذلك نوعية حياة أفضل ، وعدد أقل من زيارات العيادة ، وانخفاض في نفقات Medicare ^6,7. بالإضافة إلى ذلك ، PD هو علاج منزلي ويرتبط بخطر أقل بكثير للإصابة بالتهابات شديدة مثل تجرثم الدم والتهاب الشغاف التي غالبا ما ترتبط بقسطرة غسيل الكلى. علاوة على ذلك ، يمكن بدء PD بسرعة من خلال بروتوكول البدء العاجل ، مما يقلل من الحاجة إلى بدء غسيل الكلى باستخدام القسطرة الوعائية الساكنة⁸. يعتبر PD الطريقة المفضلة لغسيل الكلى في مجموعة ESKD للأطفال⁹.

ضعف الصفاق الناجم عن غسيل الكلى البريتوني
يستلزم PD إدخال سائل PD (الديالة) في الصفاق ، مما يؤدي إلى التهاب وإعادة تشكيل الغشاء البريتوني بمرور الوقت. يؤدي الالتهاب البريتوني إلى التليف ، ويبلغ ذروته في الخسارة المحتملة لقدرات الترشيح الفائق للغشاء بمرور الوقت. يمثل الحفاظ على الغشاء البريتوني تحديا كبيرا في مرض باركنسون، ومن المهم إجراء المزيد من الأبحاث لضمان توفر أفضل الممارسات السريرية للممارسين. هناك نماذج راسخة للفئران للمساعدة في زيادة فهم الآليات الفيزيولوجية المرضية للعدوى البريتونية والالتهابات ، والمذاب ، وحركية نقل المياه ، وفشل الغشاء. ومع ذلك ، فإن المشكلات الفنية في القسطرة غالبا ما تحد من هذه النماذج¹⁰.

تحليل تغيرات الغشاء البريتوني
في مرضى ESKD ، يتم إدخال غسيل الكلى تقليديا في التجويف البريتوني من خلال قسطرة Tenkhoff ذات الكفة العميقة والسطحية. يمكن أن يعاني المرضى من مضاعفات مرتبطة بالقسطرة ، بما في ذلك هجرة القسطرة وألم التسريب وسوء تصريف الديالة¹¹،^12،13. تم إدخال نوعين رئيسيين من القسطرة البريتونية للبشر ، ملفوفة أو مستقيمة ، لتقليل هذه المضاعفات¹². تمت إضافة العديد من التعديلات ، بما في ذلك الكفة الإضافية للقسطرة التقليدية ذات الأصفاد ، إلى القسطرة الأصلية لإطالة بقاء قسطرة PD¹¹. تختلف تقنية الإدخال وفقا لعدة عوامل عن طريق منع هجرة القسطرة المراد إضافتها بعد البقاء على قيد الحياة ، بما في ذلك توفر الموارد ومستوى الخبرة¹⁴.

في المقابل ، فإن نماذج الفئران لغسيل الكلى البريتوني لها اختلافات جوهرية في التقنيات والغرض مقارنة بالقسطرة البريتونية البشرية. على سبيل المثال ، تستخدم القسطرة البريتونية في نماذج الفئران في المقام الأول لدراسة التغيرات الغشائية وهي أقل مخصصة لوظائف الصرف ثنائية الاتجاه. تعاني التقنية الحالية من احتمال إزاحة الميناء وهجرة القسطرة بسبب التعامل مع الحيوانات. في نماذج الفئران التقليدية ، لم يتم تثبيت منافذ الوصول على الجلد. خلق هذا الجانب منفذ وصول غير مستقر ، والذي قد يتم إزاحته في الحيوانات المستيقظة ، مما يؤدي إلى هجرة القسطرة. نظرا لأهمية نماذج الفئران في أبحاث الغشاء البريتوني ، من الضروري إنشاء تقنيات جراحية فعالة لتوليد نماذج موثوقة. لذلك ، شرعنا في تحسين النموذج التقليدي لوضع قسطرة PD. من المهم ملاحظة أن القسطرة نفسها تسبب تغيرات نسيجية مرضية في الغشاء البريتوني ، وبالتالي ، يجب تفسير أي استنتاجات تتعلق بتأثير محاليل PD في الدراسات على الحيوانات في سياق قسطرة PD كجسم غريب¹⁵،^16،17.

الغشاء البريتوني التشريح المرضي
يرتبط فشل PD بشكل أساسي بالتليف وتكوين الأوعية الزائدة مما يؤدي إلى فقدان تدرج التركيز الأسمولي. بالإضافة إلى ذلك، قد تتأثر قدرة ترشيح الغشاء البريتوني بالتهاب الصفاق. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التهاب الصفاق المعدي سببا راسخا للتغيير في طريقة غسيل الكلى من غسيل الكلى البريتوني إلى غسيل الكلى. ¹⁸.

Protocol

في هذه الدراسة ، تم استخدام ثماني إناث من الفئران C57BL / 6J ، تتراوح أعمارهن بين 8 و 12 أسبوعا ، ومتوسط وزن 20 جم. تم إيواء الفئران في ظل ظروف قياسية وتم إطعامها بالطعام والماء حسب الطلب. تم إجراء هذه الدراسة بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) ، المركز الطبي بجامعة بوسطن (AN-1549). تم تنفيذ الإجراءات الموضحة هنا في ظل ظروف معقمة.

1. تخدير الفأر في غرفة إيزوفلوران ، وحقن المسكن تحت الجلد

1. امسك الحيوان من قاعدة الذيل. الحفاظ على الحيوان على السطح الظهري لليد غير المهيمنة.
2. نقل الحيوان إلى غرفة تحريض التخدير المستمر مليئة 3٪ -4٪ إيزوفلوران. تأكد من التخدير العام الكافي من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم في الأطراف الخلفية اليمنى واليسرى. الحفاظ على الحفاظ على التخدير العام مع إيزوفلوران 1٪ -3٪.
3. ضع مرهم العيون على كلتا العينين.
4. تطبيق حقنة تحت الجلد من البوبرينورفين.
   1. قم بإذابة مخزون البوبرينورفين بتركيز 0.3 مجم / مل في كلوريد الصوديوم (NaCl) بنسبة 0.9٪ لتحقيق التركيز النهائي البالغ 0.03 مجم / مل.
   2. حقن جرعة من 0.05-0.1 ملغ / كغ من 0.03 ملغ / مل البوبرينورفين ، جنبا إلى جنب مع 500 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9 ٪ ، قبل 20 دقيقة من الجراحة في 20 غرام من الفئران (2 ميكروغرام أو 66 ميكرولتر من 0.03 ملغ / مل البوبرينورفين لكل فأر).

2. إعداد الجلد

1. ضع الماوس المخدر بالكامل في وضع جانبي أيسر ، مع تعريض جناحه الأيمن لبطانية التدفئة. حلق الجانب الأيمن من البطن ، بالقرب من خط الوسط إلى منطقة النخاع الشوكي ، وصولا إلى ذيل الحيوان.
2. تطهير المنطقة المحلوقة ثلاث مرات باستخدام قطعة قطن مع التطبيق البديل للمحلول المطهر أو المقشر وإما 70٪ كحول أو محلول ملحي معقم بحركة دائرية ، بدءا من موقع الشق الجراحي والانتقال إلى الخارج. تخلص من قطعة القطن بعد كل استخدام. احرص على عدم تبليل المناطق غير الجراحية بشكل مفرط من الحيوان بالكحول أو المطهر لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تفاقم انخفاض حرارة الجسم.
   ملاحظة: من المهم تخفيف المحاليل المطهرة بشكل صحيح وعدم ترك الدعك الجراحي على الجلد أثناء الجراحة ، لأنها يمكن أن تكون مزعجة وتحتاج إلى شطفها. تحقق بشكل متكرر من درجة حرارة بطانية التدفئة أثناء الإجراء للتأكد من عدم انخفاض درجة الحرارة.

3. قياس طول القسطرة ووضع علامة على نقطة الإدخال داخل البطن والقناة الأنبوبية فوق الجلد المحضر

1. قم بتعيين جيب منفذ الوصول 1 سم فوق ذيل الحيوان. امسك جزء التثبيت بالسبابة غير المهيمنة وإصبع الإبهام فوق المنطقة المخصصة بالقرب من الذيل.
2. ضع القسطرة فوق الجلد وقم بتقدير مكان إدخال أنبوب القسطرة داخل تجويف البطن. حدد المكان المخصص لإدخال الأنبوب ، مع احترام الحد الأدنى من الانحناء للأنبوب بالقرب من خط الوسط الأمامي.
   ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات بقفازات معقمة ، ويجب أن تبقى القسطرة معقمة أثناء القياس. يجب تعقيم الأدوات الجراحية عند 121 درجة مئوية قبل الاستخدام. راجع الشكل التكميلي S1 لمعرفة الأدوات المطلوبة للإجراء.

4. تخصيص قسم خزان القسطرة البريتوني

1. قم بعمل ثقب جانبي فوق إطار قسم الخزان باستخدام علامة أذن الماوس (الشكل 1 والشكل 2). تجدر الإشارة إلى أن لكمة الأذن هي أداة جراحية ، ويجب أن تكون معقمة.

5. ضع منفذ التقطير

1. قم بعمل شق أفقي بعرض 1 سم فوق الذيل. قم بتشريح المستوى تحت الجلد بصراحة من الطبقة العضلية الأساسية لعمل كيس لوضع القسطرة لضمان وجود منفذ التقطير في جيب المنفذ المثالي بحرية.
2. حافظ على طرف مقص القزحية باتجاه خط الوسط لعمل نفق مائل لوضع الأنبوب (الشكل 3 أ).
3. مرر خياطة 3.0 من الفتحة الجانبية المخصصة. قم بإصلاح منفذ الوصول إلى السرير العضلي عن طريق شد الخيط الذي تم تمريره ، مع الحفاظ على مسار الأنبوب cephalad.

6. قم بعمل شق موقع إدخال طرف القسطرة

1. قم بعمل شق 1 سم فوق المنطقة المحددة سابقا بالقرب من خط الوسط. تأكد من المسالك المتطورة عن طريق تمرير المقص عبر المسالك.
2. اختر طرف القسطرة برفق باستخدام ملقط لوضع القسطرة في مسار رجعي.
   ملاحظة: تجنب الضغط على الثقوب الجانبية للأنبوب.
3. مرر أنبوب القسطرة عبر القناة المعدة (الشكل 3 ب). قم بعمل شق 1 سم فوق الطبقة العضلية بالقرب من خط الوسط الأيمن.

7. تأكيد عمل القسطرة

1. قبل إغلاق جميع الشقوق ، تأكد من أن القسطرة الموضوعة تعمل. تحقق من الوظيفة باستخدام حقنة سعة 1 مل متصلة بإبرة هوبر المحددة للمنفذ.
2. حقن 200 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي في منفذ التقطير. ابحث عن تدفق سلس مع عدم التسامح مطلقا مع المقاومة.
3. اغسل المنفذ والقسطرة بنسبة 10٪ هيبارين للحفاظ على المباح.

8. أغلق شقوق الجلد

1. أغلق شقوق الجلد حول خزان المنفذ (الشكل 3C) بخيوط قابلة للامتصاص 3-0.

9. إصلاح طرف القسطرة داخل تجويف البطن

1. ضع خياطة خيط محفظة فضفاضة مع خياطة مستديرة قابلة للامتصاص 4-0 حول عضلة جدار البطن المقطوعة. مرر اللباد القريب للقسطرة داخل الشق.
2. شد خياطة خيط المحفظة المحضرة حول الأنبوب مع الحفاظ على اللباد الثاني خارج خيط المحفظة ، فوق الطبقة العضلية (الشكل 3D) ، وأغلق الجلد بخيوط قابلة للامتصاص 3-0 (الشكل 2).

10. مراقبة الحيوانات بعد الجراحة ويوميا ، وإدارة التسكين والسوائل بعد العملية الجراحية ، والاحتفاظ بسجلات يومية بعد الجراحة لمدة لا تقل عن 7 أيام وحتى الشفاء التام

1. حافظ على عمل القسطرة بحقنة يومية تبلغ 200 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي من خلال القسطرة.

11. حقن السوائل

1. تأكد من عملية ما بعد الإجراء الهادئة عن طريق فحص شق الجلد بعناية.
2. تحضير LPS 2 ملغم / كغم من وزن الجسم للحقن داخل الصفاق (i.p.) عن طريق تخفيف 40 ميكروغرام من LPS مع محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) إلى تركيز عمل قدره 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر (في جوهره ، 10 ميكرولتر ل 2 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم و 200 ميكرولتر من LPS ل 20 غرام من الفئران).
3. ابدأ الحقن في الأسبوع الثاني بعد زرع القسطرة.
   1. أمسك الحيوان برفق باليد غير المهيمنة وقم بتقييد منفذ التقطير أثناء تحريك السبابة والإبهام في اتجاه الرأس.
   2. تطهير الجلد الذي يغطي الخزان مع 70 ٪ من كحول الأيزوبروبيل. استخدم المحقنة المرفقة بإبرة هوبر لحقن LPS.
      1. بعد دخول الميناء بإبرة هوبر ، قم بحقن 100 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي في المنفذ لتأكيد مسار براءة الاختراع.
      2. قم بحقن 200 ميكرولتر من LPS المحضرة ، متبوعة ب 100 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي للري الأنبوبي ، وتأكد من عدم وجود مقاومة.

12. تخدير الفئران قبل حصاد الصفاق وجمع السائل البريتوني

1. بعد 7 أيام من حقن LPS و 2 أسابيع من زرع القسطرة ، خطط للخزعة البريتونية.
2. خطة للتخدير العام.
   1. تخدير الفأر في غرفة إيزوفلوران وحقن المسكن تحت الجلد.
   2. امسك الحيوان من قاعدة الذيل ، واحتفظ بالحيوان على السطح الظهري لليد.
   3. نقل الحيوان إلى غرفة تحريض التخدير المستمر مليئة 3٪ -4٪ إيزوفلوران. تأكد من التخدير العام الكافي من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم في الأطراف الخلفية اليمنى واليسرى. الحفاظ على الحفاظ على التخدير العام مع إيزوفلوران 1٪ -3٪.

13. خزعة البريتوني

1. ضع الحيوان على البطانية الساخنة في وضع ضعيف. قم بعمل شق جلدي في خط الوسط من شبه الخنجري إلى المثانة.
2. قم بتزويد الطائرة تحت اللفافة مع PBS البارد (الشكل 3E).
3. تأكد من تشريح الطائرة بالكامل دون الإخلال بسلامة الصفاق. ابدأ في تشريح الصفاق من الانعكاس البريتوني الجانبي في الربع السفلي الأيسر ، بدءا من الهيلوم إلى الجناح الأيسر ، والمثانة في الجانب السفلي للحفاظ على اتساق العينات بين الحيوانات (الشكل 3F).
4. بعد الحصاد البريتوني ، القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم.

النتائج

كانت جميع القسطرة المزروعة تعمل حتى نهاية الدراسة ، ولم يؤدي إزاحة القسطرة أو التواءها إلى تعقيد أي من القسطرة المزروعة. تم التحقق من صحة التقنية الحالية المعدلة بشكل أكبر باستخدام نموذج ناتج عن التهاب الصفاق باستخدام LPS. تلقت الفئران الضابطة 200 ميكرولتر من الحقن الملحي العادي اليومي ، بي?...

Discussion

تم وصف ثلاثة نماذج الفئران من PD. يتضمن ذلك ثقبا أعمى للسطح البريتوني ، ونظام مفتوح دائم ، ونظام مغلق¹⁰. يتضمن الثقب الأعمى للسطح البريتوني وصولا بريتوني مباشرا مشابها للحقن داخل الصفاق ولكنه لا يسمح بتصريف الديالة. كونها إجراء أعمى ، يمكن لهذه الطريقة أن تجرح الأعضاء الحشوية ف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24