Farelerde Periton Diyalizi Kateter Yerleştirilmesinde Retrograd İmplantasyon Yaklaşımı

Özet

Bu makalede, geleneksel tekniklerle gözlenen önemli teknik sorunlardan kaçınmak için periton diyalizi kateterinin murin modeline implante edilmesine yönelik bir prosedürün modifikasyonları açıklanmaktadır.

Özet

Murin modelleri, periton diyalizinin (PD) periton iltihabı ve fibroz gibi çeşitli yönlerini araştırmak için kullanılır. Bu olaylar, insanlarda periton zarı yetmezliğine neden olmakta ve bu da son dönem böbrek hastalığı (ESKD) olan hastaların yönetiminde derin klinik etkileri nedeniyle yoğun bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir. PD'nin klinik önemine ve ilgili komplikasyonlarına rağmen, mevcut deneysel murin modelleri, modellerin performansını tehlikeye atan temel teknik zorluklardan muzdariptir. Bunlar PD kateter göçünü ve bükülmesini içerir ve genellikle daha erken kateter çıkarılmasını garanti eder. Bu sınırlamalar aynı zamanda bir çalışmayı tamamlamak için daha fazla sayıda hayvana duyulan ihtiyacı da artırmaktadır. Bu dezavantajları ele alan bu çalışma, bir murin modelinde yaygın olarak gözlenen PD kateter komplikasyonlarını önlemek için teknik iyileştirmeler ve cerrahi nüanslar sunmaktadır. Ayrıca, bu modifiye model, lipopolisakkarit enjeksiyonları kullanılarak periton iltihabı ve fibrozu indükleyerek doğrulanır. Temel olarak, bu makale deneysel bir PD modeli oluşturmak için geliştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır.

Giriş

Son dönem böbrek hastalığı yükü
Kronik böbrek hastalığı (KBH) dünya çapında bir sağlık sorunudur¹. Mevcut tahminler, dünya çapında 850 milyondan fazla insanın böbrek hastalığına sahip olduğunu göstermektedir. Böbrek hastalığının prevalansı, diyabetli insan sayısını (422 milyon) neredeyse iki katına çıkarmaktadır ve dünya çapında kanser (42 milyon) veya HIV / AIDS (36,7 milyon) hastalarının prevalansının 20 katından fazladır². Yaklaşık yedi Amerikalıdan birinde KBH vardır ve 1000 Amerikalıdan ikisinde böbrek nakli veya diyaliz desteği gerektiren ESKD vardır³. ESKD'nin dünya çapında artan yükü göz önüne alındığında, diyaliz teknolojisinin optimize edilmesi çok önemlidir³.

Periton diyalizi
PD, Amerika Birleşik Devletleri'nde ESKD tedavisinde önemli ölçüde az kullanılan bir yöntemdir. Amerika Birleşik Devletleri Renal Veri Sistemi'ne (USRDS) göre, yaygın PD hastalarının yüzdesi 2020 yılında sadece% 11 idi ^4,5. PD, merkez içi hemodiyalize (HD) göre, daha iyi bir yaşam kalitesi, daha az klinik ziyaret ve Medicare harcamalarında azalma dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar ^6,7. Ek olarak, PD ev tabanlı bir tedavidir ve sıklıkla hemodiyaliz kateterleriyle ilişkili olan bakteriyemi ve endokardit gibi ciddi enfeksiyon riskinin çok daha düşük olmasıyla ilişkilidir. Ayrıca, acil başlangıç protokolü ile PD hızlı bir şekilde başlatılabilir, bu da yerleşik vasküler kateterlerle diyaliz başlatma ihtiyacını azaltır⁸. PD, pediatrik ESKD popülasyonunda tercih edilen diyaliz yöntemi olarak kabul edilir⁹.

Periton diyalizi ile indüklenen periton yetmezliği
PD, periton içine PD sıvısının (diyalizat) sokulmasını gerektirir, bu da zamanla periton zarının iltihaplanmasına ve yeniden şekillenmesine neden olur. Periton iltihabı fibrozu tetikler ve zamanla membranın ultrafiltrasyon yeteneklerinin potansiyel kaybıyla sonuçlanır. Periton zarının korunması PD'de önemli bir zorluktur ve daha fazla araştırma, uygulayıcılar için en iyi klinik uygulamaların mevcut olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Periton enfeksiyonu ve inflamasyonun, solute, su taşıma kinetik ve membran yetmezliğinin patofizyolojik mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olmak için iyi kurulmuş murin modelleri vardır; Yine de, kateter ile ilgili teknik sorunlar genellikle bu modelleri¹⁰ ile sınırlar.

Periton zarı değişikliklerinin analizi
ESKD hastalarında, diyalizat geleneksel olarak periton boşluğuna derin ve yüzeysel bir manşet ile bir Tenkhoff kateteri yoluyla verilir. Hastalar potansiyel olarak kateter göçü, infüzyon ağrısı ve diyalizat ^11,12,13'ün zayıf drenajı gibi kateterle ilişkili komplikasyonlar yaşayabilirler. Bu komplikasyonları en aza indirmek için sarmal veya düz insanlar için iki ana periton kateteri türü tanıtılmıştır¹². PD kateter sağkalımını uzatmak için konvansiyonel iki kelepçeli kateterlere ekstra bir manşet de dahil olmak üzere çeşitli modifikasyonlar eklenmiştir¹¹. Yerleştirme tekniği, kaynakların mevcudiyeti ve uzmanlık düzeyi de dahil olmak üzere sağkalım sonrası eklenecek kateter göçünü önleyerek çeşitli faktörlere göre değişir¹⁴.

Buna karşılık, periton diyalizinin murin modelleri, insan periton kateterlerine kıyasla teknikler ve amaç açısından temel farklılıklara sahiptir. Örneğin, murin modellerindeki periton kateterleri öncelikle membran değişikliklerini incelemek için kullanılır ve çift yönlü drenaj fonksiyonları için daha az amaçlanmıştır. Mevcut teknik, hayvanların taşınması nedeniyle potansiyel port yerinden çıkması ve kateter göçünden muzdariptir. Geleneksel murin modellerinde, erişim portları cilde sabitlenmemiştir. Bu yön, uyanık hayvanlarda yerinden çıkabilecek ve kateter göçüne neden olabilecek dengesiz bir erişim limanı yarattı. Periton membranı araştırmalarında murin modellerinin önemi göz önüne alındığında, güvenilir modeller üretmek için etkili cerrahi tekniklerin oluşturulması zorunludur. Bu nedenle, PD kateter yerleştirmenin geleneksel modelini optimize etmek için yola çıktık. Kateterin kendisinin periton zarında histopatolojik değişikliklere neden olduğunu ve bu nedenle hayvan çalışmalarında PD solüsyonlarının etkisine ilişkin herhangi bir sonucun PD kateteri bağlamında yabancı cisim olarak yorumlanması gerektiğini belirtmek önemlidir^15,16,17.

Periton zarı histopatolojisi
PD yetmezliği esas olarak fibroz ve aşırı anjiyogenez ile ilişkilidir ve ozmolar konsantrasyon gradyanının kaybına neden olur. Ek olarak, periton zarı filtrasyon kapasitesi peritonitten etkilenebilir. Ek olarak, enfeksiyöz peritonit, periton diyalizinden hemodiyalize diyaliz diyalizine diyaliz modalitesinde değişiklik için iyi bilinen bir nedendir. ¹⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma için, sekiz dişi C57BL / 6J fare, 8-12 haftalık ve ortalama 20 g ağırlığında kullanılmıştır. Fareler standart koşullar altında barındırıldı ve chow ve su ad libitum ile beslendi. Bu çalışma Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), Boston Üniversitesi Tıp Merkezi (AN-1549) onayı ile gerçekleştirilmiştir. Burada açıklanan prosedürler steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir.

1. Fareyi bir İzofluran odasında anestezi altına alın ve analjeziği deri altından enjekte edin

1. Hayvanı kuyruğun tabanından tutun. Hayvanı baskın olmayan elin dorsum yüzeyinde tutun.
2. Hayvanı% 3 -% 4 izofluran ile doldurulmuş sürekli anestezik indüksiyon odasına aktarın. Sağ ve sol arka bacaklarda ayak parmağı sıkışma refleksinin yokluğunda yeterli genel anesteziyi onaylayın. Genel anestezinin sürdürülmesini İzofluran ile% 1 -% 3 oranında tutun.
3. Her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
4. Subkutan bir Buprenorfin enjeksiyonu uygulayın.
   1. Buprenorfin stoğunu, 0.03 mg / mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için% 0.9'luk sodyum klorür (NaCl)% 0.9'luk bir konsantrasyonda çözün.
   2. 20 g'lık bir farede ameliyattan 20 dakika önce 500 μL steril NaCl% 0.9 ile birlikte 0.05-0.1 mg / kg 0.03 mg / mL Buprenorfin dozu enjekte edin (fare başına 2 μg veya 66 μL 0.03 mg / mL Buprenorfin).

2. Cilt hazırlığı

1. Tamamen anestezi uygulanmış fareyi sol yanal pozisyonda yerleştirin ve sağ kanadını ısıtma battaniyesine maruz bırakın. Karnın sağ tarafını, paraspinal bölgeye orta çizgiye yakın ve hayvanın kuyruğuna kadar tıraş edin.
2. Tıraş edilen bölgeyi, antiseptik solüsyonun veya ovmanın alternatif uygulaması ve% 70 alkol veya steril salin ile dairesel bir hareketle, cerrahi kesi bölgesinden başlayarak ve dışa doğru hareket ederek pamuklu çubukla üç kez dezenfekte edin. Her kullanımdan sonra pamuklu çubuğu atın. Hipotermiyi kötüleştirebileceğinden, hayvanın cerrahi olmayan alanlarını alkol veya antiseptik ile aşırı ıslatmamaya dikkat edin.
   NOT: Antiseptik solüsyonların uygun şekilde seyreltilmesi ve ameliyat sırasında cilt üzerinde cerrahi ovma bırakmamak önemlidir, çünkü tahriş edici olabilirler ve durulanmaları gerekir. Sıcaklığın düşmediğinden emin olmak için prosedür sırasında ısıtma battaniyesinin sıcaklığını sık sık kontrol edin.

3. Kateter uzunluğunu ölçün ve karın içindeki yerleştirme noktasını ve hazırlanan cildin üzerindeki tüp sistemini işaretleyin

1. Erişim portu cebini hayvanın kuyruğunun 1 cm yukarısına atayın. Kurulum segmentini, baskın olmayan işaret ve başparmak parmağınızla kuyruğun yakınındaki atanmış alanın üzerinde tutun.
2. Kateteri cildin üzerine yerleştirin ve kateterin tüp yerleştirme yerini karın boşluğuna tahmin edin. Ön orta hattın yakınındaki tüpün minimum bükülmesine saygı göstererek tüp yerleştirme için atanan yeri işaretleyin.
   NOT: Tüm prosedürler steril eldivenlerle yapılmalı ve ölçüm sırasında kateter steril tutulmalıdır. Cerrahi aletler kullanılmadan önce 121 °C'de otoklavlanmalıdır. Prosedür için gerekli aletler için Ek Şekil S1'e bakınız.

4. Peritoneal kateter rezervuar bölümünü özelleştirin

1. Fare kulak etiketleyicisi ile rezervuar bölümünün çerçevesi üzerinde bir yan delik açın (Şekil 1 ve Şekil 2). Kulak yumruğunun cerrahi bir araç olduğu ve steril olması gerektiği belirtilmelidir.

5. Damlatma portunu yerleştirin

1. Kuyruğun 1 cm yukarısında yatay 1 cm genişliğinde bir cilt kesisi yapın. Subkutan düzlemi altta yatan kas tabakasından açıkça diseke ederek kateter yerleştirilmesi için bir kese yapın ve damlatma portunun ideal port cebinde serbestçe bulunmasını sağlayın.
2. Tüp yerleşimi için eğik bir tünel oluşturmak üzere iris makas ucunu orta hatta doğru tutun (Şekil 3A).
3. 3.0 dikişini özelleştirilmiş yan delikten geçirin. Geçirilen dikişi sıkarak, tüp seyrini sefalad tutarak erişim portunu kas yatağına sabitleyin.

6. Kateter ucu yerleştirme yeri insizyonunu yaptırın

1. Orta çizginin yakınında önceden işaretlenmiş alan üzerinde 1 cm'lik bir kesi yapın. Makası kanaldan geçirerek iyi gelişmiş yolu onaylayın.
2. Kateteri retrograd bir kursa yerleştirmek için kateter ucunu forseps ile nazikçe seçin.
   NOT: Tüpün yan deliklerini sıkmaktan kaçının.
3. Kateter tüpünü hazırlanan kanaldan geçirin (Şekil 3B). Sağ orta hatta yakın kas tabakası üzerinde 1 cm'lik bir kesi yapın.

7. Kateterin işleyişini onaylayın

1. Tüm kesileri kapatmadan önce, yerleştirilen kateterin işlevsel olduğundan emin olun. Bağlantı noktası için özel Huber iğnesine takılı 1 mL'lik bir şırınga ile işlevi kontrol edin.
2. Damlatma portuna 200 μL normal salin enjekte edin. Direnç için sıfır toleransa sahip pürüzsüz bir akış arayın.
3. Açıklığı korumak için portu ve kateteri% 10 heparin ile yıkayın.

8. Cilt kesilerini kapatın

1. Port rezervuarı etrafındaki deri kesilerini (Şekil 3C) 3-0 emilebilir dikişlerle kapatın.

9. Kateter ucunu karın boşluğunun içine sabitleyin

1. Kesilmiş karın duvarı kasının etrafına 4-0 yuvarlak emilebilir dikiş ile gevşek bir çanta ipi dikişi yerleştirin. Kateterin proksimal keçesini insizyonun içinden geçirin.
2. Hazırlanan çanta ipi dikişini tüpün etrafına sıkın, ikinci keçeyi çanta ipinin dışında, kas tabakasının üzerinde tutun (Şekil 3D) ve cildi 3-0 emilebilir dikişlerle kapatın (Şekil 2).

10. Hayvanları postoperatif ve günlük olarak izlemek, postoperatif analjezi ve sıvıları uygulamak ve günlük postoperatif kayıtları en az 7 gün boyunca ve tamamen iyileşene kadar saklayın.

1. Kateterden günlük 200 μL normal salin enjeksiyonu ile kateteri işlevsel tutun.

11. Sıvı enjeksiyonları

1. Cilt insizyonunu dikkatlice inceleyerek olaysız prosedür sonrası süreci onaylayın.
2. LPS'nin 40 μg'sini steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile 0.2 μg / μL çalışma konsantrasyonuna (özünde, 2 μg / g vücut ağırlığı için 10 μL ve 20 g fareler için 200 μL LPS) seyrelterek intraperitoneal enjeksiyonlar için LPS 2 mg / kg vücut ağırlığı hazırlayın (yani).
3. Kateter implantasyonunu takip eden ikinci haftada enjeksiyonlara başlayın.
   1. Hayvanı baskın olmayan elinizle nazikçe tutun ve işaret ve başparmak parmaklarını sefalad yönünde hareket ettirirken damlatma portunu kısıtlayın.
   2. Rezervuarın üzerindeki cildi% 70 izopropil alkol ile dezenfekte edin. LPS'yi enjekte etmek için Huber iğnesine bağlı şırıngayı kullanın.
      1. Huber iğnesiyle limana girdikten sonra, patent seyrini onaylamak için porta 100 μL normal salin enjekte edin.
      2. Hazırlanan 200 μL LPS'yi, ardından tüp sulama için 100 μL normal salini enjekte edin ve direnç olmadığından emin olun.

12. Peritonu toplamadan önce fareleri anestezi altına alın ve periton sıvısını toplayın

1. 7 günlük LPS enjeksiyonu ve 2 haftalık kateter implantasyonunu takiben, periton biyopsisini planlayın.
2. Genel anestezi için plan yapın.
   1. Fareyi bir izofluran odasında anestezi altına alın ve analjeziği deri altından enjekte edin.
   2. Hayvanı kuyruğun tabanından tutun ve hayvanı elin dorsum yüzeyinde tutun.
   3. Hayvanı% 3 -% 4 izofluran ile doldurulmuş sürekli anestezik indüksiyon odasına aktarın. Sağ ve sol arka bacaklarda ayak parmağı sıkışma refleksinin yokluğunda yeterli genel anesteziyi onaylayın. Genel anestezinin sürdürülmesini izofluran ile% 1 -% 3 oranında tutun.

13. Peritoneal biyopsi

1. Hayvanı ısıtılmış battaniyeye sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Sub-ksifoidden mesaneye orta hat cilt kesisi yapın.
2. Subfasyal düzlemi soğuk PBS ile perfüze edin (Şekil 3E).
3. Peritonun bütünlüğünü bozmadan düzlemin tamamen disseke edildiğinden emin olun. Peritonu, sol alt kadrandaki lateral periton yansımasından, hilumdan başlayarak sol kanattan başlayarak ve alt taraftaki mesaneden, numuneleri hayvanlar arasında tutarlı tutmak için diseke etmeye başlayın (Şekil 3F).
4. Peritoneal hasadı takiben, hayvanı servikal çıkık ile ötenazileştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İmplante edilen tüm kateterler çalışmanın sonuna kadar işlevseldi ve kateter yerinden çıkması veya bükülmesi implante edilen kateterlerin hiçbirini komplike hale getirmedi. Mevcut, modifiye edilmiş teknik, LPS kullanılarak peritonite bağlı bir modelle daha da doğrulandı. Kontrol fareleri günlük normal salin enjeksiyonlarından 200 μL alırken, deneysel farelere kateter implantasyonundan sonraki toplam 7 gün boyunca protokol adımı 11'de tartışıldığı gibi 200 μL LPS enjekte edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

PD'nin üç murin modeli tanımlanmıştır. Bu, periton yüzeyinin kör bir şekilde delinmesini, açık-kalıcı bir sistemi ve kapalı bir sistemi^{içerir 10}. Peritoneal yüzeyin kör delinmesi, intraperitoneal enjeksiyonlara benzer şekilde doğrudan periton erişimini içerir, ancak diyalizatın drenajına izin vermez. Kör bir prosedür olan bu yöntem, abdominal viseral organlara zarar verebilir. Açık-kalıcı sistem modeli, diyaliz kateterini ve damlatma portunu vücudun dışında tutar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24