Une approche d’implantation rétrograde pour la mise en place d’un cathéter de dialyse péritonéale chez la souris

Résumé

Cet article décrit les modifications d’une procédure d’implantation d’un cathéter de dialyse péritonéale dans un modèle murin afin d’éviter les problèmes techniques majeurs observés avec les techniques conventionnelles.

Résumé

Des modèles murins sont utilisés pour sonder divers aspects de la dialyse péritonéale (MP), tels que l’inflammation péritonéale et la fibrose. Ces événements entraînent une défaillance de la membrane péritonéale chez l’homme, qui reste un domaine de recherche intense en raison de ses profondes implications cliniques dans la prise en charge des patients atteints d’insuffisance rénale terminale (MRT). Malgré l’importance clinique de la MP et de ses complications, les modèles murins expérimentaux actuels souffrent de défis techniques clés qui compromettent la performance des modèles. Ceux-ci comprennent la migration et le pliage du cathéter et justifient généralement un retrait plus précoce du cathéter. Ces limites entraînent également la nécessité d’un plus grand nombre d’animaux pour compléter une étude. Abordant ces inconvénients, cette étude introduit des améliorations techniques et des nuances chirurgicales pour prévenir les complications courantes du cathéter de MP observées dans un modèle murin. De plus, ce modèle modifié est validé en induisant une inflammation péritonéale et une fibrose à l’aide d’injections de lipopolysaccharidiques. Essentiellement, cet article décrit une méthode améliorée pour créer un modèle expérimental de MP.

Introduction

Charge de morbidité rénale terminale
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est un problème de santé mondial¹. Les estimations actuelles suggèrent que plus de 850 millions de personnes dans le monde souffrent d’une maladie rénale. La prévalence de la maladie rénale double presque le nombre de personnes atteintes de diabète (422 millions) et est plus de 20 fois supérieure à la prévalence du cancer (42 millions) ou du VIH/sida (36,7 millions) dans le monde². Environ un Américain sur sept souffre d’IRC et deux Américains sur 1 000 ont une MRT nécessitant une greffe de rein ou une dialyse³. Compte tenu du fardeau croissant de l’IRT dans le monde entier, l’optimisation de la technologie de dialyse est cruciale³.

Dialyse péritonéale
La MP est une modalité considérablement sous-utilisée pour le traitement de la MRT aux États-Unis. Selon le système de données rénales des États-Unis (USRDS), le pourcentage de patients atteints de MP prévalents n’était que de 11% en 2020 ^4,5. La MP confère plusieurs avantages par rapport à l’hémodialyse en centre (HD), notamment une meilleure qualité de vie, moins de visites à la clinique et une diminution des dépenses de Medicare ^6,7. De plus, la MP est une thérapie à domicile et est associée à un risque beaucoup plus faible d’infections graves telles que la bactériémie et l’endocardite qui sont souvent liées aux cathéters d’hémodialyse. De plus, la MP peut être initiée rapidement avec un protocole de démarrage urgent, ce qui réduit le besoin d’initiation de la dialyse avec des cathéters vasculaires à demeure⁸. La MP est considérée comme la méthode de dialyse préférée dans la population pédiatrique de MRT⁹.

Insuffisance péritonéale induite par la dialyse péritonéale
La MP implique l’introduction de liquide (dialysat) dans le péritoine, ce qui entraîne une inflammation et un remodelage de la membrane péritonéale au fil du temps. L’inflammation péritonéale déclenche la fibrose, aboutissant à la perte potentielle des capacités d’ultrafiltration de la membrane au fil du temps. La préservation de la membrane péritonéale est un défi important dans la MP, et d’autres recherches sont d’une importance cruciale pour s’assurer que les meilleures pratiques cliniques sont disponibles pour les praticiens. Il existe des modèles murins bien établis pour aider à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’infection péritonéale et de l’inflammation, du soluté, de la cinétique du transport de l’eau et de la défaillance membranaire; Pourtant, des problèmes techniques avec le cathéter limitent souvent ces modèles¹⁰.

Analyse des changements de la membrane péritonéale
Chez les patients atteints d’IRT, le dialysat est traditionnellement introduit dans la cavité péritonéale par un cathéter Tenkhoff avec un brassard profond et superficiel. Les patients peuvent potentiellement présenter des complications liées au cathéter, notamment la migration du cathéter, la douleur à la perfusion et un mauvais drainage du dialysat^11,12,13. Deux grands types de cathéters péritonéaux ont été introduits pour les humains, enroulés ou droits, afin de minimiser ces complications¹². Plusieurs modifications, y compris un brassard supplémentaire aux cathéters conventionnels à deux manchettes, ont été ajoutées aux cathéters originaux pour prolonger la survie du cathéter¹¹. La technique d’insertion varie en fonction de plusieurs facteurs en évitant l’ajout de la migration du cathéter après la survie, notamment la disponibilité des ressources et le niveau d’expertise¹⁴.

En revanche, les modèles murins de dialyse péritonéale présentent des différences fondamentales dans les techniques et le but par rapport aux cathéters péritonéaux humains. Par exemple, les cathéters péritonéaux dans les modèles murins sont principalement utilisés pour étudier les altérations de la membrane et sont moins destinés aux fonctions de drainage bidirectionnel. La technique actuelle souffre d’un déplacement potentiel du port et de la migration du cathéter en raison de la manipulation des animaux. Dans les modèles murins conventionnels, les ports d’accès n’étaient pas fixés à la peau. Cet aspect a créé un port d’accès instable, qui, chez les animaux éveillés, pourrait être délogé, entraînant la migration des cathéters. Compte tenu de l’importance des modèles murins dans la recherche sur la membrane péritonéale, il est impératif de créer des techniques chirurgicales efficaces pour générer des modèles fiables. Par conséquent, nous avons entrepris d’optimiser le modèle conventionnel de placement du cathéter. Il est important de noter que le cathéter lui-même provoque des altérations histopathologiques de la membrane péritonéale et, par conséquent, toute conclusion concernant l’effet des solutions de MP dans les études animales doit être interprétée dans le contexte du cathéter comme un corps étranger^15,16,17.

Histopathologie de la membrane péritonéale
L’échec de la MP est principalement lié à la fibrose et à l’angiogenèse excessive entraînant la perte d’un gradient de concentration osmolaire. De plus, la capacité de filtration de la membrane péritonéale pourrait être affectée par une péritonite. En outre, la péritonite infectieuse est une cause bien établie de changement dans la modalité de dialyse de la dialyse péritonéale à l’hémodialyse. ¹⁸.

Protocole

Pour cette étude, huit souris C57BL/6J femelles, âgées de 8 à 12 semaines, et pesant en moyenne 20 g ont été utilisées. Les souris ont été logées dans des conditions standard et ont été nourries avec du chow et de l’eau ad libitum. Cette étude a été réalisée avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Boston University Medical Center (AN-1549). Les procédures décrites ici ont été effectuées dans des conditions stériles.

1. Anesthésier la souris dans une chambre d’isoflurane et injecter l’analgésique par voie sous-cutanée

1. Tenez l’animal de la base de la queue. Gardez l’animal sur la surface dorsale de la main non dominante.
2. Transférer l’animal dans la chambre d’induction anesthésique continue remplie d’isoflurane à 3 % à 4 %. Confirmer une anesthésie générale adéquate par l’absence de réflexe de pincement des orteils dans les membres postérieurs droit et gauche. Gardez le maintien de l’anesthésie générale avec Isoflurane 1% -3%.
3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux.
4. Administrer une injection sous-cutanée de buprénorphine.
   1. Dissoudre le stock de buprénorphine à une concentration de 0,3 mg/mL dans du chlorure de sodium (NaCl) à 0,9 % pour atteindre la concentration finale de 0,03 mg/mL.
   2. Injecter une dose de 0,05-0,1 mg/kg de 0,03 mg/mL de buprénorphine, avec 500 μL de NaCl stérile 0,9 %, 20 min avant la chirurgie chez une souris de 20 g (2 μg ou 66 μL de 0,03 mg/mL de buprénorphine par souris).

2. Préparation de la peau

1. Placez la souris entièrement anesthésiée en position latérale gauche, en exposant son flanc droit à la couverture chauffante. Rasez le côté droit de l’abdomen, juste près de la ligne médiane de la région paraspinale et jusqu’à la queue de l’animal.
2. Désinfectez la zone rasée trois fois à l’aide d’un coton-tige avec l’application alternée de la solution antiseptique ou du gommage et de l’alcool à 70% ou d’une solution saline stérile dans un mouvement circulaire, en commençant par le site de l’incision chirurgicale et en se déplaçant vers l’extérieur. Jeter le coton-tige après chaque utilisation. Veillez à ne pas trop mouiller les zones non chirurgicales de l’animal avec de l’alcool ou un antiseptique, car cela pourrait aggraver l’hypothermie.
   REMARQUE: Il est important de diluer correctement les solutions antiseptiques et de ne pas laisser de gommages chirurgicaux sur la peau pendant la chirurgie, car ils peuvent être irritants et doivent être rincés. Vérifiez fréquemment la température de la couverture chauffante pendant la procédure pour vous assurer que la température ne baisse pas.

3. Mesurer la longueur du cathéter et marquer le point d’insertion dans l’abdomen et le tube sur la peau préparée

1. Attribuez la poche du port d’accès à 1 cm au-dessus de la queue de l’animal. Tenez le segment d’installation avec l’index non dominant et le doigt du pouce sur la zone assignée près de la queue.
2. Placez le cathéter au-dessus de la peau et estimez l’emplacement de l’insertion du tube du cathéter dans la cavité abdominale. Marquez l’endroit assigné pour l’insertion du tube, en respectant la flexion minimale du tube près de la ligne médiane antérieure.
   REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées avec des gants stériles et le cathéter doit rester stérile pendant la mesure. Les outils chirurgicaux doivent être autoclavés à 121 °C avant utilisation. Reportez-vous à la figure supplémentaire S1 pour les instruments requis pour la procédure.

4. Personnaliser la section du réservoir du cathéter péritonéal

1. Percez un trou latéral sur le cadre de la section du réservoir à l’aide de l’étiquette auriculaire de la souris (Figure 1 et Figure 2). Il convient de noter que le poinçon d’oreille est un outil chirurgical et qu’il doit être stérile.

5. Placez le port d’instillation

1. Faites une incision cutanée horizontale de 1 cm de large à 1 cm au-dessus de la queue. Disséquez carrément le plan sous-cutané de la couche musculaire sous-jacente pour faire une poche pour le placement du cathéter afin de s’assurer que l’orifice d’instillation réside librement dans la poche d’orifice idéale.
2. Gardez l’extrémité des ciseaux de l’iris vers la ligne médiane pour créer un tunnel oblique pour la mise en place du tube (Figure 3A).
3. Passez la suture 3.0 du trou latéral personnalisé. Fixez l’orifice d’accès au lit musculaire en serrant la suture passée, en gardant la céphalade de cours de tubulure.

6. Faites l’incision du site d’insertion de l’embout du cathéter

1. Faites une incision de 1 cm sur la zone précédemment marquée près de la ligne médiane. Confirmez le tractus bien développé en passant des ciseaux à travers le tract.
2. Cueillez doucement l’embout du cathéter avec une pince pour placer le cathéter dans une trajectoire rétrograde.
   REMARQUE: Évitez de pincer les trous latéraux du tube.
3. Faire passer le tube du cathéter dans le tractus préparé (figure 3B). Faites une incision de 1 cm sur la couche musculaire près de la ligne médiane droite.

7. Confirmer le fonctionnement du cathéter

1. Avant de fermer toutes les incisions, assurez-vous que le cathéter placé est fonctionnel. Vérifiez la fonction avec une seringue de 1 mL fixée à l’aiguille Huber spécifique pour le port.
2. Injectez 200 μL de solution saline normale dans l’orifice d’instillation. Recherchez un écoulement lisse avec une tolérance zéro pour la résistance.
3. Rincer l’orifice et le cathéter avec 10% d’héparine pour maintenir la perméabilité.

8. Fermez les incisions cutanées

1. Fermez les incisions cutanées autour du réservoir d’orifice (Figure 3C) avec des sutures résorbables 3-0.

9. Fixez l’extrémité du cathéter à l’intérieur de la cavité abdominale

1. Placez une suture lâche avec une suture résorbable ronde 4-0 autour du muscle de la paroi abdominale incisée. Passez le feutre proximal du cathéter à l’intérieur de l’incision.
2. Serrez la suture préparée autour du tube tout en maintenant le deuxième feutre à l’extérieur du cordon de la bourse, sur la couche musculaire (Figure 3D), et fermez la peau avec 3-0 sutures résorbables (Figure 2).

10. Surveiller les animaux postopératoirement et quotidiennement, administrer des analgésiques et des liquides postopératoires et conserver des dossiers postopératoires quotidiens pendant au moins 7 jours et jusqu’à leur rétablissement complet.

1. Gardez le cathéter fonctionnel avec une injection quotidienne de 200 μL de solution saline normale à travers le cathéter.

11. Injections de liquide

1. Confirmez le processus post-opératoire sans incident en inspectant soigneusement l’incision cutanée.
2. Préparer le LPS 2 mg/kg de poids corporel pour les injections intrapéritonéales (i.p.) en diluant 40 μg du LPS avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile à la concentration utile de 0,2 μg/μL (essentiellement, 10 μL pour 2 μg/g de poids corporel et 200 μL de LPS pour les souris de 20 g).
3. Commencez les injections dans la deuxième semaine suivant l’implantation du cathéter.
   1. Tenez doucement l’animal avec la main non dominante et retenez l’orifice d’instillation tout en déplaçant l’index et le pouce dans la direction de la céphale.
   2. Désinfectez la peau recouvrant le réservoir avec de l’alcool isopropylique à 70%. Utilisez la seringue fixée à l’aiguille Huber pour injecter le LPS.
      1. Après être entré dans le port avec l’aiguille Huber, injectez 100 μL de solution saline normale dans le port pour confirmer le cours du brevet.
      2. Injectez les 200 μL préparés de LPS, suivis des 100 μL de solution saline normale pour l’irrigation par tube, et assurez-vous qu’il n’y a pas de résistance.

12. Anesthésiez les souris avant de prélever le péritoine et recueillez le liquide péritonéal

1. Après 7 jours d’injections de LPS et 2 semaines d’implantation de cathéter, prévoyez la biopsie péritonéale.
2. Prévoyez une anesthésie générale.
   1. Anesthésiez la souris dans une chambre d’isoflurane et injectez l’analgésique par voie sous-cutanée.
   2. Tenez l’animal à la base de la queue et maintenez-le sur la surface dorsale de la main.
   3. Transférer l’animal dans la chambre d’induction anesthésique continue remplie d’isoflurane à 3 % à 4 %. Confirmer une anesthésie générale adéquate par l’absence de réflexe de pincement des orteils dans les membres postérieurs droit et gauche. Maintenir le maintien de l’anesthésie générale avec de l’isoflurane 1% -3%.

13. Biopsie péritonéale

1. Placez l’animal sur la couverture chauffante en décubitus dorsal. Faites une incision cutanée médiane de la sous-xiphoïde à la vessie.
2. Perfuser le plan sous-fascial avec du PBS froid (Figure 3E).
3. Assurez-vous que l’avion est complètement disséqué sans perturber l’intégrité du péritoine. Commencez à disséquer le péritoine à partir de la réflexion péritonéale latérale au quadrant inférieur gauche, en commençant par le hile jusqu’au flanc gauche, et la vessie dans l’aspect inférieur pour maintenir la cohérence des échantillons entre les animaux (figure 3F).
4. Après la récolte péritonéale, euthanasier l’animal par luxation cervicale.

Résultats

Tous les cathéters implantés étaient fonctionnels jusqu’à la fin de l’étude, et le déplacement ou le pliage du cathéter n’a compliqué aucun des cathéters implantés. La technique actuelle modifiée a été validée avec un modèle induit par la péritonite à l’aide de LPS. Les souris témoins ont reçu 200 μL d’injections quotidiennes normales de solution saline, tandis que les souris expérimentales ont reçu 200 μL de LPS, comme indiqué à l’étape 11 du protocole, pendant un total de 7 jours a...

Discussion

Trois modèles murins de MP sont décrits. Cela comprend une ponction aveugle de la surface péritonéale, un système ouvert-permanent et un système fermé¹⁰. La ponction aveugle de la surface péritonéale implique un accès péritonéal direct similaire aux injections intrapéritonéales mais ne permet pas le drainage du dialysat. Étant une procédure en aveugle, cette méthode peut blesser les organes viscéraux abdominaux. Le modèle de système ouvert-permanent maintient le cathéter de di...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24