一种小鼠腹膜透析导管放置的逆行植入方法

摘要

本文描述了在小鼠模型中植入腹膜透析导管的程序的修改，以避免使用传统技术观察到的主要技术问题。

摘要

小鼠模型用于探测腹膜透析（PD）的各个方面，例如腹膜炎症和纤维化。这些事件导致人类腹膜衰竭，由于其在管理终末期肾病（ESKD）患者方面具有深远的临床意义，因此仍然是一个紧张的研究领域。尽管PD及其相关并发症具有临床重要性，但目前的实验小鼠模型面临着影响模型性能的关键技术挑战。这些包括PD导管移位和扭结，通常需要更早移除导管。这些限制也推动了对更多动物完成研究的需求。针对这些缺点，本研究引入了技术改进和手术细微差别，以防止小鼠模型中常见的PD导管并发症。此外，这种改进的模型通过使用脂多糖注射诱导腹膜炎症和纤维化来验证。从本质上讲，本文描述了一种创建PD实验模型的改进方法。

引言

终末期肾病负担
慢性肾脏病（CKD）是一个全球性的健康问题¹。目前的估计表明，全世界有超过8.5亿人患有肾脏疾病。肾脏病的患病率几乎是糖尿病患者人数（4.22亿）的两倍，^{是全世界癌症}（4200万）或艾滋病毒/艾滋病患者（3670万）患病率的20倍以上2。大约七分之一的美国人患有CKD，每1，000名美国人中就有2名患有ESKD，需要肾移植或透析支持³。考虑到全球ESKD负担不断加重，优化透析技术至关重要³.

腹膜透析
在美国，PD 是一种治疗 ESKD 的未充分利用的方式。根据美国肾脏数据系统（USRDS）的数据，2020年PD患者患病率仅为11%4^，5。与中心血液透析（HD）相比，PD具有几个优势，包括更好的生活质量，更少的诊所就诊次数以及减少^{医疗保险支出6，7}。此外，PD是一种基于家庭的疗法，与严重感染（如菌血症和心内膜炎）的风险要低得多，这些感染通常与血液透析导管有关。此外，PD可以通过紧急启动方案快速启动，从而减少了使用留置血管导管开始透析^{的需求8。}PD被认为是儿科ESKD人群的首选透析方法⁹。

腹膜透析引起的腹膜损伤
PD需要将PD液（透析液）引入腹膜，随着时间的推移导致腹膜发炎和重塑。腹膜炎症会引发纤维化，最终导致膜超滤能力随着时间的推移而丧失。腹膜的保存是PD的一项重大挑战，进一步的研究对于确保从业者获得最佳临床实践至关重要。有完善的小鼠模型有助于进一步了解腹膜感染和炎症、溶质、水运输动力学和膜衰竭的病理生理机制;尽管如此，导管的技术问题通常会限制这些型号¹⁰。

分析腹膜变化
在ESKD患者中，透析液传统上通过具有深而浅表袖带的Tenkhoff导管引入腹膜腔。患者可能会出现导管相关并发症，包括导管迁移、输液疼痛和透析液引流不良¹¹，^12，13。已经为人类引入了两种主要类型的腹膜导管，盘绕或直管，以尽量减少这些并发症¹²。在原始导管上增加了一些修改，包括对传统双袖带导管的额外袖带，以延长PD导管的存活期¹¹。插入技术根据几个因素而有所不同，通过防止在生存后添加导管迁移，包括资源的可用性和专业知识水平¹⁴。

相比之下，与人腹膜导管相比，腹膜透析的小鼠模型在技术和目的上具有根本差异。例如，小鼠模型中的腹膜导管主要用于研究膜改变，较少用于双向引流功能。由于动物的处理，目前的技术存在潜在的端口移位和导管迁移。在传统的小鼠模型中，接入端口不固定在皮肤上。这一方面造成了一个不稳定的通道，在清醒的动物中可能会被移位，导致导管迁移。鉴于小鼠模型在腹膜研究中的重要性，必须创建有效的手术技术以生成可靠的模型。因此，我们着手优化PD导管放置的传统模型。重要的是要注意，导管本身会导致腹膜的组织病理学改变，因此，关于PD溶液在动物研究中的影响的任何结论都必须在PD导管作为异物的背景下解释¹⁵，^16，17。

腹膜组织病理学
PD失败主要与纤维化和血管生成过多有关，导致渗透压浓度梯度丧失。此外，腹膜过滤能力可能受到腹膜炎的影响。此外，感染性腹膜炎是透析方式从腹膜透析转变为血液透析的明确原因。¹⁸.

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研究方案

在这项研究中，使用了八只雌性C57BL / 6J小鼠，年龄为8-12周，平均体重为20g。将小鼠饲养在标准条件下，并 随意喂食食物和水。这项研究是在波士顿大学医学中心（AN-1549）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准下进行的。此处描述的程序是在无菌条件下进行的。

1.在异氟醚室中麻醉小鼠，并皮下注射镇痛药

1. 从尾巴根部握住动物。将动物保持在非惯用手的背侧。
2. 将动物转移到充满3%-4%异氟醚的连续麻醉诱导室中。通过左右后肢无趾夹反射来确认全身麻醉是否充分。用异氟醚维持全身麻醉1%-3%。
3. 在双眼上涂抹眼药膏。
4. 皮下注射丁丙诺啡。
   1. 将丁丙诺啡原液以0.3mg / mL的浓度溶解在氯化钠（NaCl）0.9%中，以达到0.03mg / mL的最终浓度。
   2. 在20g小鼠（每只小鼠2μg或66μL0.03mg / mL丁丙诺啡）手术前20分钟注射0.03mg / mL丁丙诺啡和500μL无菌NaCl 0.9%的剂量。

2. 皮肤准备

1. 将完全麻醉的小鼠置于左侧位置，将其右翼暴露在加热毯上。剃掉腹部的右侧，刚好靠近脊柱旁区域的中线，并向下到动物的尾巴。
2. 使用棉签对剃须区域进行三次消毒，交替使用消毒液或磨砂膏以及 70% 酒精或无菌盐水以圆周运动，从手术切口部位开始并向外移动。每次使用后丢弃棉签。注意不要用酒精或防腐剂过度弄湿动物的非手术区域，因为这会加重体温过低。
   注意:重要的是适当稀释消毒液，不要在手术过程中将手术磨砂膏留在皮肤上，因为它们可能会有刺激性并且需要冲洗掉。在手术过程中经常检查加热毯的温度，以确保温度不会下降。

3.测量导管长度，并在准备好的皮肤上标记腹部和管道内的插入点

1. 将检修口口袋指定在动物尾巴上方 1 厘米处。用非惯用食指和拇指握住安装段，放在靠近尾巴的指定区域。
2. 将导管放在皮肤上方，并估计导管插入腹腔内的位置。标记管插入的指定位置，尊重管子在前中线附近的最小弯曲。
   注意:所有程序必须戴无菌手套进行，并且在测量过程中导管应保持无菌。手术工具在使用前必须在121°C高压灭菌。有关该程序所需的仪器，请参阅 补充图S1 。

4.定制腹膜导管储液器部分

1. 用鼠标耳标记器在储液罐部分的框架上打一个侧孔（图1 和 图2）。需要注意的是，耳孔是一种手术工具，需要无菌。

5.放置滴注口

1. 在尾巴上方1厘米处做一个1厘米宽的水平皮肤切口。将皮下平面与下面的肌肉层进行钝性解剖，以制作用于放置导管的袋子，以确保滴注口自由地位于理想的口袋中。
2. 保持虹膜剪刀的尖端朝中线，为管子放置形成一个倾斜的隧道（图3A）。
3. 从定制的侧孔通过3.0缝合线。通过收紧通过的缝合线将通道固定在肌肉床上，保持头管路线。

6.使导管尖端插入部位切口

1. 在中线附近先前标记的区域上做一个 1 厘米的切口。通过将剪刀穿过该道来确认发育良好的道。
2. 用镊子轻轻挑动导管尖端，将导管逆行放置。
   注意:避免夹住管子的侧孔。
3. 将导管穿过准备好的通道（图3B）。在靠近右中线的肌肉层上做一个 1 厘米的切口。

7. 确认导管的功能

1. 在关闭所有切口之前，请确保放置的导管正常工作。使用连接到端口的特定Huber针头上的1 mL注射器检查功能。
2. 将200μL生理盐水注入滴注口。寻找对阻力零容忍的平稳流动。
3. 用 10% 肝素冲洗端口和导管以保持通畅。

8. 闭合皮肤切口

1. 用3-0条可吸收缝合线关闭端口储液器周围的皮肤切口（图3C）。

9.将导管尖端固定在腹腔内

1. 在切开的腹壁肌肉周围放置一条松散的钱包绳缝合线，并用 4-0 圆形可吸收缝合线。将导管的近端感觉传递到切口内。
2. 在管子周围收紧准备好的钱包绳缝合线，同时将第二根毛毡保持在钱包绳外，在肌肉层上（图3D），并用3-0条可吸收缝合线关闭皮肤（图2）。

10.术后和每天监测动物，给予术后镇痛和液体，并保持每日术后记录至少7天，直到完全恢复

1. 每天通过导管注射 200 μL 生理盐水，保持导管功能。

11. 液体注射

1. 通过仔细检查皮肤切口来确认平静的术后过程。
2. 通过将40μgLPS与无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释至0.2μg/ μL的工作浓度来制备LPS 2mg / kg体重用于腹膜内注射（ip）。
3. 在导管植入后的第二周开始注射。
   1. 用非惯用手轻轻握住动物，并限制滴注口，同时将食指和拇指向头颅方向移动。
   2. 用70%异丙醇对覆盖在储液罐上的皮肤进行消毒。使用连接到Huber针头的注射器注射LPS。
      1. 用Huber针头进入端口后，向端口中注入100μL生理盐水以确认专利过程。
      2. 注入准备好的 200 μL LPS，然后注入 100 μL 生理盐水进行管灌，并确保没有阻力。

12.在收获腹膜之前麻醉小鼠并收集腹膜液

1. 在 LPS 注射 7 天和导管植入 2 周后，计划腹膜活检。
2. 计划全身麻醉。
   1. 在异氟醚室中麻醉小鼠并皮下注射镇痛药。
   2. 从尾巴根部握住动物，并将动物保持在手的背侧。
   3. 将动物转移到充满3%-4%异氟醚的连续麻醉诱导室中。通过左右后肢无趾夹反射来确认全身麻醉是否充分。用异氟醚维持全身麻醉1%-3%。

13.腹膜活检

1. 将动物仰卧放在加热的毯子上。从剑突下到膀胱做一个中线皮肤切口。
2. 用冷PBS灌注筋膜下平面（图3E）。
3. 确保在不干扰腹膜完整性的情况下完全解剖平面。从左下腹的侧腹膜反射开始解剖腹膜，从肺门到左胁，从下腹解剖膀胱，以保持动物之间的样品一致（图3F）。
4. 腹膜收获后，通过颈椎脱位对动物实施安乐死。

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结果

直到研究结束，所有植入的导管都有效，导管移位或扭结不会使任何植入的导管复杂化。使用LPS的腹膜炎诱导模型进一步验证了当前改进的技术。对照小鼠接受200μL每日生理盐水注射，而实验小鼠在导管植入后总共7天注射200μLLPS，如方案步骤11中所述。

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讨论

描述了PD的三种小鼠模型。这包括腹膜表面的盲穿刺，开放永久性系统和封闭系统¹⁰。腹膜表面盲穿涉及类似于腹膜内注射的直接腹膜通路，但不允许透析液引流。作为一种盲法手术，这种方法会伤害腹部内脏器官。开放式永久性系统模型将透析导管和滴注口保持在体外。然而，这种技术在小鼠中与并发症有关，例如由于动物的运动，感染和无法进行长期实验而导致的袋子断开。...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24