Un approccio di impianto retrogrado per il posizionamento del catetere di dialisi peritoneale nei topi

Riepilogo

Questo articolo descrive le modifiche di una procedura per impiantare un catetere per dialisi peritoneale in un modello murino per evitare importanti problemi tecnici osservati con le tecniche convenzionali.

Abstract

I modelli murini sono impiegati per sondare vari aspetti della dialisi peritoneale (PD), come l'infiammazione peritoneale e la fibrosi. Questi eventi guidano l'insufficienza della membrana peritoneale negli esseri umani, che rimane un'area di intensa indagine a causa delle sue profonde implicazioni cliniche nella gestione dei pazienti con malattia renale allo stadio terminale (ESKD). Nonostante l'importanza clinica del PD e delle sue complicanze correlate, gli attuali modelli murini sperimentali soffrono di sfide tecniche chiave che compromettono le prestazioni dei modelli. Questi includono la migrazione e l'attorcigliamento del catetere PD e di solito giustificano la rimozione anticipata del catetere. Queste limitazioni determinano anche la necessità di un numero maggiore di animali per completare uno studio. Affrontando questi inconvenienti, questo studio introduce miglioramenti tecnici e sfumature chirurgiche per prevenire le complicanze comunemente osservate del catetere PD in un modello murino. Inoltre, questo modello modificato è convalidato inducendo infiammazione peritoneale e fibrosi utilizzando iniezioni di lipopolisaccaridi. In sostanza, questo articolo descrive un metodo migliorato per creare un modello sperimentale di PD.

Introduzione

Carico di malattia renale allo stadio terminale
La malattia renale cronica (CKD) è un problema di salute mondiale¹. Le stime attuali suggeriscono che più di 850 milioni di persone in tutto il mondo hanno malattie renali. La prevalenza delle malattie renali quasi raddoppia il numero di persone con diabete (422 milioni) ed è più di 20 volte la prevalenza di cancro (42 milioni) o HIV / AIDS (36,7 milioni) pazienti in tutto il mondo². Circa uno su sette americani hanno CKD e due su 1.000 americani hanno ESKD che richiedono un trapianto di rene o supporto per dialisi³. Considerando il crescente onere dell'ESKD in tutto il mondo, l'ottimizzazione della tecnologia di dialisi è fondamentale³.

Dialisi peritoneale
Il PD è una modalità significativamente sottoutilizzata per il trattamento della ESKD negli Stati Uniti. Secondo lo United States Renal Data System (USRDS), la percentuale di pazienti PD prevalenti era solo dell'11% nel 2020 ^4,5. Il PD conferisce diversi vantaggi rispetto all'emodialisi in centro (HD), tra cui una migliore qualità della vita, meno visite cliniche e una diminuzione delle spese Medicare ^6,7. Inoltre, il PD è una terapia domiciliare ed è associato a un rischio molto più basso di infezioni gravi come batteriemia ed endocardite che sono spesso correlate ai cateteri per emodialisi. Inoltre, la malattia di Parkinson può essere iniziata rapidamente con un protocollo di avvio urgente, riducendo la necessità di iniziare la dialisi con cateteri vascolari permanenti⁸. Il PD è considerato il metodo preferito di dialisi nella popolazione pediatrica ESKD⁹.

Compromissione peritoneale indotta dalla dialisi peritoneale
Il PD comporta l'introduzione di liquido PD (dializzato) nel peritoneo, che provoca infiammazione e rimodellamento della membrana peritoneale nel tempo. L'infiammazione peritoneale innesca la fibrosi, culminando nella potenziale perdita di capacità di ultrafiltrazione della membrana nel tempo. La conservazione della membrana peritoneale è una sfida significativa nel PD e ulteriori ricerche sono di fondamentale importanza per garantire che le migliori pratiche cliniche siano disponibili per i professionisti. Esistono modelli murini ben consolidati per aiutare ulteriormente la comprensione dei meccanismi fisiopatologici di infezione e infiammazione peritoneale, soluto, cinetica di trasporto dell'acqua e insufficienza di membrana; Tuttavia, i problemi tecnici con il catetere spesso limitano questi modelli¹⁰.

Analisi dei cambiamenti della membrana peritoneale
Nei pazienti con ESKD, il dializzato viene tradizionalmente introdotto nella cavità peritoneale attraverso un catetere Tenkhoff con bracciale profondo e superficiale. I pazienti possono potenzialmente manifestare complicanze correlate al catetere, tra cui migrazione del catetere, dolore da infusione e scarso drenaggio del dializzato^11,12,13. Sono stati introdotti due tipi principali di cateteri peritoneali per l'uomo, arrotolati o dritti, per ridurre al minimo queste complicanze¹². Diverse modifiche, tra cui un bracciale extra ai cateteri convenzionali a due cuffi, sono state aggiunte ai cateteri originali per prolungare la sopravvivenza del catetere PD¹¹. La tecnica di inserimento varia in base a diversi fattori impedendo la migrazione del catetere da aggiungere dopo la sopravvivenza, compresa la disponibilità delle risorse e il livello di competenza¹⁴.

Al contrario, i modelli murini di dialisi peritoneale hanno differenze fondamentali nelle tecniche e nello scopo rispetto ai cateteri peritoneali umani. Ad esempio, i cateteri peritoneali nei modelli murini sono utilizzati principalmente per studiare le alterazioni della membrana e sono meno destinati alle funzioni di drenaggio bidirezionale. La tecnica attuale soffre di potenziale spostamento del porto e migrazione del catetere a causa della manipolazione degli animali. Nei modelli murini convenzionali, le porte di accesso non erano fissate alla pelle. Questo aspetto creava una porta di accesso instabile, che negli animali svegli poteva essere spostata, con conseguente migrazione del catetere. Data l'importanza dei modelli murini nella ricerca sulla membrana peritoneale, è imperativo creare tecniche chirurgiche efficaci per generare modelli affidabili. Pertanto, abbiamo deciso di ottimizzare il modello convenzionale di posizionamento del catetere PD. È importante notare che il catetere stesso provoca alterazioni istopatologiche nella membrana peritoneale e, quindi, qualsiasi conclusione riguardante l'effetto delle soluzioni PD negli studi sugli animali deve essere interpretata nel contesto del catetere PD come un corpo estraneo^15,16,17.

Istopatologia della membrana peritoneale
Il fallimento della malattia di Parkinson è principalmente correlato alla fibrosi e all'eccesso di angiogenesi con conseguente perdita di un gradiente di concentrazione osmolare. Inoltre, la capacità di filtrazione della membrana peritoneale potrebbe essere influenzata dalla peritonite. Inoltre, la peritonite infettiva è una causa ben consolidata di cambiamento nella modalità di dialisi dalla dialisi peritoneale all'emodialisi. ¹⁸.

Protocollo

Per questo studio, sono stati utilizzati otto topi femmina C57BL / 6J, 8-12 settimane di età e un peso medio di 20 g. I topi sono stati alloggiati in condizioni standard e sono stati nutriti con chow e acqua ad libitum. Questo studio è stato eseguito con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Boston University Medical Center (AN-1549). Le procedure qui descritte sono state eseguite in condizioni sterili.

1. Anestetizzare il topo in una camera di isoflurano e iniettare l'analgesico per via sottocutanea

1. Tieni l'animale dalla base della coda. Tenere l'animale sulla superficie dorsale della mano non dominante.
2. Trasferire l'animale nella camera di induzione anestetica continua riempita con isoflurano al 3% -4%. Confermare un'adeguata anestesia generale dall'assenza del riflesso del pizzico degli arti posteriori destro e sinistro. Mantenere il mantenimento dell'anestesia generale con Isoflurano 1% -3%.
3. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi.
4. Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina.
   1. Sciogliere lo stock di buprenorfina ad una concentrazione di 0,3 mg/ml in cloruro di sodio (NaCl) 0,9% per raggiungere la concentrazione finale di 0,03 mg/ml.
   2. Iniettare un dosaggio di 0,05-0,1 mg/kg di 0,03 mg/mL di buprenorfina, insieme a 500 μL di NaCl sterile 0,9%, 20 minuti prima dell'intervento chirurgico in un topo da 20 g (2 μg o 66 μL di 0,03 mg/ml di buprenorfina per topo).

2. Preparazione della pelle

1. Posizionare il topo completamente anestetizzato in posizione laterale sinistra, esponendo il fianco destro alla coperta riscaldante. Rasare il lato destro dell'addome, appena vicino alla linea mediana dell'area paraspinale e giù fino alla coda dell'animale.
2. Disinfettare l'area rasata tre volte usando un batuffolo di cotone con l'applicazione alternata della soluzione antisettica o dello scrub e alcool al 70% o soluzione salina sterile con un movimento circolare, iniziando dal sito di incisione chirurgica e spostandosi verso l'esterno. Eliminare il batuffolo di cotone dopo ogni utilizzo. Fare attenzione a non bagnare eccessivamente le aree non chirurgiche dell'animale con alcol o antisettico in quanto ciò può peggiorare l'ipotermia.
   NOTA: È importante diluire correttamente le soluzioni antisettiche e non lasciare scrub chirurgici sulla pelle durante l'intervento chirurgico, poiché possono essere irritanti e devono essere risciacquati. Controllare frequentemente la temperatura della coperta riscaldante durante la procedura per assicurarsi che la temperatura non diminuisca.

3. Misurare la lunghezza del catetere e contrassegnare il punto di inserimento all'interno dell'addome e del tubo sopra la pelle preparata

1. Assegnare la tasca della porta di accesso 1 cm sopra la coda dell'animale. Tenere il segmento di installazione con l'indice non dominante e il dito del pollice sull'area assegnata vicino alla coda.
2. Posizionare il catetere sopra la pelle e stimare il luogo per l'inserimento del tubo del catetere all'interno della cavità addominale. Segnare il punto assegnato per l'inserimento del tubo, rispettando la flessione minima del tubo vicino alla linea mediana anteriore.
   NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite con guanti sterili e il catetere deve essere mantenuto sterile durante la misurazione. Gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave a 121 °C prima dell'uso. Fare riferimento alla figura supplementare S1 per gli strumenti necessari per la procedura.

4. Personalizzare la sezione del serbatoio del catetere peritoneale

1. Perforare un foro laterale sul telaio della sezione del serbatoio con il targhiere auricolare del mouse (Figura 1 e Figura 2). Va notato che il pugno all'orecchio è uno strumento chirurgico e deve essere sterile.

5. Posizionare la porta di instillazione

1. Fai un'incisione cutanea orizzontale larga 1 cm 1 cm sopra la coda. Sezionare bruscamente il piano sottocutaneo dallo strato muscolare sottostante per creare una sacca per il posizionamento del catetere per garantire che la porta di instillazione risieda liberamente nella tasca ideale della porta.
2. Tenere la punta delle forbici del diaframma verso la linea mediana per creare un tunnel obliquo per il posizionamento del tubo (Figura 3A).
3. Passare la sutura 3.0 dal foro laterale personalizzato. Fissare la porta di accesso al letto muscolare stringendo la sutura passata, mantenendo il tubo cefala.

6. Effettuare l'incisione del sito di inserimento della punta del catetere

1. Fare un'incisione di 1 cm sull'area precedentemente contrassegnata vicino alla linea mediana. Confermare il tratto ben sviluppato passando le forbici attraverso il tratto.
2. Prelevare delicatamente la punta del catetere con una pinza per posizionare il catetere in un corso retrogrado.
   NOTA: Evitare di pizzicare i fori laterali del tubo.
3. Far passare il tubo del catetere attraverso il tratto preparato (Figura 3B). Fare un'incisione di 1 cm sullo strato muscolare vicino alla linea mediana destra.

7. Confermare il funzionamento del catetere

1. Prima di chiudere tutte le incisioni, assicurarsi che il catetere posizionato sia funzionale. Controllare la funzione con una siringa da 1 mL collegata all'ago Huber specifico per la porta.
2. Iniettare 200 μL di soluzione salina normale nella porta di instillazione. Cerca un flusso regolare con tolleranza zero per la resistenza.
3. Lavare la porta e il catetere con eparina al 10% per mantenere la pervietà.

8. Chiudere le incisioni cutanee

1. Chiudere le incisioni cutanee attorno al serbatoio del porto (Figura 3C) con punti di sutura riassorbibili 3-0.

9. Fissare la punta del catetere all'interno della cavità addominale

1. Posizionare una sutura sciolta con una sutura assorbibile rotonda 4-0 attorno al muscolo della parete addominale inciso. Passare il feltro prossimale del catetere all'interno dell'incisione.
2. Stringere la sutura del cordone della borsa preparata attorno al tubo mantenendo il secondo feltro al di fuori del cordone della borsa, sopra lo strato muscolare (Figura 3D) e chiudere la pelle con punti di sutura riassorbibili 3-0 (Figura 2).

10. Monitorare gli animali postoperatoriamente e quotidianamente, somministrare analgesia e fluidi postoperatori e mantenere i registri postoperatori giornalieri per un minimo di 7 giorni e fino al completo recupero

1. Mantenere il catetere funzionante con un'iniezione giornaliera di 200 μL di soluzione salina normale attraverso il catetere.

11. Iniezioni di liquidi

1. Confermare il processo post-procedurale senza incidenti ispezionando attentamente l'incisione cutanea.
2. Preparare LPS 2 mg/kg di peso corporeo per iniezioni intraperitoneali (i.p.) diluendo 40 μg di LPS con soluzione salina tamponata fosfato sterile (PBS) alla concentrazione di lavoro di 0,2 μg/μL (in sostanza, 10 μL per 2 μg/g di peso corporeo e 200 μL di LPS per 20 g di topi).
3. Iniziare le iniezioni nella seconda settimana successiva all'impianto del catetere.
   1. Tenere delicatamente l'animale con la mano non dominante e trattenere la porta di instillazione mentre si muovono l'indice e il pollice nella direzione del cefalo.
   2. Disinfettare la pelle sovrastante il serbatoio con alcool isopropilico al 70%. Usi la siringa attaccata all'ago Huber per iniettare l'LPS.
      1. Dopo essere entrati nella porta con l'ago Huber, iniettare 100 μL di soluzione salina normale nella porta per confermare il corso del brevetto.
      2. Iniettare i 200 μL di LPS preparati, seguiti dai 100 μL di soluzione salina normale per l'irrigazione del tubo, e assicurarsi che non vi sia resistenza.

12. Anestetizzare i topi prima di raccogliere il peritoneo e raccogliere il liquido peritoneale

1. Dopo 7 giorni di iniezioni di LPS e 2 settimane di impianto del catetere, pianificare la biopsia peritoneale.
2. Piano per l'anestesia generale.
   1. Anestetizzare il topo in una camera di isoflurano e iniettare l'analgesico per via sottocutanea.
   2. Tenere l'animale dalla base della coda e tenere l'animale sulla superficie dorsale della mano.
   3. Trasferire l'animale nella camera di induzione anestetica continua riempita con isoflurano al 3% -4%. Confermare un'adeguata anestesia generale dall'assenza del riflesso del pizzico degli arti posteriori destro e sinistro. Mantenere il mantenimento dell'anestesia generale con isoflurano 1% -3%.

13. Biopsia peritoneale

1. Posizionare l'animale sulla coperta riscaldata in posizione supina. Fare un'incisione cutanea della linea mediana dal sub-xifoide alla vescica.
2. Perfondere il piano sottofasciale con PBS freddo (Figura 3E).
3. Assicurati che l'aereo sia completamente sezionato senza disturbare l'integrità del peritoneo. Inizia a sezionare il peritoneo dalla riflessione peritoneale laterale nel quadrante inferiore sinistro, a partire dall'ilo al fianco sinistro e dalla vescica nell'aspetto inferiore per mantenere i campioni coerenti tra gli animali (Figura 3F).
4. Dopo la raccolta peritoneale, eutanasia l'animale per lussazione cervicale.

Risultati

Tutti i cateteri impiantati sono stati funzionanti fino alla fine dello studio e lo spostamento o l'attorcigliamento del catetere non hanno complicato nessuno dei cateteri impiantati. L'attuale tecnica modificata è stata ulteriormente convalidata con un modello indotto dalla peritonite utilizzando LPS. I topi di controllo hanno ricevuto 200 μL di iniezioni saline normali giornaliere, mentre i topi sperimentali sono stati iniettati con 200 μL di LPS, come discusso nella fase 11 del protocollo, per un totale di 7 giorni...

Discussione

Sono descritti tre modelli murini di PD. Ciò include una puntura cieca della superficie peritoneale, un sistema aperto-permanente e un sistema chiuso¹⁰. La puntura cieca della superficie peritoneale comporta un accesso peritoneale diretto simile alle iniezioni intraperitoneali ma non consente il drenaggio del dializzato. Essendo una procedura in cieco, questo metodo può danneggiare gli organi viscerali addominali. Il modello di sistema aperto-permanente mantiene il catetere di dialisi e la porta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24