גישת השתלה מדרדרית למיקום צנתר דיאליזה פריטוניאלית בעכברים

Summary

מאמר זה מתאר שינויים בהליך להשתלת צנתר דיאליזה פריטוניאלי במודל מורין כדי למנוע בעיות טכניות גדולות שנצפו בטכניקות הקונבנציונליות.

Abstract

מודלים של מורין משמשים לבדיקת היבטים שונים של דיאליזה פריטוניאלית (PD), כגון דלקת צפק ופיברוזיס. אירועים אלה גורמים לכשל בקרום הצפק בבני אדם, שנותר תחום מחקר אינטנסיבי בשל השלכותיו הקליניות העמוקות בניהול חולים עם מחלת כליות סופנית (ESKD). למרות החשיבות הקלינית של מחלת פרקינסון והסיבוכים הקשורים אליה, המודלים הניסיוניים הנוכחיים סובלים מאתגרים טכניים מרכזיים הפוגעים בביצועי המודלים. אלה כוללים נדידת צנתר PD וקילקול ובדרך כלל מצדיקים הוצאת קטטר מוקדמת יותר. מגבלות אלה גם מניעות את הצורך במספר גדול יותר של בעלי חיים כדי להשלים מחקר. מחקר זה מתייחס לחסרונות אלה, ומציג שיפורים טכניים וניואנסים כירורגיים למניעת סיבוכים נפוצים של צנתר פרקינסון במודל מורין. יתר על כן, מודל שונה זה מאומת על ידי גרימת דלקת הצפק ופיברוזיס באמצעות זריקות lipopolysaccharide. בעיקרו של דבר, מאמר זה מתאר שיטה משופרת ליצירת מודל ניסיוני של מחלת פרקינסון.

Introduction

נטל מחלת כליות סופנית
מחלת כליות כרונית (CKD) היא בעיה בריאותית עולמית¹. ההערכות הנוכחיות מצביעות על כך שיותר מ-850 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים ממחלת כליות. השכיחות של מחלת כליות כמעט מכפילה את מספר האנשים עם סוכרת (422 מיליון) והיא יותר מפי 20 מהשכיחות של חולי סרטן (42 מיליון) או HIV / איידס (36.7 מיליון) ברחבי העולם². בערך אחד מכל שבעה אמריקאים יש CKD, ושניים מתוך 1,000 אמריקאים יש ESKD הדורש השתלת כליה או דיאליזה^{תמיכה 3}. בהתחשב בנטל ההולך וגובר של ESKD ברחבי העולם, אופטימיזציה של טכנולוגיית הדיאליזה היא חיונית³.

דיאליזה פריטוניאלית
PD היא שיטה לא מנוצלת באופן משמעותי לטיפול ב-ESKD בארצות הברית. על פי מערכת נתוני הכליות של ארצות הברית (USRDS), אחוז חולי פרקינסון השכיחים היה רק 11% בשנת 2020 ^4,5. מחלת פרקינסון מעניקה מספר יתרונות על פני המודיאליזה במרכז (HD), כולל איכות חיים טובה יותר, פחות ביקורים במרפאה וירידה בהוצאות מדיקר ^6,7. בנוסף, פרקינסון הוא טיפול ביתי והוא קשור בסיכון נמוך בהרבה לזיהומים חמורים כגון חיידקים ואנדוקרדיטיס הקשורים לעיתים קרובות לצנתרי המודיאליזה. יתר על כן, ניתן להתחיל פרקינסון במהירות עם פרוטוקול התחלה דחופה, מה שמקטין את הצורך בהתחלת דיאליזה עם^{צנתרי כלי} דם 8. מחלת פרקינסון נחשבת לשיטת הדיאליזה המועדפת באוכלוסיית ESKD בילדים⁹.

פגיעה פריטוניאלית הנגרמת על ידי דיאליזה פריטוניאלית
מחלת פרקינסון כרוכה בהחדרת נוזל פרקינסון (דיאליזה) לצפק, הגורם לדלקת ולעיצוב מחדש של קרום הצפק לאורך זמן. דלקת צפק מעוררת פיברוזיס, ששיאה באובדן פוטנציאלי של יכולות אולטרה-סינון של הממברנה לאורך זמן. שימור קרום הצפק הוא אתגר משמעותי בפרקינסון, ומחקר נוסף חשוב באופן קריטי כדי להבטיח שהפרקטיקות הקליניות הטובות ביותר יהיו זמינות למטפלים. ישנם מודלים מבוססים היטב של מורין המסייעים לקדם את ההבנה של מנגנונים פתופיזיולוגיים של זיהום ודלקת בצפק, מומסים, קינטיקה של הובלת מים וכשל ממברנה; עם זאת, בעיות טכניות עם הצנתר לעתים קרובות להגביל מודלים אלה¹⁰.

ניתוח השינויים בקרום הצפק
בחולי ESKD, דיאליזה מוחדרת באופן מסורתי לחלל הצפק באמצעות קטטר טנקהוף עם שרוול עמוק ושטחי. החולים עלולים לחוות סיבוכים הקשורים לצנתר, כולל נדידת קטטר, כאבי עירוי וניקוז לקוי של הדיאליזה^11,12,13. שני סוגים עיקריים של צנתרי הצפק הוכנסו לבני אדם, מפותל או ישר, כדי למזער סיבוכים אלה¹². מספר שינויים, כולל שרוול נוסף לצנתרים הקונבנציונליים בעלי שני אזיקים, נוספו לצנתרים המקוריים כדי להאריך את הישרדות צנתר פרקינסון¹¹. טכניקת ההחדרה משתנה בהתאם למספר גורמים על ידי מניעת נדידת קטטר להוספה לאחר ההישרדות, כולל זמינות המשאבים ורמת המומחיות¹⁴.

לעומת זאת, למודלים של דיאליזה פריטוניאלית יש הבדלים מהותיים בטכניקות ובמטרה בהשוואה לצנתרים פריטוניאליים אנושיים. לדוגמה, צנתרים פריטוניאליים במודלים של מורין משמשים בעיקר לחקר שינויים בממברנות ומיועדים פחות לתפקודי ניקוז דו-כיווניים. הטכניקה הנוכחית סובלת מעקירת נמלים פוטנציאלית ומנדידת צנתרים עקב הטיפול בבעלי החיים. בדגמי מורין הקונבנציונליים, יציאות הגישה לא היו מקובעות לעור. היבט זה יצר פתח גישה לא יציב, אשר בבעלי חיים ערים עלול להיעקר ממקומו, וכתוצאה מכך נדידת קטטר. בהתחשב בחשיבות של מודלים murine במחקר קרום הצפק, זה הכרחי ליצור טכניקות כירורגיות יעילות כדי ליצור מודלים אמינים. לכן, יצאנו לייעל את המודל המקובל של מיקום צנתר PD. חשוב לציין כי הצנתר עצמו גורם לשינויים היסטופתולוגיים בקרום הצפק, ולכן יש לפרש כל מסקנה לגבי השפעת תמיסות פרקינסון במחקרים בבעלי חיים בהקשר של צנתר פרקינסון כגוף זר^15,16,17.

היסטופתולוגיה של קרום הצפק
כשל PD קשור בעיקר לפיברוזיס ולאנגיוגנזה עודפת וכתוצאה מכך לאובדן שיפוע ריכוז אוסמולרי. בנוסף, יכולת סינון קרום הצפק עשויה להיות מושפעת מדלקת הצפק. בנוסף, דלקת צפק זיהומית היא סיבה מבוססת היטב לשינוי בשיטת הדיאליזה מדיאליזה פריטוניאלית להמודיאליזה. ¹⁸.

Protocol

במחקר זה נעשה שימוש בשמונה נקבות עכברי C57BL/6J, בגילאי 8-12 שבועות ובמשקל ממוצע של 20 גרם. העכברים שוכנו בתנאים סטנדרטיים והוזנו בצ'או ובמים אד ליביטום. מחקר זה בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), המרכז הרפואי של אוניברסיטת בוסטון (AN-1549). ההליכים המתוארים כאן בוצעו בתנאים סטריליים.

1. להרדים את העכבר בחדר Isoflurane, ולהזריק את משכך כאבים תת עורית

1. החזיקו את החיה מבסיס הזנב. שמור את החיה על פני השטח הגבי של היד הלא דומיננטית.
2. מעבירים את בעל החיים לתא השראת הרדמה רציפה מלא באיזופלורן 3%-4%. ודא הרדמה כללית נאותה על ידי היעדר רפלקס צביטת בוהן בגפיים האחוריות הימנית והשמאלית. שמור על תחזוקת ההרדמה הכללית עם איזופלורן 1%-3%.
3. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים.
4. מתן הזרקה תת עורית של Buprenorphine.
   1. להמיס את מלאי Buprenorphine בריכוז של 0.3 מ"ג / מ"ל נתרן כלורי (NaCl) 0.9% כדי להשיג את הריכוז הסופי של 0.03 מ"ג / מ"ל.
   2. יש להזריק מינון של 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג של 0.03 מ"ג/מ"ל בופרנורפין, יחד עם 500 מיקרוליטר NaCl סטרילי 0.9%, 20 דקות לפני הניתוח בעכבר של 20 גרם (2 מיקרוגרם או 66 מיקרוליטר של 0.03 מ"ג/מ"ל בופרנורפין לעכבר).

2. הכנת העור

1. הניחו את העכבר מורדם לחלוטין במצב צדדי שמאלי, וחשפו את צידו הימני לשמיכת החימום. יש לגלח את הצד הימני של הבטן, ממש קרוב לקו האמצע לאזור הפרא-ספינלי, ועד לזנב החיה.
2. יש לחטא את האזור המגולח שלוש פעמים באמצעות צמר גפן עם יישום חלופי של תמיסת החיטוי או הפילינג ו-70% אלכוהול או מי מלח סטריליים בתנועה מעגלית, החל מאתר החתך הכירורגי ויציאה החוצה. יש להשליך את צמר גפן לאחר כל שימוש. היזהר לא להרטיב יתר על המידה אזורים שאינם כירורגיים של החיה עם אלכוהול או חיטוי כמו זה יכול להחמיר היפותרמיה.
   הערה: חשוב לדלל כראוי תמיסות חיטוי ולא להשאיר קרצוף כירורגי על העור במהלך הניתוח, שכן הם יכולים להיות מגרים ויש צורך לשטוף. לעתים קרובות לבדוק את הטמפרטורה של שמיכת חימום במהלך ההליך כדי להבטיח כי הטמפרטורה לא נופל.

3. למדוד את אורך הצנתר ולסמן את נקודת ההחדרה בתוך הבטן ומערכת הצינור מעל העור המוכן

1. הקצו את כיס יציאת הגישה 1 ס"מ מעל זנב החיה. החזק את מקטע ההתקנה עם האינדקס הלא דומיננטי ואצבע האגודל מעל האזור שהוקצה ליד הזנב.
2. מניחים את הצנתר מעל העור ומעריכים את המקום להחדרת צינור הצנתר בתוך חלל הבטן. סמן את המקום שהוקצה להחדרת הצינור, תוך כיבוד הכיפוף המינימלי של הצינור ליד קו האמצע הקדמי.
   הערה: כל הפרוצדורות חייבות להתבצע עם כפפות סטריליות, ויש לשמור על הקטטר סטרילי במהלך המדידה. כלי ניתוח חייב להיות autoclaved ב 121 ° C לפני השימוש. עיין באיור משלים S1 עבור המכשירים הדרושים להליך.

4. התאמה אישית של מקטע מאגר הצנתר הצפק

1. נקבו חור צדדי מעל מסגרת אזור המאגר באמצעות תג אוזני העכבר (איור 1 ואיור 2). יש לציין כי אגרוף האוזן הוא כלי כירורגי, והוא צריך להיות סטרילי.

5. מניחים את פתח ההחדרה

1. בצע חתך עור אופקי ברוחב 1 ס"מ 1 ס"מ מעל הזנב. נתחו בבוטות את המישור התת עורי מהשכבה השרירית שמתחתיה כדי ליצור פאוץ' למיקום הצנתר כדי להבטיח שפתח ההחדרה שוכן בכיס היציאה האידיאלי בחופשיות.
2. שמרו על קצה המספריים של הקשתית לכיוון קו האמצע כדי ליצור תעלה אלכסונית למיקום הצינור (איור 3A).
3. מעבירים את התפר 3.0 מהחור הצדדי המותאם אישית. תקן את יציאת הגישה למיטה השרירית על ידי הידוק התפר שעבר, תוך שמירה על מסלול הצינור.

6. בצעו את החתך באתר החדרת קצה הצנתר

1. בצע חתך של 1 ס"מ מעל האזור שסומן בעבר ליד קו האמצע. אשרו את המערכת המפותחת היטב על ידי העברת מספריים דרך הקטע.
2. בחר את קצה הצנתר בעדינות עם מלקחיים כדי להכניס את הצנתר למסלול מדרדר.
   הערה: הימנע מצביטה של החורים הצדדיים של הצינור.
3. העבירו את צינור הצנתר דרך מערכת העיכול המוכנה (איור 3B). בצע חתך של 1 ס"מ מעל השכבה השרירית קרוב לקו האמצע הימני.

7. לאשר את תפקוד הצנתר

1. לפני סגירת כל החתכים, יש לוודא שהקטטר שהונח תקין. בדוק את הפונקציה עם מזרק 1 מ"ל מחובר למחט הובר הספציפית עבור היציאה.
2. הזריקו 200 מיקרוליטר של מי מלח רגילים ליציאת ההחדרה. חפש זרימה חלקה עם אפס סובלנות להתנגדות.
3. יש לשטוף את היציאה והצנתר ב-10% הפרין כדי לשמור על הפטנט.

8. סגור את חתכי העור

1. סגרו את חתכי העור סביב מאגר היציאה (איור 3C) בעזרת 3-0 תפרים נספגים.

9. תקנו את קצה הצנתר בתוך חלל הבטן

1. מניחים תפר מיתר ארנק רופף עם תפר נספג 4-0 עגול סביב שריר דופן הבטן החתוך. מעבירים את הלבד הפרוקסימלי של הצנתר בתוך החתך.
2. הדקו את תפר חוט הארנק המוכן סביב הצינור תוך שמירה על הלבד השני מחוץ לחוט הארנק, מעל השכבה השרירית (איור 3D), וסגרו את העור עם 3-0 תפרים נספגים (איור 2).

10. לפקח על בעלי החיים לאחר הניתוח ומדי יום, לנהל משככי כאבים לאחר הניתוח ונוזלים, ולשמור רשומות יומיות לאחר הניתוח במשך מינימום של 7 ימים ועד התאוששות מלאה

1. שמור על תפקוד הצנתר עם הזרקה יומית של 200 μL של מי מלח רגילים דרך הצנתר.

11. זריקות נוזלים

1. אשר את התהליך שלאחר האירוע על ידי בדיקה קפדנית של חתך העור.
2. הכן LPS 2 מ"ג / ק"ג משקל גוף לזריקות intraperitoneal (i.p.) על ידי דילול 40 מיקרוגרם של LPS עם מלוחים סטריליים פוספט חוצץ (PBS) לריכוז עבודה של 0.2 מיקרוגרם / μL (למעשה, 10 μL עבור 2 מיקרוגרם / גרם משקל גוף ו 200 μL של LPS עבור 20 גרם עכברים).
3. התחל את הזריקות בשבוע השני לאחר השתלת הצנתר.
   1. החזיקו את בעל החיים בעדינות עם היד הלא דומיננטית וריסנו את פתח ההחדרה תוך הזזת האצבע המורה והאגודל לכיוון הצפלדה.
   2. יש לחטא את העור שמעל המאגר עם 70% אלכוהול איזופרופיל. השתמש במזרק המחובר למחט הובר כדי להזריק את LPS.
      1. לאחר הכניסה לנמל עם מחט הובר, הזריקו 100 מיקרוליטר של מלח רגיל לתוך היציאה כדי לאשר את מסלול הפטנט.
      2. הזריקו את 200 μL המוכנים של LPS, ולאחר מכן את 100 μL של מלוחים רגילים להשקיית צינורות, וודאו שאין התנגדות.

12. מרדימים את העכברים לפני קצירת הצפק ואוספים את נוזל הצפק

1. לאחר 7 ימים של זריקות LPS ושבועיים של השתלת קטטר, יש לתכנן את ביופסיית הצפק.
2. תוכנית להרדמה כללית.
   1. מרדימים את העכבר בחדר איזופלורן ומזריקים את משכך הכאבים תת עורית.
   2. החזיקו את בעל החיים מבסיס הזנב, והחזיקו אותו על פני השטח הגבי של היד.
   3. מעבירים את בעל החיים לתא השראת הרדמה רציפה מלא באיזופלורן 3%-4%. ודא הרדמה כללית נאותה על ידי היעדר רפלקס צביטת בוהן בגפיים האחוריות הימנית והשמאלית. שמור על תחזוקה של הרדמה כללית עם isoflurane 1%-3%.

13. ביופסיה פריטוניאלית

1. הניחו את בעל החיים על השמיכה המחוממת במצב שכיבה. בצע חתך עור בקו האמצע מהתת-קסיפואיד לשלפוחית השתן.
2. לחורר את המישור התת-פשיאלי עם PBS קר (איור 3E).
3. ודא שהמטוס מנותח לחלוטין מבלי להפריע לשלמות הצפק. התחילו לנתח את הצפק מההשתקפות הצפקית הצידית ברביע התחתון השמאלי, החל מההילום ועד לאגף השמאלי, ושלפוחית השתן באספקט התחתון כדי לשמור על עקביות הדגימות בין החיות (איור 3F).
4. לאחר קציר הצפק, להרדים את החיה על ידי נקע צוואר הרחם.

תוצאות

כל הצנתרים המושתלים היו תקינים עד סוף המחקר, והוצאת הצנתר או הקימוט לא סיבכו אף אחד מהצנתרים המושתלים. הטכניקה הנוכחית, ששונתה, אומתה עוד יותר עם מודל המושרה על ידי דלקת הצפק באמצעות LPS. עכברי הביקורת קיבלו 200 μL של זריקות מלח רגילות יומיות, ואילו לעכברי הניסוי הוזרקו 200 μL של LPS, כפי שנדון בפרו...

Discussion

מתוארים שלושה מודלים מורינים של PD. זה כולל נקב עיוור של משטח הצפק, מערכת פתוחה-קבועה, ומערכת סגורה¹⁰. הניקוב העיוור של משטח הצפק כרוך בגישה צפקית ישירה בדומה להזרקות תוך פריטוניאליות אך אינו מאפשר ניקוז של דיאליזה. בהיותה הליך עיוור, שיטה זו יכולה לפגוע באיברי הקרביים של הבטן. מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24