마우스의 복막 투석 카테터 배치를 위한 역행 이식 접근법

요약

이 기사에서는 기존 기술에서 관찰된 주요 기술적 문제를 피하기 위해 쥐 모델에 복막 투석 카테터를 이식하는 절차의 수정에 대해 설명합니다.

초록

뮤린 모델은 복막 염증 및 섬유증과 같은 복막 투석 (PD)의 다양한 측면을 조사하기 위해 사용됩니다. 이러한 사건은 인간의 복막막 부전을 유발하며, 이는 말기 신장 질환(ESKD) 환자 관리에 심오한 임상적 영향을 미치기 때문에 집중적인 조사 영역으로 남아 있습니다. PD의 임상적 중요성 및 관련 합병증에도 불구하고 현재 실험용 쥐 모델은 모델의 성능을 손상시키는 주요 기술적 문제로 어려움을 겪고 있습니다. 여기에는 PD 카테터 이동 및 꼬임이 포함되며 일반적으로 조기 카테터 제거가 필요합니다. 이러한 한계는 또한 연구를 완료하기 위해 더 많은 수의 동물이 필요하게 만듭니다. 이러한 단점을 해결하기 위해 이 연구는 쥐 모델에서 일반적으로 관찰되는 PD 카테터 합병증을 예방하기 위해 기술적 개선과 외과적 뉘앙스를 소개합니다. 또한, 이 변형된 모델은 지질 다당류 주사를 사용하여 복막 염증 및 섬유증을 유도함으로써 검증됩니다. 본질적으로이 논문은 PD의 실험 모델을 만드는 개선 된 방법을 설명합니다.

서문

말기 신장 질환 부담
만성 신장 질환(CKD)은 전 세계적인 건강 문제입니다¹. 현재 추정에 따르면 전 세계적으로 8억 5천만 명이 넘는 사람들이 신장 질환을 앓고 있습니다. 신장 질환의 유병률^{은 당뇨병 환자}(4억 2,200만 명)의 거의 두 배이며 전 세계적으로 암(4,200만 명) 또는 HIV/AIDS(3,670만 명) 환자의 유병률의 20배 이상입니다2. 미국인 7명 중 1명은 만성콩팥병을 앓고 있으며, 미국인 1,000명 중 2명은 신장 이식 또는 투^{석 지원이 필요한} ESKD를 앓고 있습니다3. 전 세계적으로 증가하는 ESKD의 부담을 고려할 때 투석 기술을 최적화하는 것이 중요합니다³.

복막 투석
PD는 미국에서 ESKD 치료에 상당히 활용도가 낮은 방식입니다. 미국 신장 데이터 시스템(USRDS)에 따르면 유병률 PD 환자의 비율은 11년에 2020%에 불과했습니다 ^4,5. PD는 더 나은 삶의 질, 더 적은 클리닉 방문, 메디케어 지출 감소를 포함하여 센터 내 혈액 투석(HD)에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다^6,7. 또한 PD는 가정 기반 요법이며 종종 혈액 투석 카테터와 관련된 균혈증 및 심내막염과 같은 심각한 감염의 위험이 훨씬 낮습니다. 또한, PD는 긴급 시작 프로토콜로 신속하게 개시될 수 있어, 유치 혈관 카테터(⁸)를 사용한 투석 개시의 필요성을 감소시킨다. PD는 소아 ESKD 집단에서 바람직한 투석 방법으로 간주됩니다⁹.

복막 투석으로 인한 복막 장애
PD는 PD 유체 (투석액)를 복막에 도입하여 시간이 지남에 따라 복막의 염증 및 리모델링을 초래합니다. 복막 염증은 섬유증을 유발하여 시간이 지남에 따라 막의 한외 여과 능력이 잠재적으로 손실됩니다. 복막의 보존은 PD에서 중요한 과제이며, 실무자가 최상의 임상 사례를 이용할 수 있도록 하기 위해서는 추가 연구가 매우 중요합니다. 복막 감염 및 염증, 용질, 물 수송 역학 및 막 실패의 병태생리학적 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 도움이 되는 잘 확립된 쥐 모델이 있습니다. 그러나 카테터의 기술적 문제는 종종 이러한 모델¹⁰을 제한합니다.

복막막 변화 분석
ESKD 환자에서 투석액은 전통적으로 깊고 표면적인 커프가있는 Tenkhoff 카테터를 통해 복강 내에 도입됩니다. 환자는 잠재적으로 카테터 이동, 주입 통증 및 투석액^11,12,13의 배액 불량을 포함한 카테터 관련 합병증을 경험할 수 있습니다. 이러한 합병증을 최소화하기 위해 인간을 위해 두 가지 주요 유형의 복막 카테터가 코일 또는 직선으로 도입되었습니다¹². PD 카테터 생존을 연장하기 위해 기존의 2-커프 카테터에 대한 추가 커프를 포함한 몇 가지 변형이 원래 카테터에 추가되었습니다.¹¹. 삽입 기술은 자원의 가용성 및 전문 지식 수준¹⁴을 포함하여 생존 후 추가되는 카테터 이동을 방지함으로써 여러 요인에 따라 다릅니다.

대조적으로, 복막 투석의 쥐 모델은 인간 복막 카테터와 비교하여 기술과 목적에 근본적인 차이가 있습니다. 예를 들어, 쥐 모델의 복막 카테터는 주로 막 변화를 연구하는 데 사용되며 양방향 배수 기능에는 덜 사용됩니다. 현재의 기술은 동물의 취급으로 인한 잠재적 인 포트 이탈 및 카테터 이동으로 고통 받고 있습니다. 종래의 뮤린 모델에서, 액세스 포트는 피부에 고정되지 않았다. 이러한 측면은 불안정한 액세스 포트를 생성하여 깨어 있는 동물의 경우 이탈하여 카테터 이동을 초래할 수 있습니다. 복막 연구에서 쥐 모델의 중요성을 감안할 때 신뢰할 수 있는 모델을 생성하기 위한 효과적인 수술 기술을 만드는 것이 필수적입니다. 따라서 우리는 PD 카테터 배치의 기존 모델을 최적화하기 시작했습니다. 카테터 자체가 복막에서 조직 병리학 적 변화를 일으키므로 동물 연구에서 PD 용액의 효과에 관한 모든 결론은 PD 카테터의 맥락에서 이물질로 해석되어야한다는 점에 유의해야합니다^15,16,17.

복막 조직 병리학
PD 실패는 주로 섬유증 및 과도한 혈관 신생과 관련이 있으며, 이로 인해 삼투압 농도 구배가 손실됩니다. 또한 복막막 여과 능력은 복막염의 영향을 받을 수 있습니다. 또한, 감염성 복막염은 복막 투석에서 혈액 투석으로의 투석 방식의 변화에 대한 잘 확립 된 원인입니다. ¹⁸.

프로토콜

이 연구에서는 8-12주령의 암컷 C57BL/6J 마우스 8마리와 평균 체중 20g을 사용했습니다. 마우스는 표준 조건 하에서 사육되었고 차우 와 물을 자유롭게 먹였습니다. 이 연구는 보스턴 대학 의료 센터 (AN-1549)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아 수행되었습니다. 여기에 설명 된 절차는 멸균 상태에서 수행되었습니다.

1. 마우스를 이소플루란 챔버에 마취시키고 진통제를 피하 주사합니다.

1. 꼬리 바닥에서 동물을 잡으십시오. 비 지배적 인 손의 등 쪽 표면에 동물을 유지하십시오.
2. 동물을 3%-4% 이소플루란으로 채워진 연속 마취 유도 챔버로 옮깁니다. 오른쪽과 왼쪽 뒷다리에 발가락 핀치 반사가 없어 적절한 전신 마취를 확인하십시오. Isoflurane 1 % -3 %로 전신 마취의 유지를 유지하십시오.
3. 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
4. 부 프레 노르 핀의 피하 주사를 투여하십시오.
   1. 0.03 mg / mL의 최종 농도를 달성하기 위해 염화나트륨 (NaCl) 0.9 %에 0.3 mg / mL의 농도로 부 프레 노르 핀의 재고를 용해하십시오.
   2. 0.05-0.1 mg / kg의 0.03 mg / mL 부 프레 노르 핀과 500 μL의 멸균 NaCl 0.9 %를 20 g 마우스에 20 분 전에 주사하십시오 (마우스 당 2 μg 또는 66 μL의 0.03 mg / mL 부 프레 노르 핀).

2. 피부 준비

1. 완전히 마취 된 마우스를 왼쪽 측면 위치에 놓고 오른쪽 측면을 가열 담요에 노출시킵니다. 복부의 오른쪽을 면도하고, 척추 주위 부위의 정중선에 가깝고, 동물의 꼬리까지 면도하십시오.
2. 면봉을 사용하여 면봉을 사용하여 소독액 또는 스크럽과 70 % 알코올 또는 멸균 식염수를 원형 운동으로 번갈아 사용하여 수술 절개 부위에서 시작하여 바깥쪽으로 이동하여 면도 부위를 세 번 소독하십시오. 사용 후에는 면봉을 버리십시오. 동물의 비수술 부위를 알코올이나 방부제로 과도하게 적시면 저체온증이 악화될 수 있으므로 주의하십시오.
   알림: 소독액을 적절하게 희석하고 수술 중 피부에 외과 적 스크럽을 남기지 않는 것이 중요합니다. 절차가 진행되는 동안 가열 담요의 온도를 자주 확인하여 온도가 떨어지지 않도록하십시오.

3. 카테터 길이를 측정하고 준비된 피부 위에 복부와 관관 내의 삽입 지점을 표시합니다.

1. 동물의 꼬리 위 1cm에 액세스 포트 포켓을 할당합니다. 꼬리 근처의 지정된 영역 위에 비 지배적 인 색인과 엄지 손가락으로 설치 세그먼트를 잡습니다.
2. 카테터를 피부 위에 놓고 복강 내에서 카테터의 튜브 삽입 위치를 추정하십시오. 전방 정중선 근처에서 튜브의 최소 굽힘을 존중하여 튜브 삽입을 위해 지정된 위치를 표시하십시오.
   알림: 모든 절차는 멸균 장갑으로 수행해야 하며 카테터는 측정 중에 멸균 상태를 유지해야 합니다. 수술 도구는 사용하기 전에 121 ° C에서 오토 클레이브해야합니다. 절차에 필요한 기기에 대해서는 보충 그림 S1 을 참조하십시오.

4. 복막 카테터 저장소 섹션 사용자 지정

1. 마우스 귀 태거로 저장소 섹션의 프레임 위에 측면 구멍을 뚫습니다(그림 1 및 그림 2). 귀 펀치는 수술 도구이며 멸균되어야합니다.

5. 점안 포트 배치

1. 꼬리 위 1cm 너비의 수평 1cm 피부 절개를하십시오. 기본 근육층에서 피하 평면을 무딘 해부하여 주입 포트가 이상적인 포트 포켓에 자유롭게 상주할 수 있도록 카테터 배치용 파우치를 만듭니다.
2. 아이리스 가위의 끝을 정중선쪽으로 유지하여 튜브 배치를위한 비스듬한 터널을 만듭니다 (그림 3A).
3. 맞춤형 측면 구멍에서 3.0 봉합사를 통과시킵니다. 통과 된 봉합사를 조여 접근 포트를 근육 침대에 고정하고 튜브 코스 cephalad를 유지하십시오.

6. 카테터 팁 삽입 부위 절개

1. 정중선 근처에서 이전에 표시된 부분을 1cm 절개하십시오. 전도지를 통해 가위를 통과시켜 잘 발달 된 전도지를 확인하십시오.
2. 카테터 끝을 집게로 부드럽게 선택하여 카테터를 역행 코스에 놓습니다.
   알림: 튜브의 측면 구멍을 끼지 마십시오.
3. 준비된 관을 통해 카테터 튜브를 통과시킵니다(그림 3B). 오른쪽 정중선에 가까운 근육층을 1cm 절개하십시오.

7. 카테터의 기능 확인

1. 모든 절개 부위를 닫기 전에 배치 된 카테터가 작동하는지 확인하십시오. 포트의 특정 Huber 바늘에 부착된 1mL 주사기로 기능을 확인합니다.
2. 200μL의 일반 식염수를 주입 포트에 주입합니다. 저항에 대한 허용 오차가 없는 부드러운 흐름을 찾으십시오.
3. 포트와 카테터를 10% 헤파린으로 세척하여 개통성을 유지합니다.

8. 피부 절개 부위를 닫습니다.

1. 포트 저장소 주변의 피부 절개 부위를 3-0 흡수성 봉합사로 닫습니다 (그림 0).

9. 카테터 팁을 복강 내부에 고정하십시오.

1. 절개된 복벽 근육 주위에 4-0 원형 흡수 가능한 봉합사가 있는 느슨한 지갑 끈 봉합사를 놓습니다. 절개 부위 내부의 카테터의 근위 펠트를 통과시킵니다.
2. 준비된 지갑 끈 봉합사를 튜브 주위에 조이고 두 번째 펠트를 지갑 끈 바깥쪽, 근육층 위에 놓고 (그림 3D) 3-0 흡수성 봉합사로 피부를 닫습니다 (그림 2).

10. 수술 후 및 매일 동물을 모니터링하고, 수술 후 진통제 및 수액을 투여하고, 최소 7일 동안 그리고 완전히 회복될 때까지 매일 수술 후 기록을 유지합니다.

1. 카테터를 통해 매일 200μL의 일반 식염수를 주사하여 카테터 기능을 유지하십시오.

11. 유체 주입

1. 피부 절개를주의 깊게 검사하여 사건이없는 시술 후 과정을 확인하십시오.
2. LPS 40μg을 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 0.2μg/μL의 작동 농도로 희석하여 복강 주사(i.p.)를 위해 LPS 2mg/kg 체중을 준비합니다(본질적으로 2μg/g 체중의 경우 10μL, 20g 마우스의 경우 LPS 200μL).
3. 카테터 이식 후 두 번째 주에 주사를 시작하십시오.
   1. 지배적이지 않은 손으로 동물을 부드럽게 잡고 검지와 엄지 손가락을 두부 방향으로 움직이면서 점안 포트를 제지하십시오.
   2. 저수지 위에있는 피부를 70 % 이소 프로필 알코올로 소독하십시오. 후버 바늘에 부착 된 주사기를 사용하여 LPS를 주입하십시오.
      1. 후버 바늘로 포트에 들어간 후 일반 식염수 100μL를 포트에 주입하여 특허 과정을 확인합니다.
      2. 준비된 LPS 200μL를 주입한 후 튜브 관개용 생리식염수 100μL를 주입하고 저항이 없는지 확인합니다.

12. 복막을 적출하기 전에 생쥐를 마취시키고 복막액을 모으십시오.

1. 7 일간의 LPS 주사와 2 주간의 카테터 이식 후 복막 생검을 계획하십시오.
2. 전신 마취를 계획하십시오.
   1. 마우스를 이소플루란 챔버에서 마취시키고 진통제를 피하에 주사한다.
   2. 꼬리 기저부에서 동물을 잡고 동물을 손의 등쪽 표면에 두십시오.
   3. 동물을 3%-4% 이소플루란으로 채워진 연속 마취 유도 챔버로 옮깁니다. 오른쪽과 왼쪽 뒷다리에 발가락 핀치 반사가 없어 적절한 전신 마취를 확인하십시오. 이소 플루 란 1 % -3 %로 전신 마취의 유지를 유지하십시오.

13. 복막 생검

1. 앙와위 자세로 가열 된 담요 위에 동물을 놓습니다. 검상하부에서 방광까지 정중선 피부를 절개합니다.
2. 차가운 PBS로 근막하면을 관류합니다(그림 3E).
3. 복막의 완전성을 방해하지 않고 비행기가 완전히 해부되었는지 확인하십시오. 왼쪽 아래 사분면의 측면 복막 반사에서 복막을 해부하기 시작하여 힐룸에서 왼쪽 옆구리로, 그리고 아래쪽 측면에서 방광을 해부하여 동물간에 샘플을 일관되게 유지합니다 (그림 3F).
4. 복막 적출 후 자궁 경부 탈구로 동물을 안락사시킵니다.

결과

이식된 모든 카테터는 연구가 끝날 때까지 기능적이었고, 카테터 탈락이나 꼬임은 이식된 카테터를 복잡하게 만들지 않았습니다. 현재의 수정 된 기술은 LPS를 사용하여 복막염 유발 모델로 추가로 검증되었습니다. 대조군 마우스는 매일 200μL의 일반 식염수 주사를 받았고, 실험 마우스는 카테터 이식 후 총 7일 동안 프로토콜 단계 11에서 논의된 바와 같이 200μL의 LPS를 주사했습니다.

토론

PD의 3가지 뮤린 모델이 설명된다. 이것은 복막 표면의 블라인드 천자, 개방-영구 시스템, 및 폐쇄 시스템(¹⁰)을 포함한다. 복막 표면의 맹목적인 천자는 복강 주사와 유사한 직접적인 복막 접근을 포함하지만 투석액의 배액을 허용하지 않습니다. 맹검 절차이기 때문에이 방법은 복부 내장 기관을 손상시킬 수 있습니다. 개방형 시스템 모델은 투석 카테터와 점안 포트를 신체 외부?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24