Un enfoque de implantación retrógrada para la colocación de catéter de diálisis peritoneal en ratones

Resumen

Este artículo describe las modificaciones de un procedimiento para implantar un catéter de diálisis peritoneal en un modelo murino para evitar problemas técnicos importantes observados con las técnicas convencionales.

Resumen

Los modelos murinos se emplean para sondear diversos aspectos de la diálisis peritoneal (EP), como la inflamación peritoneal y la fibrosis. Estos eventos impulsan la falla de la membrana peritoneal en humanos, que sigue siendo un área de intensa investigación debido a sus profundas implicaciones clínicas en el manejo de pacientes con enfermedad renal en etapa terminal (IRT). A pesar de la importancia clínica de la EP y sus complicaciones relacionadas, los modelos murinos experimentales actuales sufren desafíos técnicos clave que comprometen el rendimiento de los modelos. Estos incluyen la migración y torceduras del catéter PD y generalmente justifican la extracción temprana del catéter. Estas limitaciones también impulsan la necesidad de un mayor número de animales para completar un estudio. Al abordar estos inconvenientes, este estudio introduce mejoras técnicas y matices quirúrgicos para prevenir las complicaciones del catéter de DP comúnmente observadas en un modelo murino. Además, este modelo modificado se valida mediante la inducción de inflamación peritoneal y fibrosis mediante inyecciones de lipopolisacáridos. En esencia, este documento describe un método mejorado para crear un modelo experimental de EP.

Introducción

Carga de enfermedad renal terminal
La enfermedad renal crónica (ERC) es un problema de salud mundial¹. Las estimaciones actuales sugieren que más de 850 millones de personas en todo el mundo tienen enfermedad renal. La prevalencia de la enfermedad renal casi duplica el número de personas con diabetes (422 millones) y es más de 20 veces la prevalencia de pacientes con cáncer (42 millones) o VIH / SIDA (36,7 millones) en todo el mundo². Aproximadamente uno de cada siete estadounidenses tiene ERC, y dos de cada 1,000 estadounidenses tienen IRT que requiere un trasplante de riñón o apoyo de diálisis³. Teniendo en cuenta la creciente carga de IRT en todo el mundo, la optimización de la tecnología de diálisis es crucial³.

Diálisis peritoneal
La EP es una modalidad significativamente infrautilizada para el tratamiento de la IRT en los Estados Unidos. Según el Sistema de Datos Renales de los Estados Unidos (USRDS), el porcentaje de pacientes prevalentes con EP fue solo del 11% en 2020 ^4,5. La DP confiere varias ventajas sobre la hemodiálisis en el centro (HD), incluyendo una mejor calidad de vida, menos visitas a la clínica y una disminución en los gastos de Medicare ^6,7. Además, la EP es una terapia domiciliaria y se asocia con un riesgo mucho menor de infecciones graves como bacteriemia y endocarditis que a menudo están relacionadas con los catéteres de hemodiálisis. Además, la DP puede iniciarse rápidamente con un protocolo de inicio urgente, disminuyendo la necesidad de inicio de diálisis con catéteres vasculares permanentes⁸. La DP se considera el método preferido de diálisis en la población pediátrica con IRT⁹.

Insuficiencia peritoneal inducida por diálisis peritoneal
La EP implica la introducción de líquido de DP (dializado) en el peritoneo, lo que resulta en inflamación y remodelación de la membrana peritoneal con el tiempo. La inflamación peritoneal desencadena la fibrosis, que culmina en la pérdida potencial de las capacidades de ultrafiltración de la membrana con el tiempo. La preservación de la membrana peritoneal es un desafío importante en la EP, y la investigación adicional es de importancia crítica para garantizar que las mejores prácticas clínicas estén disponibles para los profesionales. Existen modelos murinos bien establecidos para ayudar a comprender mejor los mecanismos fisiopatológicos de la infección peritoneal y la inflamación, el soluto, la cinética de transporte de agua y la falla de la membrana; Aún así, los problemas técnicos con el catéter a menudo limitan estos modelos¹⁰.

Análisis de los cambios en la membrana peritoneal
En pacientes con IRT, el dializado se introduce tradicionalmente en la cavidad peritoneal a través de un catéter de Tenkhoff con un manguito profundo y superficial. Los pacientes pueden experimentar potencialmente complicaciones relacionadas con el catéter, incluyendo migración del catéter, dolor de infusión y drenaje deficiente del dializado^11,12,13. Dos tipos principales de catéteres peritoneales han sido introducidos para humanos, enrollados o rectos, para minimizar esas complicaciones¹². Varias modificaciones, incluyendo un manguito adicional a los catéteres convencionales de dos manguitos, han sido añadidas a los catéteres originales para prolongar la supervivencia del catéter DP¹¹. La técnica de inserción varía de acuerdo con varios factores, evitando la migración del catéter que se agregará después de la supervivencia, incluida la disponibilidad de los recursos y el nivel de experiencia¹⁴.

En contraste, los modelos murinos de diálisis peritoneal tienen diferencias fundamentales en las técnicas y el propósito en comparación con los catéteres peritoneales humanos. Por ejemplo, los catéteres peritoneales en modelos murinos se utilizan principalmente para estudiar alteraciones de la membrana y están menos destinados a funciones de drenaje bidireccional. La técnica actual sufre de posible desplazamiento del puerto y migración del catéter debido al manejo de los animales. En los modelos murinos convencionales, los puertos de acceso no estaban fijados a la piel. Este aspecto creó un puerto de acceso inestable, que en animales despiertos podría desprenderse, lo que resultaría en la migración del catéter. Dada la importancia de los modelos murinos en la investigación de la membrana peritoneal, es imperativo crear técnicas quirúrgicas efectivas para generar modelos confiables. Por lo tanto, nos propusimos optimizar el modelo convencional de colocación del catéter DP. Es importante señalar que el propio catéter causa alteraciones histopatológicas en la membrana peritoneal y, por lo tanto, cualquier conclusión sobre el efecto de las soluciones de DP en estudios con animales debe interpretarse en el contexto del catéter de DP como un cuerpo extraño^15,16,17.

Histopatología de la membrana peritoneal
El fracaso de la EP se relaciona principalmente con la fibrosis y el exceso de angiogénesis que resulta en la pérdida de un gradiente de concentración osmolar. Además, la capacidad de filtración de la membrana peritoneal podría verse afectada por la peritonitis. Además, la peritonitis infecciosa es una causa bien establecida para el cambio en la modalidad de diálisis de diálisis peritoneal a hemodiálisis. ¹⁸.

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Protocolo

Para este estudio, se utilizaron ocho ratones hembra C57BL / 6J, de 8 a 12 semanas de edad y un peso promedio de 20 g. Los ratones fueron alojados en condiciones estándar y fueron alimentados con comida y agua ad libitum. Este estudio se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), Boston University Medical Center (AN-1549). Los procedimientos descritos aquí se realizaron en condiciones estériles.

1. Anestesiar al ratón en una cámara de isoflurano e inyectar el analgésico por vía subcutánea

1. Sostenga al animal desde la base de la cola. Mantenga al animal en la superficie dorsal de la mano no dominante.
2. Transfiera al animal a la cámara de inducción anestésica continua llena de isoflurano al 3% -4%. Confirmar la anestesia general adecuada por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie en las extremidades posteriores derecha e izquierda. Mantener el mantenimiento de la anestesia general con Isoflurano 1%-3%.
3. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos.
4. Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina.
   1. Disuelva el stock de buprenorfina a una concentración de 0,3 mg/ml en cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% para alcanzar la concentración final de 0,03 mg/ml.
   2. Inyectar una dosis de 0,05-0,1 mg/kg de 0,03 mg/ml de buprenorfina, junto con 500 μL de NaCl estéril al 0,9%, 20 min antes de la cirugía en un ratón de 20 g (2 μg o 66 μL de 0,03 mg/ml de buprenorfina por ratón).

2. Preparación de la piel

1. Coloque el ratón completamente anestesiado en una posición lateral izquierda, exponiendo su flanco derecho a la manta calefactora. Afeite el lado derecho del abdomen, justo cerca de la línea media del área paraespinal, y hasta la cola del animal.
2. Desinfecte el área afeitada tres veces con un hisopo de algodón con la aplicación alternativa de la solución antiséptica o exfoliante y ya sea 70% de alcohol o solución salina estéril en un movimiento circular, comenzando en el sitio de la incisión quirúrgica y moviéndose hacia afuera. Deseche el hisopo de algodón después de cada uso. Tenga cuidado de no mojar excesivamente las áreas no quirúrgicas del animal con alcohol o antiséptico, ya que esto puede empeorar la hipotermia.
   NOTA: Es importante diluir adecuadamente las soluciones antisépticas y no dejar exfoliantes quirúrgicos en la piel durante la cirugía, ya que pueden ser irritantes y deben enjuagarse. Verifique con frecuencia la temperatura de la manta calefactora durante el procedimiento para asegurarse de que la temperatura no baje.

3. Mida la longitud del catéter y marque el punto de inserción dentro del abdomen y el tracto tubular sobre la piel preparada

1. Asigne el bolsillo del puerto de acceso 1 cm por encima de la cola del animal. Sostenga el segmento de instalación con el índice no dominante y el pulgar sobre el área asignada cerca de la cola.
2. Coloque el catéter por encima de la piel y calcule el lugar para la inserción del tubo del catéter dentro de la cavidad abdominal. Marque el lugar asignado para la inserción del tubo, respetando la flexión mínima del tubo cerca de la línea media anterior.
   NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse con guantes estériles, y el catéter debe mantenerse estéril durante la medición. Las herramientas quirúrgicas deben esterilizarse en autoclave a 121 °C antes de su uso. Consulte la Figura Suplementaria S1 para conocer los instrumentos necesarios para el procedimiento.

4. Personalice la sección del reservorio del catéter peritoneal

1. Perfore un orificio lateral sobre el marco de la sección del depósito con el etiquetador de orejas del ratón (Figura 1 y Figura 2). Cabe señalar que el punzón de oído es una herramienta quirúrgica y debe ser estéril.

5. Coloque el puerto de instilación

1. Haga una incisión horizontal de 1 cm de ancho en la piel 1 cm por encima de la cola. Disecciona sin rodeos el plano subcutáneo de la capa muscular subyacente para hacer una bolsa para la colocación del catéter y garantizar que el puerto de instilación resida libremente en el bolsillo ideal del puerto.
2. Mantenga la punta de las tijeras del iris hacia la línea media para hacer un túnel oblicuo para la colocación del tubo (Figura 3A).
3. Pase la sutura 3.0 desde el orificio lateral personalizado. Fije el puerto de acceso al lecho muscular apretando la sutura pasada, manteniendo el curso de tubo cefalal.

6. Haga la incisión en el sitio de inserción de la punta del catéter

1. Haga una incisión de 1 cm sobre el área anteriormente marcada cerca de la línea media. Confirme el tracto bien desarrollado pasando tijeras a través del tracto.
2. Escoja suavemente la punta del catéter con fórceps para colocar el catéter en un curso retrógrado.
   NOTA: Evite pellizcar los orificios laterales del tubo.
3. Pase el tubo del catéter a través del tracto preparado (Figura 3B). Haga una incisión de 1 cm sobre la capa muscular cerca de la línea media derecha.

7. Confirmar el funcionamiento del catéter

1. Antes de cerrar todas las incisiones, asegúrese de que el catéter colocado sea funcional. Compruebe la función con una jeringa de 1 ml conectada a la aguja Huber específica para el puerto.
2. Inyecte 200 μL de solución salina normal en el puerto de instilación. Busque un flujo suave con una tolerancia cero para la resistencia.
3. Enjuague el puerto y el catéter con heparina al 10% para mantener la permeabilidad.

8. Cierre las incisiones en la piel

1. Cierre las incisiones cutáneas alrededor del depósito del puerto (Figura 3C) con suturas absorbibles 3-0.

9. Fije la punta del catéter dentro de la cavidad abdominal

1. Coloque una sutura suelta con una sutura absorbible redonda 4-0 alrededor del músculo inciso de la pared abdominal. Pase el fieltro proximal del catéter dentro de la incisión.
2. Apriete la sutura preparada de la cuerda del bolso alrededor del tubo mientras mantiene el segundo fieltro fuera de la cuerda del bolso, sobre la capa muscular (Figura 3D), y cierre la piel con suturas absorbibles 3-0 (Figura 2).

10. Monitorear a los animales postoperatoriamente y diariamente, administrar analgesia postoperatoria y líquidos, y mantener registros postoperatorios diarios durante un mínimo de 7 días y hasta la recuperación completa

1. Mantenga el catéter funcional con una inyección diaria de 200 μL de solución salina normal a través del catéter.

11. Inyecciones de líquidos

1. Confirme el proceso postprocedimiento sin incidentes inspeccionando cuidadosamente la incisión en la piel.
2. Preparar LPS 2 mg/kg de peso corporal para inyecciones intraperitoneales (i.p.) diluyendo 40 μg del LPS con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) hasta la concentración de trabajo de 0,2 μg/μL (en esencia, 10 μL para 2 μg/g de peso corporal y 200 μL de LPS para ratones de 20 g).
3. Comience las inyecciones en la segunda semana después de la implantación del catéter.
   1. Sostenga al animal suavemente con la mano no dominante y sujete el puerto de instilación mientras mueve los dedos índice y pulgar en la dirección de la cefalada.
   2. Desinfecte la piel que recubre el depósito con alcohol isopropílico al 70%. Use la jeringa conectada a la aguja Huber para inyectar el LPS.
      1. Después de ingresar al puerto con la aguja Huber, inyecte 100 μL de solución salina normal en el puerto para confirmar el curso de la patente.
      2. Inyecte los 200 μL preparados de LPS, seguidos de los 100 μL de solución salina normal para el riego por tubo, y asegúrese de que no haya resistencia.

12. Anestesiar a los ratones antes de cosechar el peritoneo y recoger el líquido peritoneal

1. Después de 7 días de inyecciones de LPS y 2 semanas de implantación del catéter, planifique la biopsia peritoneal.
2. Planifique la anestesia general.
   1. Anestesiar al ratón en una cámara de isoflurano e inyectar el analgésico por vía subcutánea.
   2. Sostenga al animal desde la base de la cola y mantenga al animal en la superficie dorsal de la mano.
   3. Transfiera al animal a la cámara de inducción anestésica continua llena de isoflurano al 3% -4%. Confirmar la anestesia general adecuada por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie en las extremidades posteriores derecha e izquierda. Mantener el mantenimiento de la anestesia general con isoflurano 1%-3%.

13. Biopsia peritoneal

1. Coloque al animal sobre la manta caliente en posición supina. Haga una incisión en la línea media de la piel desde la subxifoidea hasta la vejiga.
2. Perfundir el plano subfascial con PBS frío (Figura 3E).
3. Asegúrese de que el avión esté completamente diseccionado sin alterar la integridad del peritoneo. Comience a diseccionar el peritoneo desde la reflexión peritoneal lateral en el cuadrante inferior izquierdo, comenzando desde el hilio hasta el flanco izquierdo, y la vejiga en la cara inferior para mantener las muestras consistentes entre los animales (Figura 3F).
4. Después de la cosecha peritoneal, sacrificar al animal por luxación cervical.

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Resultados

Todos los catéteres implantados fueron funcionales hasta el final del estudio, y el desprendimiento o torcedura del catéter no complicó ninguno de los catéteres implantados. La técnica modificada actual se validó aún más con un modelo inducido por peritonitis utilizando LPS. Los ratones de control recibieron 200 μL de inyecciones diarias normales de solución salina, mientras que a los ratones experimentales se les inyectaron 200 μL de LPS, como se discutió en el paso 11 del protocolo, durante un total de 7 d?...

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Discusión

Se describen tres modelos murinos de EP. Esto incluye una punción ciega de la superficie peritoneal, un sistema abierto-permanente y un sistema cerrado¹⁰. La punción ciega de la superficie peritoneal implica un acceso peritoneal directo similar a las inyecciones intraperitoneales, pero no permite el drenaje del dializado. Al ser un procedimiento ciego, este método puede lesionar los órganos viscerales abdominales. El modelo de sistema abierto-permanente mantiene el catéter de diálisis y el p...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24