نوع الألياف والتحليل الخاص بالخلايا لمحتوى قطرات الدهون في العضلات الهيكلية

Camille M. Selvais; Laura L. De Cock; Sonia M. Brichard; María A. Davis-López de Carrizosa

doi:10.3791/63718

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن التسلل المفرط للدهون داخل العضلات الهيكلية يؤدي إلى السمية الدهنية ومرض السكري. هنا ، نقدم بروتوكولا كاملا ، بما في ذلك معالجة الأنسجة ، والتلطيخ باستخدام Bodipy ، والحصول على الصور ، وتحليلها ، لتحديد حجم وكثافة وتوزيع قطرات الدهون تحت الخلوية بطريقة محددة من نوع الألياف.

Abstract

يزداد تسلل الدهون في العضلات الهيكلية ، والمعروف باسم myosteatosis ، مع السمنة والشيخوخة. كما تم اكتشاف Myosteatosis مؤخرا كعامل تنبؤي سلبي للعديد من الاضطرابات الأخرى مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان. التسلل المفرط للدهون يقلل من كتلة العضلات وقوتها. كما أنه يؤدي إلى السمية الشحمية ومقاومة الأنسولين اعتمادا على إجمالي محتوى الدهون داخل الخلايا ، ومورفولوجيا قطرات الدهون (LD) ، والتوزيع دون الخلوي. نوع الألياف (المؤكسد مقابل تحلل السكر) مهم أيضا ، لأن الألياف المؤكسدة لديها قدرة أكبر على استخدام الدهون. بسبب آثارها الحاسمة في الفيزيولوجيا المرضية ، هناك ما يبرر إجراء دراسات متعمقة حول ديناميكيات LD ووظيفتها بطريقة خاصة بنوع الألياف.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول كامل لتحديد كمية محتوى الدهون intramyocellular وتحليل مورفولوجيا LD والتوزيع دون الخلوي بطريقة خاصة بنوع الألياف. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تلطيخ عمليات تبريد العضلات التسلسلية بصبغة الفلورسنت Bodipy والأجسام المضادة ضد متساوي السلسلة الثقيلة الميوسين. يتيح هذا البروتوكول المعالجة المتزامنة للعضلات المختلفة ، وتوفير الوقت وتجنب القطع الأثرية المحتملة ، وبفضل ماكرو شخصي تم إنشاؤه في فيجي ، أصبح من الممكن أيضا أتمتة تحليل LD.

Introduction

يزداد تسلل الدهون في العضلات الهيكلية ، والمعروف باسم myosteatosis ، مع السمنة والشيخوخة. يرتبط Myosteatosis سلبا بكتلة العضلات وقوتها ومع حساسية الأنسولين¹. علاوة على ذلك ، تشير الدراسات الحديثة إلى أنه يمكن استخدام درجة تنخر العظم العضلي كعامل تنبؤي لحالات أخرى مثل أمراض القلب والأوعية الدموية² أو مرض الكبد الدهني غير الكحولي³ أو السرطان⁴. يمكن أن تتراكم الدهون في العضلات الهيكلية بين ألياف العضلات كدهون خارج الخلية أو داخل الألياف ، مثل الدهون داخل الخلايا (IMCLs). يتم تخزين IMCLs في الغالب كدهون ثلاثية في قطرات الدهون (LDs) التي تستخدم كوقود استقلابي أثناء التمرين البدني ^5,6. ومع ذلك ، عندما يتجاوز عرض الدهون الطلب ، أو عندما تصبح الميتوكوندريا مختلة وظيفيا ، فإن IMCLs سوف تكون متورطة في مقاومة الأنسولين العضلي ، كما هو موضح في الأفراد غير الأصحاء والسمنة الأيضية وفي مرضى السكري من النوع 2⁷. ومن المثير للاهتمام ، أن رياضيي التحمل لديهم مستويات مماثلة ، إن لم تكن أعلى ، من IMCLs لتلك الموجودة في المرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة مع داء السكري من النوع 2 ، مع الحفاظ على حساسية عالية للأنسولين. توصف هذه الظاهرة بأنها "مفارقة الرياضي"^8,9 ، ويتم تفسيرها من خلال تقييم أكثر دقة ل LDs العضلات ، المتعلقة بحجمها وكثافتها وتوطينها وديناميكياتها وتكوين أنواع الدهون.

أولا ، يرتبط حجم LD عكسيا بحساسية الأنسولين واللياقة البدنية^10,11. في الواقع ، تظهر LDs الأصغر مساحة سطح أكبر نسبيا لعمل الليباز ، وبالتالي ، من المحتمل أن يكون لها قدرة أكبر على تعبئة الدهون¹². ثانيا ، تلعب كثافة LD (العدد / السطح) دورا مثيرا للجدل في عمل الأنسولين ^8,10 ؛ ومع ذلك ، يبدو أنه يزداد في الرياضيين. ثالثا ، يعد التوطين تحت الخلوي ل LDs مهما ، لأن LDs الموجودة أسفل الغشاء السطحي مباشرة (تحت الساركوليمال أو المحيطي) تمارس تأثيرا أكثر ضررا على حساسية الأنسولين من تلك المركزية ^8,9,13. وتوفر هذه الأخيرة الوقود للميتوكوندريا المركزية، التي لديها نشاط تنفسي أكبر وأكثر تخصصا لتلبية الطلب المرتفع على الطاقة اللازم للانكماش¹⁴. وعلى النقيض من ذلك، توفر LDs الطرفية الميتوكوندريا تحت الساركوليمالية، التي تشارك في العمليات المتعلقة بالأغشية⁸. أخيرا ، بالإضافة إلى الدهون الثلاثية ، قد تكون الدهون المعقدة المحددة داخل العضلات أكثر ضررا من غيرها. على سبيل المثال ، قد يتراكم diacylglycerol و acyl-CoA طويل السلسلة والسيراميد في العضلات عندما يكون معدل دوران الدهون الثلاثية منخفضا ، مما يضعف إشارات الأنسولين ^9,15. بالعودة إلى "مفارقة الرياضي" ، فإن رياضيي التحمل لديهم عدد كبير من LDs المركزية الأصغر حجما مع معدلات دوران مرتفعة في ألياف النوع الأول (المؤكسد) ، في حين أن مرضى السمنة والسكري لديهم LDs محيطية أكبر مع معدلات دوران منخفضة في ألياف النوع الثاني (السكري)⁸،¹⁵^،¹⁶. بالإضافة إلى دورها في تخزين الطاقة وإطلاقها ، يمكن أن تعمل LDs عبر الأحماض الدهنية المشتقة (FA) وبروتين المعطف (perilipin 5) أيضا كلاعبين حاسمين يشاركون في التنظيم النسخي لأكسدة FA والتكوين الحيوي للميتوكوندريا⁸. بسبب آثارها الحاسمة في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية ، هناك ما يبرر إجراء دراسات متعمقة حول ديناميكيات ووظائف LDs.

على الرغم من وجود العديد من التقنيات لدراسة IMCLs ، إلا أنها ليست جميعها مناسبة لتحديد حجم LD وكثافته وتوزيعه بدقة بطريقة خاصة بالألياف. على سبيل المثال ، يوفر تقييم IMCLs بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي ، على الرغم من كونه غير غازي ، مستوى من الدقة لا يكفي لدراسة حجم LDs وموقعها الدقيق داخل الألياف ، وليس من نوع الألياف المحدد^17,18. وبالمثل ، لا يمكن للتقنيات الكيميائية الحيوية التي يتم إجراؤها على متجانسات العضلات بأكملها¹⁹ تقييم موقع وحجم الدهون. وبالتالي ، فإن الطريقة الأكثر ملاءمة لتحليل مورفولوجيا LD وموقعها هي المجهر الإلكتروني للإرسال الكمي¹³ ، ولكن هذه التقنية مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. لذلك ، برز التصوير الفلوري البؤري على المستحضرات ذات الأصباغ مثل Oil Red O (ORO) 20,21 أو monodansylpentane (MDH)²² أو Bodipy ^23,24,25 كأفضل أداة لهذه الدراسات.

هنا ، يتم وصف بروتوكول كامل ، بما في ذلك أخذ عينات الأنسجة ومعالجتها ، وتلطيخ Bodipy ، والحصول على الصور البؤرية وتحليلها لتحديد حجم LD وعددها وتوطينها في عمليات تبريد عضلات الفأر. نظرا لأن IMCLs لا يتم توزيعها بالتساوي بين الألياف المؤكسدة وتحلل السكر ، وينظم كل نوع من أنواع الألياف ديناميكيات LD بشكل مختلف ، يجب أن تكون دراسة IMCLs محددة من نوع الألياف ^16,25,26,27. لذلك ، يستخدم هذا البروتوكول التألق المناعي على الأقسام التسلسلية لتحديد متساوي (أشكال) سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) التي تعبر عنها كل ألياف. ميزة أخرى لهذا البروتوكول هي المعالجة المتزامنة ل glycolytic (الباسطة digitorum longus ، EDL) وعضلة مؤكسدة (وحيد) موضوعة جنبا إلى جنب قبل التجميد (الشكل 1). هذه المعالجة المتزامنة لا توفر الوقت فحسب ، بل تتجنب أيضا التباين بسبب المعالجة المنفصلة للعينات.

figure-introduction-5674
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الإجراء. بعد تشريح العضلات (1) ، يتم تحضير العضلات المختارة ذات الحجم المماثل وتجميدها معا (2). يتم الحصول على مقاطع عرضية تسلسلية من 10 ميكرومتر باستخدام cryostat ومثبتة مباشرة على شرائح الالتصاق (3). من شريحتين تسلسليتين ، الأولى (4A) مناعية للأمينين وملطخة ب Bodipy للتعرف على LDs والثانية (4B) ملطخة بالمناعة بالأجسام المضادة ضد MyHCs للتعرف على أنواع الألياف العضلية. يتم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤرة ل Bodipy (5A) ومجهر epifluorescence لأنواع ألياف العضلات (5B). يتم تحليل الصور في فيجي من خلال تطبيق عتبة وتحديد كمية الجسيمات (6A) للحصول على العدد ومتوسط الحجم والكثافة والنسبة المئوية من المساحة الإجمالية التي تشغلها LDs (7) أو خلايا العد (6B) للحصول على النسبة المئوية للألياف من كل نوع في القسم (7). الاختصارات: LDs = قطرات الدهون. EDL = الباسطة الرقمية طويلة ؛ MyHCs = الميوسين سلسلة متساوية الثقيلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت على الفئران من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات من القطاع الطبي في الجامعة الكاثوليكية في لوفان (2019/UCL/MD/013).

1. تشريح وإعداد العينات للتجميد

ضع علامة على قطعة من الفلين بسماكة 3 مم لكل زوج من العضلات.
من خلال شق صغير مصنوع من شفرة في وسط الفلين ، أدخل بشكل عمودي قطعة مستطيلة من البلاستيك الصلب (0.5 سم عرض ، 1 سم ارتفاع) ستكون بمثابة دعم (الشكل 2B).
ملاحظة: يعتمد حجم القطعة البلاستيكية المستطيلة على حجم العضلات. هنا ، يتم تكييف الأبعاد الموصوفة مع حجم النعل (~ 9 ملغ ، 1 سم لتر ، 2-3 مم عرض) و EDL (~ 5 ملغ ، 1 سم لتر ، 2-3 مم عرض) من فأر ذكر C57BL / 6J عمره 3 أشهر.
في وقت التشريح ، قم بإزالة النعل و EDL من الطرف الخلفي للماوس. لمنع العينات من الجفاف أثناء التشريح ، ضعها على ضغط مبلل قليلا بمحلول ملحي في طبق بتري يوضع على الثلج.
ملاحظة: انظر Wang et ^al.28 للحصول على تفسيرات حول كيفية تشريح هاتين العضلتين الطرفيتين.
ضع قطرة صغيرة من مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) عند تقاطع الفلين / البلاستيك ، وتجنب فقاعات الهواء.
تخلص من الرطوبة الزائدة من العينات عن طريق تجفيفها بلطف بمنشفة ورقية (الشكل 2A) ووضع كلتا العضلتين على البلاستيك عموديا على الفلين (الشكل 2C).
تحقق من اتجاه الألياف العضلية العضلية تحت مجهر ستيريو (الشكل 2D).
ملاحظة: من المهم عدم تغطية العضلات ب OCT ، لأن تأثيرها العازل سيمنع التجميد السريع وسينتج عنه قطع أثرية مجمدة.

2. تجميد عينات العضلات الهيكلية للاستئصال بالتبريد

تحذير: يجب أن يتم تجميد العضلات تحت غطاء كيميائي ، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (انظر جدول المواد).

استخدم بهلوان من الفولاذ المقاوم للصدأ (~ 8 سم ارتفاع ، 6 سم Ø) مع شريطين جانبيين متصلين به بطول 25 سم على الأقل (الشكل 2F) ، واملأ البهلوان حتى 2/3 من سعته بالأيزوبنتان.
أمسك البهلوان من الأشرطة ، واغمره بلطف في صندوق بوليسترين مملوء بالنيتروجين السائل بحيث يكون مستوى النيتروجين خارج الحاوية أعلى من مستوى الأيزوبنتان في الداخل (الشكل 2F ، G).
تنبيه: عندما يتلامس البهلوان مع النيتروجين ، قد تتسبب الصدمة الحرارية في الدوران. تأكد من أن البهلوان مغمور بما فيه الكفاية ولكن تجنب دخول النيتروجين لأن هذا من شأنه أن يسبب هطول الأمطار isopentane. إذا حدث هذا ، دع الأيزوبنتان يبرد ، واملأ البهلوان بالأيزوبنتان الجديد وابدأ من جديد.
عندما يكون الجزء الداخلي من البهلوان مغطى بالكامل بطبقة صلبة بيضاء من الأيزوبنتان ، أخرجه من صندوق النيتروجين السائل (الشكل 2H).
ملاحظة: درجة حرارة انصهار الأيزوبنتان هي -159 درجة مئوية ، وسوف تتحول حواف البهلوان إلى اللون الأبيض عندما يكون الجو باردا بما فيه الكفاية.
حرك بلطف قطع الأيزوبنتان الصلبة في الأيزوبنتان السائل المتبقي مع ملقط حتى يصبح الحجم بأكمله سائلا مرة أخرى.
أعد غمر البهلوان في النيتروجين السائل حتى يشكل الأيزوبنتان حصى بيضاء في جميع أنحاء الجزء السفلي وحواف البهلوان (الشكل 2G ، H).
ملاحظة: تضمن خطوة التبريد الثانية هذه درجة حرارة التجميد المناسبة للأيزوبنتان.
قم بإزالة البهلوان من النيتروجين السائل وقم بغمس العضلات بسرعة في الجزء السفلي من البهلوان ، مع الاحتفاظ بالفلين باستخدام ملاقط أسنان الفئران. قم بتدوير الفلين لمدة 15 ثانية في الأيزوبنتان وخزنه عند -80 درجة مئوية حتى المعالجة (الشكل 2I).
ملاحظة: بالنسبة للتخزين على المدى القصير ، يمكن الاحتفاظ بالعينات في ثلاجة -20 درجة مئوية. تم بالفعل نشر البروتوكول الكامل للتجميد السريع للعضلات الهيكلية في مكان آخر. للاطلاع على المراجع التفصيلية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، انظر: Meng et ^al.29, Kumar et al.30, and Leiva-Cepas et ^al.31.

3. التقسيم بالتبريد

أحضر العينات إلى حجرة كريوستات تم تبريدها مسبقا إلى -20 درجة مئوية وضبطت درجة حرارة الشفرة على -25 درجة مئوية.
ملاحظة: انقل العينات من الفريزر -20 درجة مئوية/-80 درجة مئوية إلى كريوستات في صندوق بوليسترين مملوء بالثلج الجاف واسمح للعينات بالتوازن لمدة 20-30 دقيقة على الأقل إلى درجة حرارة الغرفة قبل القطع.
قم بإزالة البلاستيك من الفلين باستخدام ملاقط دقيقة وضع قرص عينة cryostat على لوحة التجميد السريع ليبرد. بمجرد أن تصل اللوحة إلى -50 درجة مئوية ، ضع بعض OCT على القرص وضع الفلين بسرعة أعلى القرص ، مع الضغط بإحكام. انتظر حتى يتصلب OCT ويتم تثبيت الفلين جيدا على القرص.
ضع القرص على رأس الكائن في اتجاه القطع المطلوب (الشكل 2J ، K) وقم بتقليم كتلة العضلات إلى ما بعد 1/3 على الأقل من طول العضلات وحتى يصبح كلا المقطعين العرضيين للعضلات مرئيين.
اضبط سمك القطع على 10 ميكرومتر وضع قسم واحد على شريحة التصاق للتحقق من الاتجاه الصحيح للألياف على مجهر ساطع.
ملاحظة: يعد التحقق من الاتجاه العرضي للألياف أمرا بالغ الأهمية. إذا لم تكن الألياف موجهة بشكل كاف ، فاضبط زاوية رأس الكائن ، وقطع قسم آخر وتحقق مرة أخرى.
ضع مقطعين عرضيين تسلسليين على شريحتين للالتصاق مصنفتين مسبقا: شريحة واحدة لتحديد أنواع الألياف ، والأخرى لتحديد محتوى الدهون (الشكل 2L).
ملاحظة: يمكن الحصول على مقاطع عرضية تسلسلية إضافية والاحتفاظ بها عند -80 درجة مئوية للدراسات النسيجية الأخرى. ومع ذلك ، لتجنب تغيير محتوى الدهون والتشكل داخل الخلايا²⁴ ، من الضروري معالجة أول شريحتين مباشرة بعد القطع لمنع تجفيف الهواء. إن تجميد وإذابة الشرائح من أجل تحديد كمية LD سيكون له نفس التأثير وبالتالي فهو غير مستصوب للغاية.

4. كتابة الألياف وتلطيخ Bodipy

الكشف عن المناعة النسيجية الكيميائية لنوع الألياف العضلية
ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول التالي ، يكفي حجم محلول إجمالي يبلغ 250 ميكرولتر لتغطية قسم العضلات بأكمله المحاط بدائرة مرسومة بقلم مسعور الحجم التقريبي لعملة 1 سنت.
1. أحط الأقسام بمخطط مرسوم بقلم مسعور وشطف بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT). ضع الشريحة في غرفة رطبة وكتلة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول الحجب (10٪ مصل الماعز العادي (NGS) و 1:30 ماوس على كاشف مانع الماوس (MOM) في PBS).
2. قم بإزالة محلول الحجب واحتضن الشرائح لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية (5٪ NGS ، كاشف حجب MOM 1:30 MOM ، الأجسام المضادة الأولية للفأر للتعرف على النوع الأول (IgG2b ، في 1:10) ، النوع IIa (IgG1 ، في 1:10) ، والنوع IIx (IgM ، في 1:5) الألياف والفئران المضادة للصفح (سلسلة α2 ، 1:1,000) في PBS.
3. اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
4. احتضان الشرائح في الظلام لمدة ساعة واحدة في RT باستخدام المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضاد IgG2b AF405 (1:500) ، الماعز المضاد IgG1 AF488 (1:500) ، الماعز المضاد IgM AF568 (1:1000) ، والماعز المضاد للصفيحة AF647 (1:500) في PBS).
  تنبيه: بالنسبة لبقية البروتوكول، تأكد من إبقاء الشرائح بعيدا عن الضوء للحفاظ على التألق.
5. اغسل مرة أخرى 3 × 5 دقائق في PBS ، واشطف في H₂O مزدوج التقطير ، وأزل الماء الزائد ، وقم بالتركيب باستخدام كاشف مضاد للتلاشي.
  ملاحظة: قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء للحفاظ على التألق حتى الحصول على الصورة. نظرا لأن الشرائح غير ثابتة ، فمن المستحسن استخدام حلول حديثة الصنع لكل تجربة ، وتعقيم PBS ، والحصول على الصور في أقرب وقت ممكن لتجنب تلوث الأقسام.
تلطيخ LDs مع Bodipy
ملاحظة: على غرار الخطوة 4.1.، يكفي حجم محلول إجمالي يبلغ 250 ميكرولتر لتغطية قسم العضلات بأكمله المحاط بدائرة مرسومة بقلم مسعور الحجم التقريبي لعملة معدنية من فئة 1 سنت.
1. أحط الأقسام بمخطط رسمه قلم مسعور واشطفه بالثلج 0.1 M PBS لمدة 10 دقائق في RT. استخدم PBS البارد المثلج لجميع الشطف والغسيل.
2. إصلاح مع الباردة 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) دون الميثانول لمدة 10 دقائق في RT. بعد الشطف السريع الأول ، اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
  تنبيه: نفذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك كيميائي.
3. ضع الشريحة في غرفة رطبة وكتلة لمدة 1 ساعة في RT مع 5٪ NGS في PBS.
4. احتضن الشرائح لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية بمحلول الجسم المضاد الأساسي (2٪ NGS والفئران المضادة للأمينين (سلسلة α2 ، 1: 1000) في PBS). اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
  تنبيه: بالنسبة لبقية البروتوكول، تأكد من إبقاء الشرائح بعيدا عن الضوء للحفاظ على التألق.
5. احتضان لمدة 1 ساعة في RT مع محلول الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على الماعز المضادة المضادة للفئران AF647 (1:500) في PBS. اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT.
6. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT بمحلول 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0.5 μg/mL) وBODIPY (1 ميكروغرام/مل) في PBS.
  ملاحظة: لتحضير محلول المرق BODIPY ، قم بإذابته في DMSO بتركيز 1 ملغ / مل. تتوفر تركيبات Bodipy مختلفة تجاريا لتلطيخ LD. اعتمادا على الاختيار الذي تم إجراؤه ، فإن طريقة التلطيخ هي نفسها (نفس الخطوات والتركيز ووقت الحضانة) ؛ ومع ذلك ، فإن طريقة الاستحواذ ستكون مختلفة قليلا.
7. بعد الشطف السريع الأول ، اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 × 5 دقائق في RT ، واشطفها في H₂O مزدوج التقطير ، وأزل الماء الزائد ، وقم بالتركيب باستخدام كاشف مضاد للتلاشي.
  ملاحظة: قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، للحفاظ على التألق حتى الحصول على الصورة.

5. الحصول على الصور

ملاحظة: بمجرد الانتهاء من بروتوكولات التلطيخ ، من المهم المتابعة الفورية للحصول على الصور (خلال 24 ساعة التالية) ، ليس فقط لتجنب التلوث ولكن أيضا للحفاظ على مورفولوجيا وحجم وعدد LDs.

الحصول على صور لتقييم أنواع الألياف لكل عضلة تم أخذ عينات منها
ملاحظة: يمكن تحقيق هذه الخطوة باستخدام مجهر المسح الضوئي الفلوري كامل الشريحة أو باستخدام مجهر التألق التقليدي. مع هذا الأخير ، يجب إجراء خياطة يدوية أو آلية للصور لإعادة بناء القسم.
1. للتعرف على نوع الألياف ، استخدم مجهر epifluorescence مع هدف 10x / 0.3. حدد مرشحات الإثارة ل DAPI (405 نانومتر) و FITC و TRITC و Cy5 للكشف عن ألياف النوع I و IIa و IIx و laminin ، على التوالي.
  ملاحظة: لن تكون الألياف من النوع IIb مناعية. سيتم التعرف عليها على أنها ألياف ملطخة باللامينين على حدود ساركوليما مع ساركوبلازما سوداء.
2. اضبط وقت التعرض المناسب لكل قناة.
3. عند استخدام مجهر epifluorescence التقليدي ، احصل دائما على صور العضلة بأكملها باتباع نفس الترتيب لتسهيل إعادة بناء العضلات. تأكد من أن الألياف الموجودة على الحافة اليمنى لصورة واحدة تظهر أيضا على الحافة اليسرى للصورة التالية. وينطبق الشيء نفسه على الأجزاء العلوية والسفلية من الصور (الشكل 3A).
  ملاحظة: كمرجع، بالنسبة لقسم من EDL أو النعل الذي تم تشريحه من فأر عمره 3 أشهر، سيغطي متوسط ست وثماني صور، على التوالي، المقطع العرضي للعضلات بأكمله.
4. بعد مسح العضلات، قم بتحميل الصور الرقمية الملتقطة في أي برنامج لمعالجة الصور لإعادة الإعمار (الخياطة)، استنادا إلى مورفولوجيا الألياف (laminin) وعلم الأنسجة لقسم العضلات، واحفظها كملف TIFF أو PNG أو JPG مع دمج جميع القنوات (الألوان) (الشكل 3A).
الحصول على الصور مع اللامينين و Bodipy تلطيخ مشترك
ملاحظة: للتعرف على نوع الألياف والحصول على تقدير لعدد الألياف لكل نوع تم التقاطه ، من الضروري إجراء مسح ضوئي لقسم الألياف بالفعل وإعادة بناء العضلات قبل البدء في الحصول على صورة Bodipy-laminin (الشكل 3B).
1. لمراقبة الصورة واقتنائها من Bodipy، استخدم مجهرا متحد البؤرة مع عدسة هدف غمر الزيت 40x مع فتحة عددية تبلغ 1.4.
2. استخدم الإعدادات التالية: ثقب عند 1 وحدة فلكية، ودقة 2,048 بكسل × 2,048 بكسل، وحجم البكسل عند 0.08 ميكرومتر، والوضع أحادي الاتجاه، وسرعة المسح الضوئي عند 4 (~4 ميكروثانية/بكسل)، وضبط متوسط الخط على 4x، وضبط التكبير/التصغير الرقمي على 1.
3. لتجنب الحديث المتبادل بين Bodipy-558/568 و laminin-AF647، استخدم وضع المسح المتسلسل على البرنامج البؤري.
  ملاحظة: عندما تكون الصبغة المختارة هي Bodipy-493/503 ، يكون المسح الضوئي بالليزر البؤري المتزامن ممكنا بدون محادثة متقاطعة بين قناة Bodipy وقناة laminin-AF647. هذا سوف يسرع من الحصول على الصور.
4. إثارة Bodipy-493/503 باستخدام خط الليزر 488 نانومتر أو خط ليزر الأرجون ، وإثارة Bodipy-555/568 باستخدام خط ليزر الصمام الثنائي 561 نانومتر. أخيرا ، اكتشف laminin-AF647 باستخدام خط ليزر الصمام الثنائي 640 نانومتر.
  تنبيه: ضع في اعتبارك أن جزيئات Bodipy حساسة جدا للتبييض الضوئي ، لذا تجنب المسح الضوئي بالليزر غير الضروري. للتعرف على الألياف ، استخدم الليزر فقط للأمينين.
5. اعتمادا على الصبغة المختارة ، اضبط نطاقات الانبعاثات على 570-650 نانومتر ل Bodipy-493/503²⁴ وعند 565-620 نانومتر ل Bodipy-558/568. اضبط نطاق انبعاث اللامينين عند 656-700 نانومتر.
6. اضبط الكسب والكسب الرقمي بشكل مناسب حتى لا يتم اكتشاف وحدات بكسل مشبعة على مؤشر النطاق. قم بتصحيح إشارة الخلفية عن طريق ضبط الإزاحة.
  ملاحظة: يجب تحسين اختيار المرشح ومعلمات المسح الضوئي الأخرى المذكورة أعلاه لكل مجهر متحد البؤرة. من المهم أن تظل جميع الإعدادات المذكورة أعلاه ثابتة لجميع الصور التي تم التقاطها من العينات المراد مقارنتها.
7. لتحديد نوع الألياف بين تلك التي تم تصورها على المجهر البؤري ، استخدم جهاز كمبيوتر محمول شخصي أعيد بناء صورة القسم عليه بعد فحص الكشف المناعي من نوع الألياف (الشكل 3B).
8. بمجرد تحديد مجموعة من الألياف بشكل صحيح ، احصل على الصورة باستخدام قنوات Bodipy و laminin.
  ملاحظة: يوصى بتدوين اسم صورة Bodipy-laminin على منطقة العضلات حيث توجد هذه الألياف على الصورة التي تم الحصول عليها للتعرف على MyHC لتسهيل التحليل اللاحق للألياف الخاصة ب LDs.

6. تحليل الصور

تحليل أنواع الألياف على كل عينة عضلية
1. في فيجي (أو ImageJ)³² ، افتح ملف TIFF أو PNG أو JPG مع العضلات المعاد بناؤها التي تم الحصول عليها من دمج جميع القنوات المستخدمة للكشف عن أشكال الألياف.
2. لبدء أداة عد الخلايا ، انقر فوق المكونات الإضافية | تحليل | | عداد الخلايا عداد الخلايا.
3. في نافذة عداد الخلايا ، انقر فوق الإجراءات | تهيئة.
4. ضمن عدادات في نفس النافذة، حدد النوع 1.
5. في النافذة الرئيسية في فيجي، حدد أداة العصا .
6. لتحديد عدد الألياف من كل نوع ، انقر فوق كل ألياف من نفس النوع ، بحيث يسجل البرنامج عدد الألياف التي تم النقر عليها.
7. بمجرد الانتهاء ، حدد النوع التالي من الألياف وكرر نفس الخطوات.
8. عندما يتم تعيين جميع ألياف الصورة إلى نوع معين من الألياف ، انقر فوق النتائج في نافذة عداد الخلايا لعرض النتائج في جدول.
9. احفظ هذا الجدول كجدول بيانات بالنقر فوق ملف | حفظ باسم في نافذة النتائج .
10. احفظ التحديدات وأعد تحميلها على نفس الصورة في أي وقت بالنقر فوق حفظ العلامات أو علامات التحميل، على التوالي، في نافذة عد الخلايا .
تحليل قطرات الدهون بطريقة تعتمد على نوع الألياف
1. تحليل صور Bodipy و laminin التي تم الحصول عليها على البؤرة باستخدام فيجي لتحديد كمية LDs.
  ملاحظة: صمم المؤلفون ماكرو مخصص لأتمتة التحليل. يتوفر هذا الماكرو، إلى جانب شرح خطوة بخطوة حول كيفية استخدامه، كملف تكميلي 1 وملف تكميلي 2، على التوالي.
2. افتح كل صورة بمساعدة مستورد التنسيقات الحيوية من فيجي. ضمن الخيار عرض المكدس باستخدام ، حدد Hyperstack | وضع اللون، افتراضي. تأكد من تحديد نافذة القياس التلقائي .
  ملاحظة: ستصف الخطوات التالية بروتوكول تحليل ألياف واحدة على الصورة، ولكن يجب تكرارها عدة مرات مثل عدد الألياف الكاملة التي تظهر على الصورة.
3. استخدم أداة التحديد الحر لتحديد ساركوليما الألياف يدويا استنادا إلى قناة laminin (الشكل 4A) واضغط على T على لوحة المفاتيح لتسجيل التحديد أو منطقة الاهتمام (ROI) في نافذة عائد الاستثمار.
4. انتقل إلى النافذة الرئيسية في فيجي وانقر على تحليل | اضبط القياسات، وفي النافذة المنبثقة، حدد المنطقة وقطر Feret. اترك المربعات المتبقية دون تحديد والمعلمات الأخرى كما تظهر بشكل افتراضي.
5. انقر فوق قياس في نافذة عائد الاستثمار للحصول على المساحة وقطر الحد الأدنى من Feret (MF) للألياف المحددة ، وقم بتدوينها لاستخدامها لاحقا.
  ملاحظة: عند تحليل LDs ، من المهم أن تضع في اعتبارك أن حجمها وكثافتها تختلف بين المركز ومحيط الألياف (المنطقة تحت الساركوليمالية-SS). لذلك ، يجب أن يتم التحليل بشكل منفصل.
6. احسب قيمة 1/6 من MF لتحديد الجزء المركزي من الألياف.
  ملاحظة: في الماكرو، يتم تعيين قيمة MF الافتراضية إلى 6، مما يعني أنه سيتم تعيين التخفيض المطبق ك 1/6 من MF. تم اختيار هذه القيمة بناء على البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها من وحيد الحيوانات التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون. ومع ذلك ، يجب على كل باحث تغيير هذا الرقم بناء على البيانات التجريبية والعضلات التي تم تحليلها ، ونوع الألياف ، وحالة الحيوان.
7. في نافذة عائد الاستثمار ، انقر فوق إضافة للحصول على نسخة مكررة من عائد الاستثمار الأول وحدد عائد الاستثمار الثاني الذي يظهر على النافذة.
8. في النافذة الرئيسية لفيجي ، انقر فوق تحرير | | الاختيار قم بتكبير القيمة المحسوبة مسبقا وتقديمها (من الخطوة 6.2.6.) باستخدام علامة ناقص قبل الرقم وانقر فوق موافق. في نافذة عائد الاستثمار، انقر فوق إضافة[t] (يجب أن يظهر عائد استثمار ثالث) وحذف، لحذف عائد الاستثمار الثاني.
  ملاحظة: يمكن للباحث التحقق من النتائج من خلال النقر على المربع إظهار الكل في نافذة عائد الاستثمار . عند هذه النقطة ، يجب أن يظهر عائد استثمار ، أحدهما يحيط بمحيط الألياف بالكامل (الشكل 4B) والآخر يتم وضعه في الوسط (الشكل 4C).
9. حدد كل من عائد الاستثمار في نافذة عائد الاستثمار وانقر على المزيد من | | XOR إضافة[ر]. انتظر حتى يظهر عائد استثمار ثالث ، والذي يتوافق مع محيط الألياف (الشكل 4D).
10. احفظ عائد الاستثمار من خلال النقر على مزيد من | حفظ لحفظ عائد الاستثمار في حالة الحاجة إلى إعادة تحليل لاحقة لنفس الألياف.
11. حدد قناة Bodipy وافتح أداة العتبة بالنقر فوق صورة | ضبط | عتبة على النافذة الرئيسية في فيجي.
12. في النافذة المنبثقة العتبة ، اضبط القيم على 70/255، وحدد الين | طريقة B&W، وانقر على الخلفية الداكنة | تطبيق.
  ملاحظة: قد تختلف القيم المطبقة على العتبة وفقا لظروف التجربة ويجب تعيين العتبة بشكل مناسب لتحسين التحليل. يجب أن تظهر نافذة B&W التي تحتوي على إشارة Bodipy أعلى من حد العتبة الموضح باللون الأبيض والخلفية باللون الأسود (قارن صورة Bodipy الأصلية في الشكل 4E بالصورة الموجودة في الشكل 4F).
13. انتقل إلى النافذة الرئيسية في فيجي وانقر على تحليل | قم بتعيين القياسات وفي النافذة المنبثقة، حدد المساحة وجزء المساحة والحد إلى العتبة. اترك المربعات المتبقية دون تحديد والمعلمات الأخرى كما تظهر بشكل افتراضي.
  ملاحظة: إذا أراد الباحث تحليل "دائرية" LDs ، وهو مؤشر للمورفولوجيا الكروية التي تتراوح من 1 للكرة المثالية إلى 0 لخط ، فانقر فوق مربع واصفات الشكل في النافذة المنبثقة مجموعة القياسات .
14. انتقل إلى نافذة عائد الاستثمار وحدد عائد الاستثمار الأول. في النافذة الرئيسية لفيجي ، انقر فوق تحليل | أداة تحليل الجسيمات.
  ملاحظة: تحدد هذه الأداة عدد المساحة الإجمالية التي تغطيها الجسيمات في كل تحديد وحجمها ومساحتها المغطاة ونسبتها المئوية وتحفظ النتائج كملف جدول بيانات.
15. اضبط القيم من 2 إلى ما لا نهاية (2-إنفينيتي) في نافذة تحليل الجسيمات، وحدد مربع البيكسلات، واحتفظ بقيم الدائرية الافتراضية، وحدد تلخيص، وانقر فوق موافق.
  ملاحظة: للتحقق من النتائج على الألياف، ضمن الخيار إظهار ، حدد أيا من الخيارات المتاحة. للتعرف على معلومات كل LD على التحديد في جدول، حدد خيار عرض النتائج في نافذة تحليل الجسيمات . يتم حساب متوسط نتائج تحليل المساحة الكلية للألياف وتلخيصها في جدول يحتوي على عدة أعمدة (العد ، المساحة الكلية ، متوسط الحجم ، النسبة المئوية للمساحة ؛ هذه تتوافق مع عدد الجسيمات [LDs] ، المساحة التي تشغلها هذه الجسيمات ، متوسط حجمها ، والنسبة المئوية للمساحة الكلية للاختيار الذي تشغله الجسيمات ، على التوالي). لحساب الكثافة، اقسم عدد الجسيمات على المساحة الإجمالية لكل اختيار.
16. للحصول على قيم مركز الألياف ومحيطها، كرر الخطوتين 6.2.14 و6.2.15، مع تحديد الثاني (الوسط) والعائد على الاستثمار الثالث (المحيط) في كل مرة.
17. احفظ النتائج بالنقر فوق ملف | حفظ باسم في نافذة الملخص .
  ملاحظة: قم بتضمين نوع الألياف والحالة واسم الصورة على الاسم المعين للنتائج لتسهيل التوحيد اللاحق والتحليل الإحصائي للبيانات. لتحليل بقية الألياف في نفس الصورة، كرر الخطوات من 6.2.3 إلى 6.2.17. للتحليل الإحصائي ، يجب تحليل ما لا يقل عن 10-15 ألياف من كل نوع لكل.

النتائج

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة فعالة لتحديد كمية LDs بسهولة في نوع الألياف وبطريقة خاصة بالخلايا الفرعية. ويبين كيف أنه من خلال تجميد عضلتين متشابهتين في الحجم، مثل مؤسسة كهرباء لبنان والوحيد، يتم تقليل الوقت والموارد التي تنفق على الخطوات التالية بمقدار النصف.

يتم توفي?...

Discussion

يصف البروتوكول المفصل هنا طريقة فعالة لقياس LDs الموسومة ب Bodipy على أساس نوع الألياف وتحت الخلوية. في السنوات الأخيرة ، تم استبدال الأصباغ الدهنية الكلاسيكية ، مثل ORO أو Sudan Black B ، بمجموعة جديدة من الأصباغ الفلورية النفاذة للخلايا والمحبة للدهون التي ترتبط بالدهون المحايدة (على سبيل المثال ، ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح من الصندوق الوطني للبحوث العلمية (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) والشركة الفرنكوفونية لديابيت (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. حاصل على زمالة الدكتوراه من FRIA (FNRS). حصل M.A.D.-L.d.C. على زمالة من برنامج Wallonie-Bruxelles الدولي للتميز.

يشكر المؤلفون أليس مونييه على مساهمتها في تطوير هذا البروتوكول وكارولين بوزين على خبرتها ومساعدتها التقنية في عملية الحصول على الصور. كما نشكر منصة التصوير 2IP-IREC للوصول إلى المجهر والمجاهر (منصة التصوير 2IP-IREC ، معهد البحوث التجريبية والسريرية ، الجامعة الكاثوليكية في لوفان ، 1200 بروكسل ، بلجيكا). وأخيرا، يود المؤلفون أن يشكروا نيكولاس دوبويسون ورومان فيرسيل وميشيل أبو سمرة على النقد البناء للمخطوطة. تم إنشاء بعض أرقام هذه المقالة مع BioRender.com.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix camera	Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera	Zeiss
Chemical hood	Potteau Labo	EN-14175
Confocal microscope	Zeiss	LSM800
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick)	Electron Microscopy Sciences	63305
Cryo-Gloves	Tempshield	16072252
Cryostat	Thermo Scientific	Microm Cryo Star HM 560
Dissecting Stereo Microscope SMZ745	Nikon
Dry Ice
Dumont Forceps	F.S.T	11295-10
Epifluorescence microscope	Zeiss	AxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T	14084-08
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm)	ThermoFisher	22-363-552	Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	BRAND Petri dish, MERK	BR455751	Used to place the muscles on ice during dissection
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen	Vector Labs	H-4000	Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections
Incubator	MMM Medcenter	Incucell 707
Microscope Cover Glasses (24x50 mm)	Assistent	40990151
Microscope Slide Boxes	Kartell	278	Used as humid chambers for immunohistochemistry
Neck holder	Linie zwo	SB-035X-02	Used as strap to hold the stainless steel tumbler
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade	Swann-Morton	0205
Paint brushes	Van Bleiswijck	Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Permanent Marker Pen Black	Klinipath/VWR	98307-R	Used to label slides
Pierce Fixation Forceps	F.S.T	18155-13
Polystyrene Box			H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3	Aesculap	BB073R
Stainless Steel Cup 10oz	Eboxer	B07GFCBPFH	Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing
Superfrost Ultra Plus slides	ThermoFisher	J1800AMNZ
Surgical tweezers 1/2 teeth	Medische Vakhandel	1303152	Also called "Rat teeth tweezers"
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge	F.S.T	15000-00
Weighing boats	VWR international	611-2249
Whole-Slide Scanner for Fluorescence	Zeiss	Axio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b	Sigma-Aldrich	SAB4600477	Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1	ThermoFisher	A-21121	Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM	Abcam	ab175702	Used at a final concentration of 1:1,000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher	A-21247	Used at a final concentration of 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)	ThermoFisher	D3922	Used at a final concentration of 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)	ThermoFisher	D3835	Used at a final concentration of 1 µg/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFisher	D1306	Used at a final concentration of 0.5 µg/mL
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8418	Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	1004969011	CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Isopentane GPR RectaPur	VWR international	24872.298	CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.
Liquid Nitrogen			CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids.
Mouse on mouse Blocking Reagent	Vector Labs	MKB-2213-1	Used at concentration of 1:30
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b	DSHB University of Iowa	BA-D5-supernatant	Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1	DSHB University of Iowa	SC-71-supernatant	Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM	Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa	6H1-supernatant	Used at a final concentration of 1:5
Normal Goat Serum (NGS)	Vector Labs	S-1000
PBS 0.1 M			Commonly used on histology laboratories
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930
Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal)	Sigma-Aldrich	L0663	Used at a final concentration of 1:1,000
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Software
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.		Used to design the figures
Adobe Photoshop	Adobe Inc.		Confocal software
BioRender	https://biorender.com/		Used to design the figures
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/		Used to analyse the acquired images
Microsoft PowerPoint	Microsoft		Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types
Zen Blue 2.6	Zeiss		Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types

References

Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963 (2020).
Miljkovic, I., et al. Greater skeletal muscle fat infiltration is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality in older men. Journals of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (9), 1133-1140 (2015).
Nachit, M., et al. Myosteatosis rather than sarcopenia associates with non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease preclinical models. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 12 (1), 144-158 (2021).
Aleixo, G. F. P., et al. Myosteatosis and prognosis in cancer: Systematic review and meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematolgoy. 145, 102839 (2020).
Gemmink, A., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Exercising your fat (metabolism) into shape: a muscle-centred view. Diabetologia. 63 (8), 1453-1463 (2020).
van Loon, L. J. Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 97 (4), 1170-1187 (2004).
Coen, P. M., Goodpaster, B. H. Role of intramyocelluar lipids in human health. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23 (8), 391-398 (2012).
Seibert, J. T., Najt, C. P., Heden, T. D., Mashek, D. G., Chow, L. S. Muscle lipid droplets: cellular signaling to exercise physiology and beyond. Trends in Endocrinology and Metabolism. 31 (12), 928-938 (2020).
Bergman, B. C., Goodpaster, B. H. Exercise and muscle lipid content, composition, and localization: influence on muscle insulin sensitivity. Diabetes. 69 (5), 848-858 (2020).
Nielsen, J., Christensen, A. E., Nellemann, B., Christensen, B. Lipid droplet size and location in human skeletal muscle fibers are associated with insulin sensitivity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 313 (6), 721-730 (2017).
Covington, J. D., et al. Intramyocellular lipid droplet size rather than total lipid content is related to insulin sensitivity after 8 weeks of overfeeding. Obesity (Silver Spring). 25 (12), 2079-2087 (2017).
Bosma, M. Lipid droplet dynamics in skeletal muscle). Experimental Cell Research. 340 (2), 180-186 (2016).
Nielsen, J., et al. Increased subsarcolemmal lipids in type 2 diabetes: effect of training on localization of lipids, mitochondria, and glycogen in sedentary human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 298 (3), 706-713 (2010).
Ferreira, R., et al. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria proteome differences disclose functional specializations in skeletal muscle. Proteomics. 10 (17), 3142-3154 (2010).
Barrett, J. S., Whytock, K. L., Strauss, J. A., Wagenmakers, A. J. M., Shepherd, S. O. High intramuscular triglyceride turnover rates and the link to insulin sensitivity: influence of obesity, type 2 diabetes and physical activity. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism. , 1-14 (2022).
Daemen, S., et al. Distinct lipid droplet characteristics and distribution unmask the apparent contradiction of the athlete's paradox. Molecular Metabolism. 17, 71-81 (2018).
Bredella, M. A., Ghomi, R. H., Thomas, B. J., Miller, K. K., Torriani, M. Comparison of 3.0 T proton magnetic resonance spectroscopy short and long echo-time measures of intramyocellular lipids in obese and normal-weight women. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 32 (2), 388-393 (2010).
Schrauwen-Hinderling, V. B., Hesselink, M. K., Schrauwen, P., Kooi, M. E. Intramyocellular lipid content in human skeletal muscle. Obesity (Silver Spring). 14 (3), 357-367 (2006).
De Bock, K., et al. Evaluation of intramyocellular lipid breakdown during exercise by biochemical assay, NMR spectroscopy, and Oil Red O staining. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (1), 428-434 (2007).
Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochemistry and Cell Biology. 116 (1), 63-68 (2001).
Gueugneau, M., et al. Skeletal muscle lipid content and oxidative activity in relation to muscle fiber type in aging and metabolic syndrome. Journal of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (5), 566-576 (2015).
Gemmink, A., et al. Super-resolution microscopy localizes perilipin 5 at lipid droplet-mitochondria interaction sites and at lipid droplets juxtaposing to perilipin 2. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (11), 1423-1432 (2018).
Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 598358, (2011).
Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), 77774 (2013).
Strauss, J. A., Shepherd, D. A., Macey, M., Jevons, E. F. P., Shepherd, S. O. Divergence exists in the subcellular distribution of intramuscular triglyceride in human skeletal muscle dependent on the choice of lipid dye. Histochemistry and Cell Biology. 154 (4), 369-382 (2020).
Shepherd, S. O., et al. Sprint interval and traditional endurance training increase net intramuscular triglyceride breakdown and expression of perilipin 2 and 5. Journal of Physiology. 591 (3), 657-675 (2013).
Whytock, K. L., et al. A 7-day high-fat, high-calorie diet induces fibre-specific increases in intramuscular triglyceride and perilipin protein expression in human skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (6), 1151-1167 (2020).
Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using h&e staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), (2017).
Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51586 (2014).
Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52793 (2015).
Leiva-Cepas, F., et al. Laboratory methodology for the histological study of skeletal muscle. Archivos de Medicina del Deporte. 35 (186), 254-262 (2018).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 10 (3), 197-205 (1989).
Komiya, Y., et al. Mouse soleus (slow) muscle shows greater intramyocellular lipid droplet accumulation than EDL (fast) muscle: fiber type-specific analysis. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 38 (2), 163-173 (2017).
Andrich, D. E., et al. Altered lipid metabolism impairs skeletal muscle force in young rats submitted to a short-term high-fat diet. Frontiers in Physiology. 9, 1327 (2018).
Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiologica. 199 (4), 451-463 (2010).
Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
Gemmink, A., et al. Decoration of intramyocellular lipid droplets with PLIN5 modulates fasting-induced insulin resistance and lipotoxicity in humans. Diabetologia. 59 (5), 1040-1048 (2016).
Askinas, C., et al. . Biophotonics Congress: Biomedical Optics Congress 2018 (Microscopy/Translational/Brain/OTS). , (2018).
Morén, B., et al. EHD2 regulates adipocyte function and is enriched at cell surface-associated lipid droplets in primary human adipocytes. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1147-1159 (2019).
Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
de la Rosa Rodriguez, M. A., et al. Hypoxia-inducible lipid droplet-associated induces DGAT1 and promotes lipid storage in hepatocytes. Molecular Metabolism. 47, 101168 (2021).
Jevons, E. F. P., Gejl, K. D., Strauss, J. A., Ørtenblad, N., Shepherd, S. O. Skeletal muscle lipid droplets are resynthesized before being coated with perilipin proteins following prolonged exercise in elite male triathletes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 318 (3), 357-370 (2020).
Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochemistry and Cell Biology. 124 (5), 445-452 (2005).
Prats, C., et al. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine. Journal of Lipid Research. 47 (11), 2392-2399 (2006).
Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , (2007).
Xue, Y., Lim, S., Bråkenhielm, E., Cao, Y. Adipose angiogenesis: quantitative methods to study microvessel growth, regression and remodeling in vivo. Nature Protocols. 5 (5), 912-920 (2010).
Muliyil, S., et al. ADAM17-triggered TNF signalling protects the ageing Drosophila retina from lipid droplet-mediated degeneration. The EMBO Journal. 39 (17), 104415 (2020).
Yan, Q., et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis. Cell Death Discovery. 4, 2 (2018).
Coassin, S., et al. Investigation and functional characterization of rare genetic variants in the adipose triglyceride lipase in a large healthy working population. PLoS Genetics. 6 (12), 1001239 (2010).
Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
Chen, Q., et al. Rab8a deficiency in skeletal muscle causes hyperlipidemia and hepatosteatosis by impairing muscle lipid uptake and storage. Diabetes. 66 (9), 2387-2399 (2017).
Gemmink, A., et al. Decoration of myocellular lipid droplets with perilipins as a marker for in vivo lipid droplet dynamics: A super-resolution microscopy study in trained athletes and insulin resistant individuals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (2), 158852 (2021).
Bergman, B. C., Hunerdosse, D. M., Kerege, A., Playdon, M. C., Perreault, L. Localisation and composition of skeletal muscle diacylglycerol predicts insulin resistance in humans. Diabetologia. 55 (4), 1140-1150 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: