JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم طريقة بسيطة وموحدة لتحليل المجموعة الفرعية لعامل تحفيز مستعمرة T في الجسم الحي.

Abstract

بالتوازي مع سلالات Th1 / Th2 / Th17 / Treg التقليدية ، تم تحديد الخلايا التائية المساعدة المنتجة للعامل المحفز للمستعمرة (Th-GM) كمجموعة فرعية مميزة من الخلايا التائية المساعدة (GM-CSF + IFN-γ- IL-17A- IL-22- الخلايا التائية المستجيبة CD4 + T الخلايا) في الإنسان والفئران. يعتبر فرط الحساسية التلامسية (CHS) نموذجا حيوانيا ممتازا لالتهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD) في الإنسان ، مما يدل على استجابة مناعية سليمة بوساطة الخلايا التائية. لتوفير اختبار موحد وشامل لتحليل المجموعة الفرعية لخلية Th-GM في الاستجابة المناعية المعتمدة على الخلايا التائية في الجسم الحي ، تم تحفيز نموذج CHS للفئران عن طريق التحسس / التحدي مع هابتين عضوي تفاعلي منخفض الوزن جزيئي ، 2،4-دينيتروفلوروبنزين (DNFB). تم تحليل المجموعة الفرعية Th-GM في الخلايا التائية المستجيبة CD4 + التي تم إنشاؤها عند التحصين باستخدام hapten عن طريق قياس التدفق الخلوي. وجدنا أن Th-GM تم توسيعه بشكل أساسي في الآفات وتصريف الغدد الليمفاوية في نموذج فأر CHS الناجم عن DNFB. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمزيد من الدراسة لبيولوجيا خلايا Th-GM والبحوث الدوائية للاستراتيجيات العلاجية التي تركز على GM-CSF في ظروف مختلفة ، مثل ACD.

Introduction

ظهرت الخلايا التائية المساعدة المنتجة للخلايا الحبيبية والضامة (GM-CSF) - المجموعة الفرعية Th-GM - كمجموعة فرعية مميزة من الخلايا التائية المساعدة في الإنسان والفئران وتعتبر تشتمل على "GM-CSF - التي تعبر عن GM-CSF فقط" (GM-CSF + IFN-γ- IL-17A- IL-22-) خلايا CD4 T التي تم تحديدها عن طريق تحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، وقياس الكتلة الخلوية ، والفئران المرسومة لمصير GM-CSF1،2،3. في عام 2014 ، Sheng et al. أبلغ عن محول إشارة ومنشط برمجة النسخ 5 (STAT5) للمجموعة الفرعية Th-GM ووضع تصور للمجموعة الفرعية "Th-GM" لأول مرة4،5. تتميز خلايا Th-GM بالتعبير عن السيتوكين ل GM-CSF و IL-2 و TNF-α و IL-3 و CCL20 ومستقبلات الكيموكينات C-X-C نوع مستقبلات الكيموكين (CXCR) 4 أو CXCR61،2. تعتبر STAT و / أو مسار NF-κB ضرورية لتمايز سلالة Th-GM. تم إنشاء طريقة في المختبر للتمييز بين خلايا CD4 T الساذجة إلى خلايا Th-GM باستخدام IL-7 في وجود محفزات TCR6. وفي الوقت نفسه ، تبين أن السيتوكينات IL-23 و IL-1β تحافظ على التعبير والإمراضية لخلايا Th-GM خارج الجسم الحي3،7.

ارتبط ارتفاع خلايا Th-GM بالعديد من أمراض المناعة الذاتية ، مثل التصلب المتعدد والتهاب المفاصل الروماتويدي2،8،9 ، مما يشير إلى دور محتمل في التسبب في المناعة الذاتية10. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن GM-CSF يمكن أن يعمل كوسيط التهابي. الفئران تفرط في التعبير وراثيا عن Csf2 (الجينات التي تشفر GM-CSF) في خلايا CD4 + T طورت تلقائيا عجزا عصبيا مصحوبا بتسلل الخلايا البلعمية إلى الجهاز العصبي المركزي. في نموذج التهاب القولون المرتبط بنقل الخلايا التائية ، أدى النقل بالتبني للخلايا التائية Csf2 − / − إلى الفئران Rag1 − / - إلى تقليل السمات السريرية والنسيجية المرضية للمرض بشكل كبير. ومع ذلك ، هناك عدد قليل من التقارير عن أدوار المجموعة الفرعية Th-GM في أمراض الحساسية ، مثل ACD.

يعد ACD من بين أكثر الحالات الجلدية الالتهابية شيوعا مع انتشار مرتفع في بيئات العمل والحياة11،12. إنها استجابة فرط الحساسية من النوع الرابع المتأخر بوساطة دائرة مناعية سليمة تتطور في مرحلتين مجزأتين زمنيا: التحسس والاستنباع. يحدث ACD البشري عن طريق التعرض لبعض المواد الكيميائية (الهابتنز أو المعادن) التي تؤدي إلى التحسس. خلال هذه المرحلة ، يتم تحضير استجابة بوساطة الخلايا التائية بواسطة مجمعات البروتين الهابتين التي تقدمها الخلايا العارضة للمستضد. عند التعرض اللاحق لنفس الهابتين ، يتم إعادة تنشيط المستجيب الخاص ب hapten والخلايا التائية للذاكرة وتوطينها في الجلد ، وهي عملية تنطوي على تسلل مجموعة متنوعة من مجموعات الخلايا المناعية. تعرف هذه الاستجابة الالتهابية الحادة باسم الاستنباط ، مما يؤدي إلى التطور الكامل للآفات13. يمكن دراسة ACD البشري باستخدام نماذج حيوانية لفرط الحساسية التلامسية (CHS) 14.

نموذج CHS الناجم عن تفاعل ، منخفض الوزن الجزيئي ، هابتين عضوي ، 2،4-دينيترو فلوروبنزين (DNFB) ، هو نموذج فئران شائع الاستخدام تم استخدامه في دراسة علم الأمراض بالإضافة إلى التدخلات العلاجية المحتملة ل ACD15،16. وبالتالي ، يمكن تطبيق هذا النموذج المعتمد على الخلايا التائية لدراسة توليد المجموعة الفرعية Th-GM في أمراض الحساسية. هنا ، قمنا بتحفيز نموذج الفئران ل CHS مع DNFB ، وقمنا بتحليل توليد Th-GM في الآفات وتصريف الغدد الليمفاوية ، ووجدنا أن المجموعة الفرعية Th-GM قد تم توسيعها بشكل أساسي عند إعادة التعرض لنفس hapten. يشير هذا إلى أن المجموعة الفرعية Th-GM يمكن أن تكون ضرورية لتطوير ACD وتمثل هدفا علاجيا محددا في ACD.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

كانت جميع الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول على خلفية وراثية C57BL / 6 ، ويتم الاحتفاظ بها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ، وتم تزويدها بالطعام والماء بشكل خاص. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل هيئة المراجعة الأخلاقية لرعاية التابعة لمركز غرب الصين الطبي ، جامعة سيتشوان (20210302059).

1. إعداد الكاشف والمواد

  1. محلول DNFB 0.5٪ كمحسس
    1. لتوعية 10 فئران ، قم بإعداد 1.1 مل من خليط الأسيتون / زيت الزيتون 4: 1 (حجم / حجم): خلط 880 ميكرولتر من الأسيتون و 220 ميكرولتر من زيت الزيتون للسماح ل 0.1 مل من الحجم الزائد لحساب أي خسائر طفيفة في الحجم. أضف 5 ميكرولتر من DNFB إلى 1.1 مل من خليط الأسيتون / زيت الزيتون المتجانس 4: 1.
      ملاحظة: استعد طازجا في يوم التحسس. يجب تحضير خليط الأسيتون / زيت الزيتون في غطاء الدخان.
  2. 0.2٪ حل DNFB كمنافس
    1. لتحدي 10 فئران ، أضف 0.5 ميكرولتر من DNFB في 0.25 مل من خليط الأسيتون / زيت الزيتون المتجانس 4: 1 الموصوف في الخطوة 1.1. استخدم خليط الأسيتون / زيت الزيتون 4: 1 كوسيلة عند تحدي الفئران بعد التحسس.
      ملحوظة: يجب تحضير خليط الأسيتون / زيت الزيتون في غطاء الدخان.
  3. هيدرات الكلور كمخدر
    1. قم بإذابة 4 جم من هيدرات الكلور في 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لعمل محلول عمل بنسبة 8٪. قم بالتصفية والتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. استخدم 5 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم للفأر.
  4. 50x مخزون كولاجيناز IV
    1. قم بإذابة 100 مجم من الكولاجيناز الوريدي في 1 مل من وسط RPMI 1640 الأساسي (غير مكمل بالمضادات الحيوية أو مصل الأبقار الجنينية [FBS]) لإنتاج مخزون 100 ملغم/مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 100 ميكرولتر لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  5. 1,000x مخزون DNase I
    1. قم بإذابة 5 مجم من DNase I في 1 مل من 0.15 M كلوريد الصوديوم لعمل مخزون 5 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 100 ميكرولتر لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  6. إيقاف المخزن المؤقت
    1. قم بإذابة 1.681 جم من EDTA في 50 مل من وسط RPMI 1640 الأساسي لعمل مخزون 100 ملم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  7. غسل متوسط
    1. قم بإذابة 0.372 جم من EDTA إلى تركيز نهائي قدره 2 ملي مولار و 5 مل من FBS إلى تركيز نهائي قدره 1٪ مع 500 مل من PBS. قم بالتصفية والتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  8. تلطيخ المخزن المؤقت
    1. قم بإذابة 0.372 جم من EDTA إلى تركيز نهائي قدره 2 ملي مولار و 10 مل من FBS إلى تركيز نهائي قدره 2٪ مع 500 مل من PBS. قم بالتصفية والتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  9. كواشف إعادة التحفيز
    1. قم بإذابة 1 مجم من فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) في 20 مل من DMSO لعمل مخزون 50 ميكروغرام / مل (500x) وتخزينه عند -20 درجة مئوية في 50 ميكرولتر من الكميات الصغيرة.
    2. قم بتخفيف 250 ميكرولتر من الأيونومايسين في محلول (4 مجم / مل) في 7.75 مل من DMSO لعمل مخزون 500 ميكروغرام / مل (500x) وتخزينه عند -20 درجة مئوية في 50 ميكرولتر من الحصص الصغيرة.
    3. Aliquot 1 مل من محلول مثبط نقل البروتين (يحتوي على brefeldin A) في 50 ميكرولتر وتخزين الحصص عند 4 درجات مئوية.

2. تحريض CHS في الفئران

  1. في اليوم -5 ، قم بتخدير الفئران عن طريق حقن 400 مجم / كجم من هيدرات الكلور داخل الصفاق.
  2. باستخدام ماكينة حلاقة للحيوانات الأليفة ، احلق مساحة 2 سم × 2 سم على بطن الفأر.
    ملاحظة: تجنب خدش جلد الماوس. حافظ على سلامة الحاجز الجلدي سليما.
  3. قم بتلطيخ 100 ميكرولتر من محلول DNFB 0.5٪ على البطن المحلوقة برفق وبشكل متساو باستخدام ماصة دقيقة ذات أطراف يمكن التخلص منها. امسك الفئران من 5 إلى 10 ثوان للسماح لبعض المذيبات بالتبخر.
  4. في اليوم -4 ، كرر الخطوات 2.1-2.3 لتوعية أخرى.
    ملاحظة: يعمل حدثان للتوعية بشكل أفضل من حدث واحد.
  5. في اليوم 0 ، تحدى الأذن اليمنى للفئران ب 20 ميكرولتر من 0.2٪ DNFB باستخدام ماصة دقيقة ذات أطراف يمكن التخلص منها ، وعالج الأذن اليسرى بنفس حجم خليط الأسيتون / زيت الزيتون 4: 1 مثل السيارة.
    ملاحظة: تحدي الجانبين الظهري والبطني للأذن بكميات متساوية من DNFB أو السيارة.
  6. في الأيام الثلاثة القادمة ، قم بقياس سمك الأذن للأذن اليمنى واليسرى للفئران يوميا باستخدام مقياس سمك القرص ، واحسب الزيادة في سمك الأذن: سمك الأذن اليمنى - سمك الأذن اليسرى.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة زيادة تدريجية في سمك الأذن في آذان الفئران التي تحدى DNFB بنسبة 0.2٪ مقارنة بالأذنين المعالجة بالسيارة.

3. جمع عينة من فئران CHS

  1. في اليوم 3 ، قم بتخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق 400 مجم / كجم من هيدرات الكلورال. انتظر لمدة 5-10 دقائق حتى يكون الفأر في حالة فقدان للوعي وقم بإجراء قرصة لطيفة على إصبع القدم الخلفيتين للتأكد من أن الفئران مخدرة بعمق.
  2. التقط صورة لكل أذن لكل فأرة باستخدام الكاميرا. تسجيل القشرة (تقشير الأذن) واحمرار الأذن (حمامي على الأذن) بشكل مستقل لتقييم شدة الالتهاب على مقياس من 0 إلى 5: 0 ، لا شيء ؛ 1 ، طفيف. 2 ، معتدل ؛ 3 ، ملحوظ. 4 ، ملحوظ جدا. 5 ، الأكثر شدة.
  3. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم. اقطع الأذن بأكملها وقم بتشريح الغدد الليمفاوية المتوازية للفئران باستخدام مقص حاد معقم وملقط. ضع الأنسجة في بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار موضوعة على الجليد تحتوي على 5 مل من PBS المبرد مسبقا للتفكك الأنزيمي أو الفيزيائي لتوليد معلقات أحادية الخلية (الشكل التكميلي S1A والشكل التكميلي S2A).
  4. للتحليل النسيجي ، قم بإصلاح عينات الأذن في 4٪ بارافورمالدهايد ، وتجفيف ، وتضمينها في البارافين للتلوين الكيميائي المناعي ، كما هو موضح في مكان آخر17.

4. تحضير تعليق خلية واحدة من الأذنين

  1. قم بتقسيم الجانبين البطني والظهري للأذن عن طريق الضغط على الأطراف المقطوعة وتمزيقها بملقطين منحنيين (الشكل التكميلي S1B). ضعها في بئر من صفيحة من 6 آبار تحتوي على 4.5 مل من محلول الهضم ، مما يضمن غمر تلك الأنسجة تماما في مخزن الهضم (الشكل التكميلي S1C).
    ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت للهضم من RPMI 1640 يحتوي على 10٪ FBS + 25 ملي مولار HEPES + 2 مجم / مل كولاجيناز IV + 5 ميكروغرام / مل DNase I.
  2. احتضان وريقات الأذن في حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بقص منشورات الأذن بالمقص بأصغر حجم ممكن لتسهيل هضم الأنسجة (الشكل التكميلي S1D) ، وأعد العينة إلى الحاضنة لمدة 40 دقيقة أخرى.
    ملاحظة: يمكن تحقيق الهضم الفعال في غضون 40-50 دقيقة. يؤثر فرط الهضم عند 37 درجة مئوية على بقاء الخلية.
  3. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت للتوقف لكل بئر لتحييد الأنشطة الأنزيمية للكولاجيناز IV و DNase I. قم بتنفيذ الخطوات التالية على الجليد.
  4. انقل شظايا أنسجة الأذن بزوج من الملقط المنحني إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على مصفاة خلية سعة 70 ميكرومتر وماصة الحجم الكامل للوسط في نفس مصفاة الخلية.
  5. قم بتعطيل الأنسجة باستخدام الطرف العلوي من مكبس حقنة سعة 1 مل. اضغط بحركة دائرية على مصفاة الخلية 70 ميكرومتر حتى تبقى الأنسجة الضامة البيضاء فقط (الشكل التكميلي S1D).
  6. اشطف مصافي الخلايا مرتين ب 1,000 ميكرولتر من وسط الغسيل. انقل حجم البئر بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. احتفظ بالأنبوب على الجليد.

5. تحضير المعلقات أحادية الخلية من تصريف الغدد الليمفاوية (dLNs)

  1. انقل الغدد الليمفاوية بزوج من الملقط المنحني إلى مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق بئر صفيحة مكونة من 6 آبار (الشكل التكميلي S2B). قم بفصل الغدد الليمفاوية باستخدام الطرف العلوي من مكبس حقنة سعة 1 مل. اضغط في حركات دائرية على مصفاة الخلية 70 ميكرومتر حتى يتبقى الحطام الأبيض فقط (الشكل التكميلي S2C).
  2. اشطف مصفاة الخلية مرتين ب 1,000 ميكرولتر من وسط الغسيل. انقل حجم البئر بالكامل إلى أنبوب سعة 5 مل. احتفظ بالأنابيب على الجليد.

6. إعادة تحفيز المجموعة الفرعية Th-GM مع 12-myristate 13-acetate (PMA) / ionomycin في وجود مثبط لنقل البروتين

  1. قم بالطرد المركزي للخلايا المعزولة من الأذن وعينات العقدة الليمفاوية المستنزفة لمدة 8 دقائق عند 400 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات ب 1,000 ميكرولتر من وسط الغسيل برفق.
  2. اجمع جزءا صغيرا من كل عينة لحساب العدد الإجمالي للخلايا المشتقة من الأذن وتصريف العقدة الليمفاوية باستخدام مقياس كثافة الدم. أضف 0.04٪ تريبان بلو لقياس صلاحية الخلية.
    ملاحظة: يجب أن تكون صلاحية الخلية أكثر من 60٪ لتحفيز الخلايا التائية وتحليلها لاحقا. يمكن أن تكون كثافة الخلية 1-5 × 106 / مل.
  3. الطرد المركزي للخلايا في الخطوة 6.1 وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات برفق مع 1,000 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 2٪ FBS ، وبذرة 1 مل من المعلق أحادي الخلية (106 خلايا / مل) في 12 بئر من ألواح زراعة الأنسجة ذات القاع المسطح.
  4. أضف 2 ميكرولتر من فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) (التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل) ، 2 ميكرولتر من الأيونوميسين (التركيز النهائي 1،000 نانوغرام / مل) ، و 1 ميكرولتر من مثبط نقل البروتين (يحتوي على بريفيلدين أ) إلى كل بئر في الصفيحة المكونة من 12 بئرا تحتوي على 1 مل من معلق الخلية المفردة أعلاه واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.

7. تحليل المجموعات الفرعية Th-GM التي تم إنشاؤها في الجسم الحي بواسطة سطح الخلية والتلوين داخل الخلايا

  1. انقل الخلايا المحفزة إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل باستخدام ماصة. قم بالطرد المركزي لأنابيب الطرد المركزي لمدة 8 دقائق عند 400 × جم في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
  2. اغسل حبيبات الخلية مرة واحدة باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للتلوين وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي, كما هو موضح في الخطوة 7.1. أعد تعليق الخلايا عند 1-10 × 106 / مل في 0.5 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ.
  3. أضف 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون صبغة قابلية للحياة (انظر جدول المواد) إلى 0.5 مل من تعليق الخلية والدوامة على الفور. احتضن الخليط لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للتلوين ، وكرر الطرد المركزي في الخطوة 7.1 لحبيبات الخلايا.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 0.1 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل CD4 (مترافق FITC) ، و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل CD44 (مترافق مع APC) ، و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل CD62L (PE / Cyanine7-conjugated) إلى ثلاثة حصص 0.1 مل من تعليق الخلية. دوامة على الفور وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، محمية من الضوء.
  5. كرر عمليات الغسيل والطرد المركزي في الخطوة 7.3.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتثبيت IC واحتضانها لمدة 20 دقيقة في الظلام. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد مخزن مؤقت للنفاذية (1x) عن طريق تخفيف جزء واحد من مخزن النفاذية (10x) مع 9 أجزاء من الماء المقطر. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من عازلة النفاذية (1x) عن طريق الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. أعد تعليق الحبيبات في 0.1 مل من المخزن المؤقت للنفاذية (1x) مع الأجسام المضادة ضد GM-CSF (مترافق PE ، 1 ميكرولتر / اختبار) ، IFN-γ (مترافق BV711 ، 1 ميكرولتر / اختبار) ، IL-17A (مترافق BV421 ، 1 ميكرولتر / اختبار) ، و IL-22 (PerCP / Cyanine5.5 مترافق ، 5 ميكرولتر / اختبار) واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  8. كرر عمليات الغسيل والطرد المركزي في الخطوة 7.6.
  9. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من PBS وانقل التعليق إلى أنبوب اختبار دائري القاع. قم بتشغيل الخلايا الملطخة في مقياس التدفق الخلوي.

8. استراتيجية البوابات لتحديد المجموعة الفرعية Th-GM

  1. قم بتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول البرنامج المستخدم) باستخدام استراتيجية البوابات الموضحة في الشكل التكميلي S1. بالنسبة للبرنامج المستخدم هنا ، قم بتنزيله وإعداده على الكمبيوتر.
  2. قم باستيراد بيانات قياس التدفق الخلوي بالنقر فوق ملف |فتح | قم باستيراد ملفات FCS إلى البرنامج، وقم بالتعليق على المجموعة واسم كل نموذج عن طريق تحديد علامة التبويب إعادة تسمية .
  3. اختر الخلايا الليمفاوية على مخطط FSC مقابل SSC (FSC منخفض SSC منخفض ، P1) لاستبعاد الحطام الموجود في الزاوية اليسرى السفلية والخلايا النخاعية ذات الحجم الكبير والحبيبات العالية بالنقر فوق مخطط الكثافة ، وإظهار المحور X لهذه المؤامرة ك FSC-A والمحور Y ك SSC-A.
  4. انقر نقرا مزدوجا فوق الأحداث في P1 لإنشاء مخطط كثافة آخر، وافصل الخلايا المفردة (الموضحة كخط مرتبط، P2) عن مجمعات الخلايا عن طريق تحديد ارتفاع الخلية ومساحتها في هذا المخطط (المحور X مثل FSC-A مقابل المحور Y مثل FSC-H).
  5. انقر نقرا مزدوجا فوق الأحداث في P2 لإنشاء مخطط كثافة آخر، وإظهار المحور X لهذه المخطط ك FSC-A والمحور Y ك SSC-A. قم ببوابة مجموعات الخلايا القابلة للحياة باستخدام أحداث FVS 780 ( P3).
  6. انقر نقرا مزدوجا فوق الأحداث في P3 لإنشاء مخطط الكثافة التالي (المحور X مثل CD4-A والمحور Y ك SSC-A)، وقم بتمييز خلايا CD4 T عن طريق اختيار مجموعة CD4+ (P4).
  7. انقر نقرا مزدوجا فوق الأحداث في P4 لإنشاء مخطط كثافة آخر (المحور X مثل CD44-A والمحور Y ك CD62L-A) ، وحدد الخلايا المساعدة T للمستجيب عن طريق اختيار المحتوى العلوي الأيمن لهذه المخططة (CD62L- CD44 + ، P5).

9. التحليل الإحصائي

  1. إجراء التحليلات الإحصائية ، ومقارنة مجموعتين باستخدام اختبار t غير متزاوج. * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001 و **** P < 0.0001 (متوسط ± SD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

CHS الناجم عن DNFB (فرط الحساسية التلامسية) في الفئران
للحث على CHS في الفئران ، تم توعية الفئران وتحديها باستخدام DNFB المطبق على جلد الأذن ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. زاد سمك الأذن ، وهو مؤشر على الإسفنج في البشرة ، بشكل ملحوظ في الفئران التي تواجه تحدي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول اختبارا بسيطا في الجسم الحي لتحليل توليد وتوسيع المجموعة الفرعية لخلية Th-GM. من الضروري استخدام نموذج مرض بوساطة الخلايا التائية في الفئران التي بدأتها الهابتنس أو المستضدات ، مما يحاكي هذا التنشيط في الإنسان. DNFB هو جزيء صغير أكثر اقتصادا وموفرا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81602763 ، 81803142 ، 82003347) ، وبرنامج الباحث الممتاز لمؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (رقم 2017T100700) ، وبرنامج الباحثين العاديين لمؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (رقم 2016M592673). يود المؤلفون أن يشكروا يان وانغ ومنغ لي تشو (المرافق الأساسية لمستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان) على الدعم الفني لقياس التدفق الخلوي في هذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4-dinitrofluorobenzeneBT REAGENTP0001746CAS NO: 70-34-8
AcetoneCHRON CHEMICALS/67-64-1
anti-CD4 antibodyBiolegend3005061:100 Diluted
anti-CD44 antibodyBiolegend1030121:100 Diluted
anti-CD62L antibodyBiolegend1044171:100 Diluted
anti-GM-CSF antibodyBD Bioscience5545071:100 Diluted
anti-IFN-γ antibodyBiolegend5058361:100 Diluted
anti-IL-17A antibodyBD Bioscience5633541:100 Diluted
anti-IL-22 antibodyBiolegend5164115 µL/test
CD45Biolegend1031011:200 Diluted
Chloral hydrateCHRON CHEMICALS/302-17-0
Dial thickness gauge (0.01 mm type)PEACOCKG-1A/
DMSOLIFESCIENCESD837167-68-5
EDTA Na2SolarbioE80306381-92-6
F4/80Biolegend1231021:200 Diluted
Fixable Viability Stain 780BD Bioscience5653881:1,000 Diluted, viability dye
Flow cytometerBD BioscienceBD FACS ARIA II SORP/
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 7Software for statistics and graphing
Intracelluar Fixtation and Permeablization Buffer SetThermo Fisher88-8824-00prepared freshly
IonomycinSigma-Aldrich407951CAS NO: 56092-81-0
Ly6GBiolegend1276021:200 Dilutied
NovoExpressAgilent/Software for flow cytometry data analysis; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Olive oilYUANYE BIOS305038001-25-0
PMASigma-AldrichP8139CAS NO: 16561-29-8
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Bioscience5550291 µL/mL

References

  1. Rasouli, J., et al. A distinct GM-CSF(+) T helper cell subset requires T-bet to adopt a TH1 phenotype and promote neuroinflammation. Science Immunology. 5 (52), (2020).
  2. Galli, E., et al. GM-CSF and CXCR4 define a T helper cell signature in multiple sclerosis. Nature Medicine. 25 (8), 1290-1300 (2019).
  3. Komuczki, J., et al. Fate-mapping of GM-CSF expression identifies a discrete subset of inflammation-driving T helper cells regulated by cytokines IL-23 and IL-1beta. Immunity. 50 (5), 1289-1304 (2019).
  4. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24 (12), 1387-1402 (2014).
  5. Herndler-Brandstetter, D., Flavell, R. A. Producing GM-CSF: a unique T helper subset. Cell Research. 24 (12), 1379-1380 (2014).
  6. Lu, Y., Fu, X. Y., Zhang, Y. In vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58087(2018).
  7. Hu, Y., et al. Interleukin-1beta-induced IRAK1 ubiquitination is required for TH-GM-CSF cell differentiation in T cell-mediated inflammation. Journal of Autoimmunity. 102, 50-64 (2019).
  8. Reynolds, G., et al. Synovial CD4+ T-cell-derived GM-CSF supports the differentiation of an inflammatory dendritic cell population in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (5), 899-907 (2016).
  9. Al-Mossawi, M. H., et al. Unique transcriptome signatures and GM-CSF expression in lymphocytes from patients with spondyloarthritis. Nature Communation. 8 (1), 1510(2017).
  10. Wicks, I. P., Roberts, A. W. Targeting GM-CSF in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 12 (1), 37-48 (2016).
  11. Scheinman, P. L., et al. Contact dermatitis. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 38(2021).
  12. Pesonen, M., Koskela, K., Aalto-Korte, K. Contact urticaria and protein contact dermatitis in the Finnish Register of Occupational Diseases in a period of 12 years. Contact Dermatitis. 83 (1), 1-7 (2020).
  13. Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
  14. Gaspari, A. A., Katz, S. I., Martin, S. F. Contact hypersensitivity. Current Protocols in Immunology. 113, 1-7 (2016).
  15. Manresa, M. C. Animal models of contact dermatitis: 2,4-dinitrofluorobenzene-induced contact hypersensitivity. Methods in Molecular Biology. 2223, 87-100 (2021).
  16. Kim, J. H., et al. CD1a on Langerhans cells controls inflammatory skin disease. Nature Immunology. 17 (10), 1159-1166 (2016).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Achuthan, A., et al. Cytokine-induced acute inflammatory monoarticular arthritis. Methods in Molecular Biology. 1784, 215-223 (2018).
  19. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  20. Kruisbeek, A. M., Shevach, E., Thornton, A. M. Proliferative assays for T cell function. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3 (2004).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

2 4 CD4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved