Análise de células T auxiliares produtoras de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos em um modelo de camundongo de hipersensibilidade de contato

Resumo

Aqui, apresentamos um método simples e padronizado de análise do subconjunto T helper produtor de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos in vivo.

Resumo

Paralelamente às linhagens tradicionais Th1 / Th2 / Th17 / Treg, as células T auxiliares produtoras de fator estimulador de colônias (Th-GM) de granulócitos-macrófagos foram identificadas como um subconjunto distinto de células T auxiliares (GM-CSF ⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^- células T CD4 ⁺ efetoras) em humanos e camundongos. A hipersensibilidade de contato (HSC) é considerada um excelente modelo animal para dermatite alérgica de contato (DAC) em humanos, manifestando uma resposta imune intacta mediada por células T. Para fornecer um ensaio padronizado e abrangente para analisar o subconjunto de células Th-GM na resposta imune dependente de células T in vivo, um modelo murino de CHS foi induzido por sensibilização / desafio com um hapteno orgânico reativo, de baixo peso molecular, 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNFB). A subpopulação Th-GM em células T CD4⁺ efetoras geradas após a imunização com o hapteno foi analisada por citometria de fluxo. Descobrimos que o Th-GM foi expandido principalmente em lesões e linfonodos de drenagem no modelo de camundongo CHS induzido por DNFB. Este método pode ser aplicado para estudar mais a biologia das células Th-GM e a pesquisa farmacológica de estratégias terapêuticas centradas no GM-CSF em várias condições, como a DAC.

Introdução

As células T auxiliares produtoras de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) - o subconjunto Th-GM - têm emergido como um subconjunto distinto de células T auxiliares em humanos e camundongos e são consideradas como compreendendo "GM-CSF expressando apenas" (GM-CSF ⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^-) células T CD4 identificadas por análise de RNA de célula única, citometria de massa e camundongos mapeadores de destino GM-CSF ^1,2,3. Em 2014, Sheng et al. relataram transdutor de sinal e ativador da programação da transcrição 5 (STAT5) do subconjunto Th-GM e conceituaram o subconjunto "Th-GM" pela primeira vez ^4,5. As células Th-GM são caracterizadas pela expressão de citocinas de GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 e receptores de quimiocinas C-X-C tipo de receptor de quimiocina (CXCR) 4 ou CXCR6 ^1,2. STAT e/ou a via NF-κB são essenciais para a diferenciação da linhagem Th-GM. Um método in vitro foi estabelecido para diferenciar células T CD4 virgens em células Th-GM usando IL-7 na presença de estímulos TCR⁶. Enquanto isso, as citocinas IL-23 e IL-1β demonstraram manter a expressão e a patogenicidade das células Th-GM ex vivo ^3,7.

A elevação de células Th-GM tem sido associada a várias doenças autoimunes, como esclerose múltipla e artrite reumatoide ^2,8,9, sugerindo um papel potencial na patogênese da autoimunidade¹⁰. Evidências acumuladas sugerem que o GM-CSF pode funcionar como um mediador inflamatório. Camundongos que superexpressam geneticamente Csf2 (gene que codifica GM-CSF) em células T CD4 ⁺ desenvolveram espontaneamente déficits neurológicos acompanhados pela infiltração de fagócitos no sistema nervoso central. Em um modelo de colite de transferência de células T, a transferência adotiva de células T Csf2^−/− para camundongos Rag1^−/− reduziu significativamente as características clínicas e histopatológicas da doença. No entanto, há poucos relatos dos papéis do subgrupo Th-GM em doenças alérgicas, como a DAC.

A LAC está entre as condições dermatológicas inflamatórias mais comuns, com alta prevalência no ambiente de trabalho e de vida^11,12. É uma resposta de hipersensibilidade do tipo IV retardada mediada por um circuito imunológico intacto que se desenvolve em duas fases temporalmente segmentadas: sensibilização e elicitação. A DAC humana é desencadeada pela exposição a alguns produtos químicos (haptenos ou metais) que levam à sensibilização. Durante esta fase, uma resposta mediada por células T é preparada por complexos hapteno-proteína apresentados por células apresentadoras de antígenos. Após a exposição subsequente ao mesmo hapteno, as células T efetoras e de memória específicas do hapteno são reativadas e localizadas na pele, um processo que envolve a infiltração de uma variedade de populações de células imunes. Essa resposta inflamatória aguda é conhecida como elicitação, resultando no desenvolvimento completo das lesões¹³. A DAC humana pode ser estudada usando modelos animais de hipersensibilidade de contato (HSC)¹⁴.

O modelo CHS induzido por um hapteno orgânico reativo, de baixo peso molecular, 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNFB), é um modelo murino comumente usado que tem sido utilizado no estudo da patologia, bem como em potenciais intervenções terapêuticas da DAC^15,16. Assim, este modelo dependente de células T pode ser aplicado para estudar a geração do subconjunto Th-GM em doenças alérgicas. Aqui, induzimos um modelo murino de CHS com DNFB, analisamos a geração de Th-GM em lesões e linfonodos de drenagem e descobrimos que o subconjunto Th-GM foi expandido principalmente após a reexposição ao mesmo hapteno. Isso sugere que o subconjunto Th-GM pode ser essencial para o desenvolvimento de ACD e representa um alvo terapêutico específico na ACD.

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Protocolo

Todos os camundongos utilizados neste protocolo estavam no fundo genético C57BL / 6, mantidos em condições específicas livres de patógenos e fornecidos com comida e água ad libitum. Todos os experimentos foram aprovados pelo órgão de revisão ética do bem-estar animal do West China Medical Center, da Universidade de Sichuan (20210302059).

1. Preparação de reagentes e materiais

1. Solução de DNFB a 0,5% como sensibilizador
   1. Para sensibilização de 10 camundongos, prepare 1,1 mL de acetona / azeite de oliva 4: 1 (v / v) mistura: misturando 880 μL de acetona e 220 μL de azeite de oliva para permitir 0,1 mL de excesso de volume para compensar quaisquer pequenas perdas de volume. Adicione 5 μL de DNFB a 1,1 mL de mistura homogeneizada de acetona / azeite de oliva 4: 1.
      NOTA: Prepare na hora no dia da sensibilização. A mistura de acetona e azeite deve ser preparada em uma capela de exaustão.
2. Solução DNFB de 0,2% como desafiante
   1. Para desafiar 10 camundongos, adicione 0,5 μL de DNFB em 0,25 mL de uma mistura homogeneizada de acetona / azeite de oliva 4: 1 descrita na etapa 1.1. Use a mistura de acetona / azeite de oliva 4: 1 como veículo ao desafiar os camundongos após a sensibilização.
      NOTA: A mistura de acetona e azeite deve ser preparada em uma hotte.
3. Hidrato de cloral como anestésico
   1. Dissolva 4 g de hidrato de cloral em 50 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para fazer uma solução de trabalho a 8%. Filtrar e conservar a 4 °C até 3 meses. Use 5 μL por g de peso corporal para um camundongo.
4. 50x estoque de colagenase IV
   1. Dissolva 100 mg de colagenase IV em 1 mL de meio básico de RPMI 1640 (não suplementado com antibióticos ou soro fetal bovino [FBS]) para fazer um estoque de 100 mg / mL. Conservar a -20 °C em alíquotas de 100 μL até 6 meses.
5. 1.000x DNase I estoque
   1. Dissolva 5 mg de DNase I em 1 mL de NaCl 0,15 M para fazer um estoque de 5 mg / mL. Conservar a -20 °C em alíquotas de 100 μL até 6 meses.
6. Parar buffer
   1. Dissolva 1,681 g de EDTA em 50 mL de meio RPMI 1640 básico para fazer um estoque de 100 mM. Conservar a 4 °C até 2 semanas.
7. Lavagem média
   1. Dissolva 0,372 g de EDTA a uma concentração final de 2 mM e 5 mL de FBS a uma concentração final de 1% com 500 mL de PBS. Filtrar e conservar a 4 °C até 1 mês.
8. Tampão de coloração
   1. Dissolva 0,372 g de EDTA até uma concentração final de 2 mM e 10 mL de FBS até uma concentração final de 2% com 500 mL de PBS. Filtrar e conservar a 4 °C até 1 mês.
9. Reagentes de reestimulação
   1. Dissolva 1 mg de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) em 20 mL de DMSO para fazer um estoque de 50 μg / mL (500x) e armazene-o a -20 ° C em alíquotas de 50 μL.
   2. Diluir 250 μL de ionomicina em solução (4 mg / mL) em 7,75 mL de DMSO para fazer um estoque de 500 μg / mL (500x) e armazená-lo a -20 ° C em alíquotas de 50 μL.
   3. Alíquota de 1 ml de solução inibidora do transporte de proteínas (contendo brefeldina A) em 50 μL e conservar as alíquotas a 4 °C.

2. Indução de CHS em camundongos

1. No dia -5, anestesiar os camundongos injetando 400 mg / kg de hidrato de cloral por via intraperitoneal.
2. Usando um barbeador para animais de estimação, raspe uma área de 2 cm × 2 cm no abdômen do rato.
   NOTA: Evite arranhar a pele do mouse; Mantenha intacta a integridade da barreira cutânea.
3. Esfregue 100 μL de solução de DNFB a 0,5% no abdômen raspado de maneira suave e uniforme com uma micropipeta com pontas descartáveis. Segure os ratos por 5 a 10 s para permitir que parte do solvente evapore.
4. No dia -4, repita as etapas 2.1-2.3 para outra sensibilização.
   NOTA: Dois eventos de sensibilização funcionam melhor do que um.
5. No dia 0, desafie a orelha direita dos camundongos com 20 μL de DNFB a 0,2% usando um micropipetador com pontas descartáveis e trate a orelha esquerda com o mesmo volume de mistura de acetona / azeite 4: 1 que o veículo.
   NOTA: Desafie os lados dorsal e ventral da orelha com volumes iguais de DNFB ou veículo.
6. Nos próximos 3 dias, meça a espessura da orelha direita e esquerda dos camundongos diariamente usando um medidor de espessura do mostrador e calcule o aumento na espessura da orelha: espessura da orelha direita - espessura da orelha esquerda.
   NOTA: Um aumento gradual na espessura da orelha pode ser observado em orelhas de camundongo desafiadas com DNFB a 0,2% em comparação com orelhas tratadas com veículo.

3. Coleta de amostras de camundongos CHS

1. No dia 3, anestesiar os camundongos com uma injeção intraperitoneal de 400 mg / kg de hidrato de cloral. Aguarde de 5 a 10 minutos para que o mouse fique em estado de inconsciência e belisque suavemente os dedos dos pés em ambas as patas traseiras para confirmar que os ratos estão profundamente anestesiados.
2. Tire uma foto de cada orelha por mouse usando uma câmera. Marque a incrustação (descamação na orelha) e vermelhidão da orelha (eritema na orelha) de forma independente para avaliar a gravidade da inflamação em uma escala de 0 a 5: 0, nenhuma; 1, leve; 2, moderado; 3, marcado; 4, muito marcado; 5, mais grave.
3. Eutanasiar o camundongo por luxação cervical. Corte toda a orelha e disseque os gânglios linfáticos de drenagem paralela dos camundongos usando tesouras e pinças afiadas estéreis. Coloque os tecidos em um poço de uma placa de 6 poços colocada no gelo contendo 5 mL de PBS pré-resfriado para dissociação enzimática ou física para gerar suspensões unicelulares (Figura Suplementar S1A e Figura Suplementar S2A).
4. Para análise histológica, fixar os espécimes auriculares em paraformaldeído a 4%, desidratar e embuti-los em parafina para coloração imuno-histoquímica, conforme descrito em outro artigo¹⁷.

4. Preparação da suspensão unicelular das orelhas

1. Divida os lados ventral e dorsal da orelha beliscando e rasgando as extremidades cortadas com duas pinças curvas (Figura Suplementar S1B). Coloque-os em um poço de uma placa de 6 poços contendo 4,5 mL de tampão de digestão, garantindo que esses tecidos estejam completamente imersos no tampão de digestão (Figura Suplementar S1C).
   NOTA: O tampão de digestão foi composto por RPMI 1640 contendo 10% de FBS + 25 mM de HEPES + 2 mg/mL de colagenase IV + 5 μg/mL de DNase I.
2. Incubar os folhetos auriculares em uma incubadora de cultura de células a 37 °C por 20 min. Corte os folhetos auriculares com uma tesoura o menor possível para facilitar a digestão do tecido (Figura Suplementar S1D) e coloque a amostra de volta na incubadora por mais 40 minutos.
   NOTA: A digestão eficiente pode ser alcançada em 40-50 min. A superdigestão a 37 °C afeta a viabilidade celular.
3. Adicione 0,5 mL de tampão de parada por poço para neutralizar as atividades enzimáticas da colagenase IV e DNase I. Execute as próximas etapas no gelo.
4. Transfira os fragmentos de tecido da orelha com um par de pinças curvas para um tubo de centrífuga de 50 mL contendo um filtro de células de 70 μm e pipete todo o volume do meio para o mesmo filtro de células.
5. Rompa os tecidos usando a extremidade superior de um êmbolo de seringa de 1 mL. Pressione em movimento circular contra o filtro de células de 70 μm até que apenas os tecidos conjuntivos brancos permaneçam (Figura Suplementar S1D).
6. Enxágue os filtros das células duas vezes com 1.000 μL de meio de lavagem. Transfira todo o volume do poço para um tubo de centrífuga de 50 mL através de um filtro de células de 40 μm. Mantenha o tubo no gelo.

5. Preparação de suspensões unicelulares de linfonodos drenantes (dLNs)

1. Transfira os gânglios linfáticos com um par de pinças curvas para um filtro de células de 70 μm em cima do poço de uma placa de 6 poços (Figura Suplementar S2B). Dissocie os gânglios linfáticos usando a extremidade superior de um êmbolo de seringa de 1 mL. Pressione os movimentos circulares contra o filtro de células de 70 μm até que restem apenas detritos brancos (Figura Suplementar S2C).
2. Enxágue o filtro de células duas vezes com 1.000 μL de meio de lavagem. Transfira todo o volume do poço para um tubo de 5 mL. Mantenha os tubos no gelo.

6. Reestimulação do subgrupo Th-GM com 12-miristato 13-acetato (PMA)/ionomicina na presença de um inibidor do transporte de proteínas

1. Centrifugar as células isoladas do ouvido e as amostras de linfonodos drenantes durante 8 min a 400 × g a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet com 1.000 μL de meio de lavagem suavemente.
2. Colete uma pequena porção de cada amostra para contar o número total de células derivadas do ouvido e do linfonodo de drenagem usando um hemocitômetro. Adicione 0,04% de azul de tripano para medir a viabilidade celular.
   NOTA: A viabilidade celular deve ser superior a 60% para estimulação e análise subsequentes de células T. A densidade celular pode ser de 1-5 × 10⁶/mL.
3. Centrifugar as células na etapa 6.1 e descartar o sobrenadante. Ressuspenda suavemente o pellet com 1.000 μL de meio RPMI 1640 contendo 2% de FBS e semeie 1 mL da suspensão de célula única (10⁶ células/mL) em placas de cultura de tecidos de fundo plano de 12 poços.
4. Adicione 2 μL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (concentração final de 100 ng/mL), 2 μL de ionomicina (concentração final de 1.000 ng/mL) e 1 μL de inibidor de transporte de proteínas (contendo Brefeldina A) a cada poço na placa de 12 poços contendo 1 mL da suspensão de célula única acima e incube a 37 °C por 4 h.

7. Análise de subconjuntos de Th-GM gerados in vivo por superfície celular e coloração intracelular

1. Transfira as células estimuladas para tubos de centrífuga de 1,5 mL usando uma pipeta. Centrifugue os tubos da centrífuga por 8 min a 400 × g à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
2. Lave o pellet celular uma vez com 1 mL de tampão de coloração e aplique um pellet nas células por centrifugação, conforme descrito na etapa 7.1. Ressuspenda as células em 1-10 × 10⁶ / mL em 0,5 mL de tampão de coloração.
3. Adicione 0,5 μL de solução estoque de corante de viabilidade (consulte a Tabela de Materiais) a 0,5 mL de suspensão celular e vórtice imediatamente. Incube a mistura por 10 min em temperatura ambiente no escuro. Lave as células duas vezes com 1 mL de tampão de coloração e repita a centrifugação na etapa 7.1 para pellet as células.
4. Ressuspenda o pellet em 0,1 mL de tampão de coloração. Adicione 1 μL de anticorpo anti-CD4 (conjugado com FITC), 1 μL de anticorpo anti-CD44 (conjugado com APC) e 1 μL de anticorpo anti-CD62L (conjugado com PE/cianina7) a três alíquotas de 0,1 mL da suspensão celular. Vortex imediatamente e incubar em temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.
5. Repita as lavagens e centrifugação na etapa 7.3.
6. Ressuspenda o pellet em 200 μL de tampão de fixação de IC e incube por 20 min no escuro. Enquanto isso, prepare o tampão de permeabilização (1x) diluindo 1 parte do tampão de permeabilização (10x) com 9 partes de água destilada. Lave as células duas vezes com 1 mL de tampão de permeabilização (1x) por centrifugação a 600 × g por 5 min em temperatura ambiente.
7. Ressuspenda o pellet em 0,1 mL de tampão de permeabilização (1x) com anticorpos contra GM-CSF (conjugado com PE, 1 μL / teste), IFN-γ (conjugado com BV711, 1 μL / teste), IL-17A (conjugado com BV421, 1 μL / teste) e IL-22 (conjugado com PerCP / Cianina5,5, 5 μL / teste) e incube por 30 min em temperatura ambiente no escuro.
8. Repita as lavagens e centrifugação na etapa 7.6.
9. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de PBS e transfira a suspensão para um tubo de ensaio de fundo redondo. Execute as células coradas em um citômetro de fluxo.

8. Estratégia de bloqueio para identificar o subconjunto Th-GM

1. Analise os dados de citometria de fluxo (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o software usado) usando a estratégia de gating ilustrada na Figura Suplementar S1. Para o software usado aqui, faça o download e configure-o no computador.
2. Importe os dados de citometria de fluxo clicando em Arquivo |Aberto | Importe arquivos FCS para o software e anote o grupo e o nome de cada exemplo selecionando a guia Renomear .
3. Escolha os linfócitos em um gráfico FSC versus SSC (FSC ^baixo SSC ^baixo, P1) para excluir detritos encontrados no canto inferior esquerdo e células mieloides com tamanho grande e alta granularidade clicando no gráfico de densidade e mostre o eixo X desse gráfico como FSC-A e o eixo Y como SSC-A.
4. Clique duas vezes nos eventos em P1 para gerar outro gráfico de densidade e separe as células individuais (mostradas como uma linha correlacionada, P2) dos agregados de células selecionando a altura e a área da célula neste gráfico (eixo X como FSC-A versus eixo Y como FSC-H).
5. Clique duas vezes nos eventos em P2 para gerar outro gráfico de densidade e mostre o eixo X desse gráfico como FSC-A e o eixo Y como SSC-A. Bloqueie as populações de células viáveis usando eventos FVS 780^- (P3).
6. Clique duas vezes nos eventos em P3 para gerar o próximo gráfico de densidade (o eixo X como CD4-A e o eixo Y como SSC-A) e distinga as células T CD4 escolhendo a população CD4⁺ (P4).
7. Clique duas vezes nos eventos em P4 para gerar outro gráfico de densidade (o eixo X como CD44-A e o eixo Y como CD62L-A) e defina as células auxiliares T efetoras escolhendo a população superior direita deste gráfico (CD62L-CD44⁺, P5).

9. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas, comparando dois grupos usando um teste t não pareado. *P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 e **** P < 0,0001 (média ± DP).

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Resultados

CHS (hipersensibilidade de contato) induzida por DNFB em camundongos
Para induzir CHS em camundongos, os camundongos foram sensibilizados e desafiados com DNFB aplicado na pele da orelha, conforme ilustrado na Figura 1A. A espessura da orelha, um indicador de espongiose epidérmica, aumentou acentuadamente em camundongos desafiados com DNFB em comparação com camundongos tratados com veículo (Figura 1B, 70 ...

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Discussão

Este protocolo fornece um ensaio in vivo simples para analisar a geração e expansão do subconjunto de células Th-GM. É essencial utilizar um modelo de doença mediada por células T em camundongos iniciados por haptenos ou antígenos, imitando essa ativação em humanos. O DNFB é um hapteno de molécula pequena que é mais econômico e economiza tempo do que os antígenos peptídicos ou proteicos para desencadear a resposta imune das células T in vivo

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dinitrofluorobenzene	BT REAGENT	P0001746	CAS NO: 70-34-8
Acetone	CHRON CHEMICALS	/	67-64-1
anti-CD4 antibody	Biolegend	300506	1:100 Diluted
anti-CD44 antibody	Biolegend	103012	1:100 Diluted
anti-CD62L antibody	Biolegend	104417	1:100 Diluted
anti-GM-CSF antibody	BD Bioscience	554507	1:100 Diluted
anti-IFN-γ antibody	Biolegend	505836	1:100 Diluted
anti-IL-17A antibody	BD Bioscience	563354	1:100 Diluted
anti-IL-22 antibody	Biolegend	516411	5 µL/test
CD45	Biolegend	103101	1:200 Diluted
Chloral hydrate	CHRON CHEMICALS	/	302-17-0
Dial thickness gauge (0.01 mm type)	PEACOCK	G-1A	/
DMSO	LIFESCIENCES	D8371	67-68-5
EDTA Na2	Solarbio	E8030	6381-92-6
F4/80	Biolegend	123102	1:200 Diluted
Fixable Viability Stain 780	BD Bioscience	565388	1:1,000 Diluted, viability dye
Flow cytometer	BD Bioscience	BD FACS ARIA II SORP	/
GraphPad Prism	GraphPad Software	Prism 7	Software for statistics and graphing
Intracelluar Fixtation and Permeablization Buffer Set	Thermo Fisher	88-8824-00	prepared freshly
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407951	CAS NO: 56092-81-0
Ly6G	Biolegend	127602	1:200 Dilutied
NovoExpress	Agilent	/	Software for flow cytometry data analysis; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Olive oil	YUANYE BIO	S30503	8001-25-0
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	CAS NO: 16561-29-8
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Bioscience	555029	1 µL/mL