Análisis de células T colaboradoras productoras de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos en un modelo murino de hipersensibilidad de contacto

Resumen

Aquí, presentamos un método simple y estandarizado para analizar el subconjunto de T auxiliar productor de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos in vivo.

Resumen

Paralelamente a los linajes tradicionales Th1/Th2/Th17/Treg, se han identificado células T auxiliares productoras de factor estimulante de colonias (Th-GM) de granulocitos y macrófagos como un subconjunto distinto de células T auxiliares (GM-CSF⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^- células T efectoras CD4⁺ ) en humanos y ratones. La hipersensibilidad de contacto (CHS) se considera un excelente modelo animal para la dermatitis alérgica de contacto (ACD) en humanos, que manifiesta una respuesta inmunitaria intacta mediada por células T. Con el fin de proporcionar un ensayo estandarizado y completo para analizar el subconjunto de células Th-GM en la respuesta inmunitaria dependiente de células T in vivo, se indujo un modelo murino de CHS mediante sensibilización/desafío con un hapteno orgánico reactivo, de bajo peso molecular, 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB). El subconjunto Th-GM en linfocitos T CD4⁺ efectores generados tras la inmunización con el hapteno se analizó mediante citometría de flujo. Encontramos que Th-GM se expandió principalmente en lesiones y ganglios linfáticos drenantes en el modelo de ratón CHS inducido por DNFB. Este método se puede aplicar para estudiar más a fondo la biología de las células Th-GM y la investigación farmacológica de estrategias terapéuticas centradas en GM-CSF en diversas condiciones, como la ACD.

Introducción

Las células T auxiliares productoras de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), el subconjunto Th-GM, han estado emergiendo como un subconjunto distinto de células T auxiliares en humanos y ratones y se considera que comprenden células T CD4 "que solo expresan GM-CSF" (GM-CSF⁺ IFN-γ-17A^- IL-22^-) identificadas por análisis de ARN de una sola célula, citometría de masas y ratones mapeadores de destino GM-CSF ^1,2,3. En 2014, Sheng et al. informaron sobre la programación del transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5) del subconjunto Th-GM y conceptualizaron el subconjunto "Th-GM" por primera vez ^4,5. Las células Th-GM se caracterizan por la expresión de citocinas de GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 y receptores de quimiocinas C-X-C tipo de receptor de quimiocinas (CXCR) 4 o CXCR6 ^1,2. STAT y/o la vía NF-κB son esenciales para la diferenciación del linaje Th-GM. Se estableció un método in vitro para diferenciar linfocitos T CD4 naïve en linfocitos Th-GM utilizando IL-7 en presencia de estímulos TCR⁶. Por su parte, se demostró que las citocinas IL-23 e IL-1β mantienen la expresión y patogenicidad de las células Th-GM ex vivo ^3,7.

La elevación de las células Th-GM se ha asociado con varias enfermedades autoinmunes, como la esclerosis múltiple y la artritis reumatoide ^2,8,9, lo que sugiere un papel potencial en la patogénesis de la autoinmunidad¹⁰. La evidencia acumulada sugiere que el GM-CSF puede funcionar como un mediador inflamatorio. Los ratones que sobreexpresan genéticamente Csf2 (gen que codifica GM-CSF) en células T CD4⁺ desarrollaron espontáneamente déficits neurológicos acompañados de la infiltración de fagocitos en el sistema nervioso central. En un modelo de colitis por transferencia de células T, la transferencia adoptiva de células T Csf2^−/− a ratones Rag1^−/− redujo significativamente las características clínicas e histopatológicas de la enfermedad. Sin embargo, hay pocos informes sobre las funciones del subconjunto Th-GM en enfermedades alérgicas, como la ACD.

La ACD es una de las afecciones dermatológicas inflamatorias más comunes, con alta prevalencia en el trabajo y en la vida^{personal 11,12}. Es una respuesta de hipersensibilidad de tipo IV retardada mediada por un circuito inmune intacto que se desarrolla en dos fases segmentadas temporalmente: sensibilización y elicitación. La ACD humana se desencadena por la exposición a algunas sustancias químicas (haptenos o metales) que conducen a la sensibilización. Durante esta fase, una respuesta mediada por células T es preparada por complejos de proteínas haptenos presentados por células presentadoras de antígenos. Tras la exposición posterior al mismo hapteno, las células T efectoras y de memoria específicas del hapteno se reactivan y se localizan en la piel, un proceso que implica la infiltración de una variedad de poblaciones de células inmunitarias. Esta respuesta inflamatoria aguda se conoce como elicitación, resultando en el desarrollo completo de lesiones¹³. La ACD humana puede estudiarse utilizando modelos animales de hipersensibilidad de contacto (CHS)¹⁴.

El modelo CHS inducido por un hapteno orgánico reactivo, de bajo peso molecular, 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB), es un modelo murino comúnmente utilizado que se ha utilizado en el estudio de la patología, así como en las posibles intervenciones terapéuticas de ACD^15,16. Por lo tanto, este modelo dependiente de células T podría aplicarse para estudiar la generación del subconjunto Th-GM en la enfermedad alérgica. Aquí, inducimos un modelo murino de CHS con DNFB, analizamos la generación de Th-GM en lesiones y ganglios linfáticos drenantes, y encontramos que el subconjunto de Th-GM se expandió principalmente tras la reexposición al mismo hapteno. Esto sugiere que el subconjunto Th-GM podría ser esencial para el desarrollo de la ACD y representa una diana terapéutica específica en la ACD.

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Protocolo

Todos los ratones utilizados en este protocolo tenían el fondo genético C57BL/6, se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos y se les proporcionó alimento y agua ad libitum. Todos los experimentos fueron aprobados por el organismo de revisión ética de bienestar animal del Centro Médico de China Occidental de la Universidad de Sichuan (20210302059).

1. Preparación de reactivos y materiales

1. Solución de DNFB al 0,5% como sensibilizador
   1. Para la sensibilización de 10 ratones, prepare 1,1 mL de mezcla de acetona/aceite de oliva 4:1 (v/v): mezcle 880 μL de acetona y 220 μL de aceite de oliva para permitir 0,1 mL de exceso de volumen para tener en cuenta cualquier pérdida de volumen menor. Añadir 5 μL de DNFB a 1,1 mL de mezcla homogeneizada de acetona/aceite de oliva 4:1.
      NOTA: Preparar fresco el día de la sensibilización. La mezcla de acetona y aceite de oliva debe prepararse en una campana extractora.
2. 0.2% Solución DNFB como retador
   1. Para desafiar a 10 ratones, agregue 0,5 μL de DNFB en 0,25 mL de una mezcla homogeneizada de acetona y aceite de oliva 4:1 descrita en el paso 1.1. Utilice la mezcla de acetona y aceite de oliva 4:1 como vehículo cuando desafíe a los ratones después de la sensibilización.
      NOTA: La mezcla de acetona y aceite de oliva debe prepararse en una campana extractora.
3. Hidrato de cloral como anestésico
   1. Disuelva 4 g de hidrato de cloral en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una solución de trabajo al 8%. Filtrar y almacenar a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Use 5 μL por g de peso corporal para un ratón.
4. 50x colagenasa IV
   1. Disolver 100 mg de colagenasa IV en 1 mL de medio RPMI 1640 básico (no suplementado con antibióticos o suero fetal bovino [FBS]) para hacer un caldo de 100 mg/mL. Almacenar a -20 °C en alícuotas de 100 μL durante un máximo de 6 meses.
5. 1.000x DNase I stock
   1. Disuelva 5 mg de DNasa I en 1 mL de NaCl 0,15 M para hacer un caldo de 5 mg/mL. Almacenar a -20 °C en alícuotas de 100 μL durante un máximo de 6 meses.
6. Búfer de parada
   1. Disuelva 1.681 g de EDTA en 50 mL de medio RPMI 1640 básico para hacer un caldo de 100 mM. Almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
7. Medio de lavado
   1. Disuelva 0,372 g de EDTA a una concentración final de 2 mM y 5 mL de FBS a una concentración final de 1% con 500 mL de PBS. Filtrar y almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
8. Tampón de tinción
   1. Disuelva 0,372 g de EDTA a una concentración final de 2 mM y 10 mL de FBS a una concentración final del 2% con 500 mL de PBS. Filtrar y almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
9. Reactivos de reestimulación
   1. Disuelva 1 mg de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) en 20 mL de DMSO para hacer un caldo de 50 μg/mL (500x) y guárdelo a -20 °C en alícuotas de 50 μL.
   2. Diluir 250 μL de ionomicina en solución (4 mg/mL) en 7,75 mL de DMSO para hacer un caldo de 500 μg/mL (500x) y almacenarlo a -20 °C en alícuotas de 50 μL.
   3. Alícuota 1 mL de solución inhibidora del transporte de proteínas (que contiene brefeldina A) en 50 μL y almacenar las alícuotas a 4 °C.

2. Inducción de CHS en ratones

1. En el día -5, anestesiar a los ratones inyectando 400 mg/kg de hidrato de cloral por vía intraperitoneal.
2. Con una afeitadora para mascotas, afeita un área de 2 cm × 2 cm en el abdomen del ratón.
   NOTA: Evite rascar la piel del ratón; Mantener intacta la integridad de la barrera cutánea.
3. Untar 100 μL de solución de DNFB al 0,5% sobre el abdomen afeitado de forma suave y uniforme con una micropipeta con puntas desechables. Sostenga los ratones de 5 a 10 segundos para permitir que se evapore parte del solvente.
4. En el día -4, repita los pasos 2.1-2.3 para otra sensibilización.
   NOTA: Dos eventos de sensibilización funcionan mejor que uno.
5. El día 0, desafíe el oído derecho de los ratones con 20 μL de DNFB al 0,2% utilizando una micropipeta con puntas desechables, y trate el oído izquierdo con el mismo volumen de mezcla de acetona y aceite de oliva 4:1 que el vehículo.
   NOTA: Desafíe los lados dorsal y ventral de la oreja con volúmenes iguales de DNFB o vehículo.
6. En los próximos 3 días, mida diariamente el grosor de la oreja de los ratones derecho e izquierdo con un medidor de grosor de cuadrante y calcule el aumento del grosor de la oreja: grosor de la oreja derecha - grosor de la oreja izquierda.
   NOTA: Se pudo observar un aumento gradual en el grosor de la oreja en las orejas de ratón desafiadas con DNFB en comparación con las orejas tratadas con vehículo.

3. Recogida de muestras de ratones CHS

1. El día 3, anestesiar a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de 400 mg/kg de hidrato de cloral. Espere de 5 a 10 minutos para que el ratón esté en un estado de inconsciencia y realice un suave pellizco en los dedos de los pies en ambas patas traseras para confirmar que los ratones están profundamente anestesiados.
2. Tome una foto de cada oreja por ratón con una cámara. Puntuar la incrustación (descamación en la oreja) y el enrojecimiento de la oreja (eritema en la oreja) de forma independiente para evaluar la gravedad de la inflamación en una escala de 0 a 5: 0, ninguna; 1, leve; 2, moderado; 3, marcado; 4, muy marcado; 5, el más grave.
3. Eutanasia del ratón por luxación cervical. Corta toda la oreja y disecciona los ganglios linfáticos de drenaje paralelos de los ratones con tijeras y fórceps afiladas estériles. Coloque los tejidos en un pocillo de una placa de 6 pocillos colocada sobre hielo que contenga 5 mL de PBS preenfriado para la disociación enzimática o física para generar suspensiones unicelulares (Figura Suplementaria S1A y Figura Suplementaria S2A).
4. Para el análisis histológico, fije las muestras de oreja en paraformaldehído al 4%, deshidratado, e insértelas en parafina para la tinción inmunohistoquímica, como se describe en otra parte¹⁷.

4. Preparación de la suspensión unicelular de las orejas

1. Divida los lados ventral y dorsal de la oreja pellizcando y rasgando los extremos cortados con dos pinzas curvas (Figura suplementaria S1B). Colóquelos en un pocillo de una placa de 6 pocillos que contenga 4,5 mL de tampón de digestión, asegurándose de que esos tejidos estén completamente sumergidos en el tampón de digestión (Figura suplementaria S1C).
   NOTA: El tampón de digestión estaba compuesto por RPMI 1640 que contenía 10% de FBS + 25 mM HEPES + 2 mg/mL de colagenasa IV + 5 μg/mL de DNasa I.
2. Incubar las valvas de la mazorca en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 20 min. Corte las valvas de la oreja con unas tijeras lo más pequeñas posible para facilitar la digestión del tejido (Figura suplementaria S1D) y vuelva a colocar la muestra en la incubadora durante otros 40 minutos.
   NOTA: La digestión eficiente se puede lograr en 40-50 minutos. La sobredigestión a 37 °C afecta a la viabilidad celular.
3. Añadir 0,5 mL de tampón de parada por pocillo para neutralizar las actividades enzimáticas de la colagenasa IV y la DNasa I. Realice los siguientes pasos en hielo.
4. Transfiera los fragmentos de tejido del oído con un par de pinzas curvas a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga un filtro de células de 70 μm y pipetee todo el volumen de medio en el mismo filtro de células.
5. Rompe los tejidos con el extremo superior de un émbolo de jeringa de 1 mL. Presione con movimientos circulares contra el filtro de células de 70 μm hasta que solo queden tejidos conectivos blancos (Figura suplementaria S1D).
6. Enjuague los filtros celulares dos veces con 1.000 μL de medio de lavado. Transfiera todo el volumen del pocillo a un tubo de centrífuga de 50 mL a través de un filtro de celdas de 40 μm. Mantenga el tubo en hielo.

5. Preparación de suspensiones unicelulares a partir de ganglios linfáticos drenantes (dLN)

1. Transfiera los ganglios linfáticos con un par de pinzas curvas a un filtro de células de 70 μm en la parte superior del pocillo de una placa de 6 pocillos (Figura complementaria S2B). Disocie los ganglios linfáticos con el extremo superior de un émbolo de jeringa de 1 ml. Presione con movimientos circulares contra el filtro de células de 70 μm hasta que solo queden restos blancos (Figura suplementaria S2C).
2. Enjuague el colador de células dos veces con 1.000 μL de medio de lavado. Transfiera todo el volumen del pocillo a un tubo de 5 mL. Mantenga los tubos en hielo.

6. Reestimulación del subconjunto Th-GM con 12-miristato 13-acetato (PMA)/ionomicina en presencia de un inhibidor del transporte de proteínas

1. Centrifugar las células aisladas del oído y las muestras de ganglios linfáticos drenantes durante 8 min a 400 × g a 4 °C, y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con 1.000 μL de medio de lavado suavemente.
2. Recoja una pequeña porción de cada muestra para contar el número total de células derivadas del oído y el ganglio linfático que drena con un hemocitómetro. Agregue 0.04% de azul de tripano para medir la viabilidad celular.
   NOTA: La viabilidad celular debe ser superior al 60% para la estimulación y el análisis posteriores de las células T. La densidad celular puede ser de 1-5 × 10⁶/mL.
3. Centrifugar las células en el paso 6.1 y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender suavemente el pellet con 1.000 μL de medio RPMI 1640 que contenga 2% de FBS, y siembre 1 mL de la suspensión unicelular (10⁶ células/mL) en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 12 pocillos.
4. Añadir 2 μL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (concentración final 100 ng/mL), 2 μL de ionomicina (concentración final 1.000 ng/mL) y 1 μL de inhibidor del transporte de proteínas (que contiene Brefeldina A) a cada pocillo en la placa de 12 pocillos que contiene 1 mL de la suspensión unicelular anterior e incubar a 37 °C durante 4 h.

7. Análisis de subconjuntos de Th-GM generados in vivo por tinción intracelular y de superficie celular

1. Transfiera las células estimuladas a tubos de centrífuga de 1,5 ml con una pipeta. Centrifugar los tubos de centrífuga durante 8 min a 400 × g a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
2. Lave el pellet de celdas una vez con 1 mL de tampón de tinción y granule las celdas por centrifugación, como se describe en el paso 7.1. Vuelva a suspender las células a 1-10 × 10⁶/mL en 0,5 mL de tampón de tinción.
3. Añada inmediatamente 0,5 μL de solución madre de colorante de viabilidad (véase la Tabla de Materiales) a 0,5 mL de suspensión celular y vórtice. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave las células dos veces con 1 ml de tampón de tinción y repita la centrifugación en el paso 7.1 para granular las células.
4. Vuelva a suspender el pellet en 0,1 ml de tampón de tinción. Agregue 1 μL de anticuerpo anti-CD4 (conjugado con FITC), 1 μL de anticuerpo anti-CD44 (conjugado con APC) y 1 μL de anticuerpo anti-CD62L (conjugado con PE/cianina 7) a tres alícuotas de 0,1 mL de la suspensión celular. Agite inmediatamente e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos, protegido de la luz.
5. Repita los lavados y la centrifugación en el paso 7.3.
6. Vuelva a suspender el pellet en 200 μL de tampón de fijación de IC e incube durante 20 minutos en la oscuridad. Mientras tanto, prepare el tampón de permeabilización (1x) diluyendo 1 parte del tampón de permeabilización (10x) con 9 partes de agua destilada. Lavar las células dos veces con 1 mL de tampón de permeabilización (1x) por centrifugación a 600 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
7. Vuelva a suspender el pellet en 0,1 mL de tampón de permeabilización (1x) con anticuerpos contra GM-CSF (conjugado con PE, 1 μL/prueba), IFN-γ (conjugado con BV711, 1 μL/prueba), IL-17A (conjugado con BV421, 1 μL/prueba) e IL-22 (PerCP/Cianina 5,5-conjugada, 5 μL/prueba) e incube durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
8. Repita los lavados y la centrifugación en el paso 7.6.
9. Vuelva a suspender el pellet de celda en 200 μL de PBS y transfiera la suspensión a un tubo de ensayo de fondo redondo. Ejecute las células teñidas en un citómetro de flujo.

8. Estrategia de compuerta para identificar el subconjunto Th-GM

1. Analice los datos de citometría de flujo (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el software utilizado) utilizando la estrategia de compuerta ilustrada en la Figura complementaria S1. Para el software utilizado aquí, descárguelo y configúrelo en la computadora.
2. Importe los datos de citometría de flujo haciendo clic en Archivo |Abierto | Importe archivos FCS en el software y anote el grupo y el nombre de cada muestra seleccionando la pestaña Cambiar nombre .
3. Elija los linfocitos en una gráfica FSC frente a SSC (FSC ^baja SSC ^baja, P1) para excluir los residuos que se encuentran en la esquina inferior izquierda y las células mieloides con gran tamaño y alta granularidad haciendo clic en la gráfica de densidad, y muestre el eje X de esta gráfica como FSC-A y el eje Y como SSC-A.
4. Haga doble clic en los eventos de P1 para generar otra gráfica de densidad y separe las celdas individuales (mostradas como una línea correlacionada, P2) de los agregados de celdas seleccionando la altura y el área de la celda en esta gráfica (eje X como FSC-A frente a eje Y como FSC-H).
5. Haga doble clic en los eventos de P2 para generar otra gráfica de densidad y muestre el eje X de esta gráfica como FSC-A y el eje Y como SSC-A. Controlar las poblaciones de células viables mediante eventos FVS 780^- (P3).
6. Haga doble clic en los eventos de P3 para generar la siguiente gráfica de densidad (el eje X como CD4-A y el eje Y como SSC-A) y distinga las células T CD4 eligiendo la población CD4⁺ (P4).
7. Haga doble clic en los eventos de P4 para generar otra gráfica de densidad (el eje X como CD44-A y el eje Y como CD62L-A) y defina las células auxiliares T efectoras eligiendo la población superior derecha de esta gráfica (CD62L^- CD44⁺, P5).

9. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos, comparando dos grupos utilizando una prueba t no apareada. *P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 y **** P < 0,0001 (media ± DE).

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Resultados

CHS (hipersensibilidad de contacto) inducida por DNFB en ratones
Para inducir CHS en ratones, los ratones fueron sensibilizados y desafiados con DNFB aplicado a la piel del oído, como se ilustra en la Figura 1A. El grosor de la oreja, un indicador de esponjosis epidérmica, aumentó notablemente en los ratones desafiados con DNFB en comparación con los ratones tratados con vehículos (Figura 1B, 70 frente a...

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Discusión

Este protocolo proporciona un ensayo in vivo simple para analizar la generación y expansión del subconjunto de células Th-GM. Es esencial utilizar un modelo de enfermedad mediada por células T en ratones iniciada por haptenos o antígenos, imitando esa activación en humanos. El DNFB es un hapteno de molécula pequeña que es más económico y ahorra más tiempo que los antígenos peptídicos o proteicos para desencadenar la respuesta inmunitaria de las células T in viv...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dinitrofluorobenzene	BT REAGENT	P0001746	CAS NO: 70-34-8
Acetone	CHRON CHEMICALS	/	67-64-1
anti-CD4 antibody	Biolegend	300506	1:100 Diluted
anti-CD44 antibody	Biolegend	103012	1:100 Diluted
anti-CD62L antibody	Biolegend	104417	1:100 Diluted
anti-GM-CSF antibody	BD Bioscience	554507	1:100 Diluted
anti-IFN-γ antibody	Biolegend	505836	1:100 Diluted
anti-IL-17A antibody	BD Bioscience	563354	1:100 Diluted
anti-IL-22 antibody	Biolegend	516411	5 µL/test
CD45	Biolegend	103101	1:200 Diluted
Chloral hydrate	CHRON CHEMICALS	/	302-17-0
Dial thickness gauge (0.01 mm type)	PEACOCK	G-1A	/
DMSO	LIFESCIENCES	D8371	67-68-5
EDTA Na2	Solarbio	E8030	6381-92-6
F4/80	Biolegend	123102	1:200 Diluted
Fixable Viability Stain 780	BD Bioscience	565388	1:1,000 Diluted, viability dye
Flow cytometer	BD Bioscience	BD FACS ARIA II SORP	/
GraphPad Prism	GraphPad Software	Prism 7	Software for statistics and graphing
Intracelluar Fixtation and Permeablization Buffer Set	Thermo Fisher	88-8824-00	prepared freshly
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407951	CAS NO: 56092-81-0
Ly6G	Biolegend	127602	1:200 Dilutied
NovoExpress	Agilent	/	Software for flow cytometry data analysis; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Olive oil	YUANYE BIO	S30503	8001-25-0
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	CAS NO: 16561-29-8
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Bioscience	555029	1 µL/mL