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요약

여기에서는 생체 내에서 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 생성 T 헬퍼 하위 집합을 분석하는 간단하고 표준화된 방법을 제시합니다.

초록

기존의 Th1/Th2/Th17/Treg 계통과 병행하여, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 생성 T 헬퍼(Th-GM) 세포는 인간과 마우스에서 T 헬퍼 세포(GM-CSF+ IFN-γ-IL-17A- IL-22- 효과기 CD4+ T 세포)의 뚜렷한 하위 집합으로 확인되었습니다. 접촉 과민증(CHS)은 인간의 알레르기 접촉 피부염(ACD)에 대한 우수한 동물 모델로 간주되며, 온전한 T 세포 매개 면역 반응을 나타냅니다. 생체 내에서 T 세포 의존성 면역 반응에서 Th-GM 세포 하위 집합을 분석하기 위한 표준화되고 포괄적인 분석을 제공하기 위해 반응성, 저분자량, 유기 합텐, 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB)을 사용한 감작/챌린지에 의해 쥐 CHS 모델을 유도했습니다. hapten을 사용한 면역 시 생성된 effector CD4+ T 세포의 Th-GM 하위 집합은 유세포 분석으로 분석되었습니다. 우리는 Th-GM이 DNFB에 의한 CHS 마우스 모델에서 주로 병변 및 배액 림프절에서 확장된다는 것을 발견했습니다. 이 방법은 ACD와 같은 다양한 조건에서 GM-CSF를 중심으로 한 Th-GM 세포의 생물학 및 치료 전략의 약리학적 연구를 추가로 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

서문

과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)-생산 T 도우미 세포-Th-GM 하위 집합-는 인간과 마우스에서 T 도우미 세포의 뚜렷한 하위 집합으로 부상하고 있으며 단일 세포 RNA 분석, 질량 세포 분석 및 GM-CSF 운명 매퍼 마우스 1,2,3에 의해 확인된 "GM-CSF+ IFN-γ-IL-17A- IL-22-) CD4 T 세포를 포함하는 것으로 간주됩니다. 2014년, Sheng 등은 Th-GM 서브셋의 신호 트랜스듀서 및 전사 5 활성화제(STAT5) 프로그래밍을 보고하고 처음으로 "Th-GM" 서브셋을 개념화했습니다 4,5. Th-GM 세포는 GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 및 케모카인 수용체 C-X-C 케모카인 수용체 유형(CXCR) 4 또는 CXCR6 1,2의 사이토카인 발현을 특징으로 합니다. STAT 및/또는 NF-κB 경로는 Th-GM 계통 분화에 필수적입니다. TCR 자극6이 존재하는 상태에서 IL-7을 사용하여 naive CD4 T cell을 Th-GM cell로 분화하기 위한 in vitro 방법이 확립되었습니다. 한편, 사이토카인 IL-23 및 IL-1β는 생체 외 3,7에서 Th-GM 세포의 발현 및 병원성을 유지하는 것으로 나타났습니다.

Th-GM 세포의 상승은 다발성 경화증 및 류마티스 관절염과 같은 여러 자가면역 질환과 관련이 있으며, 2,8,9 이는 자가면역의 발병기전에 잠재적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다10. 축적된 증거는 GM-CSF가 염증 매개체로 기능할 수 있음을 시사합니다. CD4+ T 세포에서 Csf2(GM-CSF를 암호화하는 유전자)를 유전적으로 과발현하는 마우스는 식세포가 중추 신경계로 침투하는 것을 동반한 신경학적 결손을 자발적으로 발생시켰습니다. T 세포 전이 대장염 모델에서, Csf2-/-T 세포를 Rag1-/-마우스 로의 이식은 질병의 임상적 및 조직병리학적 특징을 현저히 감소시켰다. 그러나 ACD와 같은 알레르기 질환에서 Th-GM 하위 집합의 역할에 대한 보고는 거의 없습니다.

ACD는 직장 및 생활 환경에서 유병률이 높은 가장 흔한 염증성 피부 질환 중 하나입니다11,12. 이는 온전한 면역 회로에 의해 매개되는 IV형 지연형 과민 반응으로, 시간적으로 분절된 두 가지 단계, 즉 감작(sensitization)과 유도(elicitation)로 발달합니다. 인체 ACD는 감작을 유발하는 일부 화학 물질(haptens 또는 금속)에 노출되어 유발됩니다. 이 단계에서 T 세포 매개 반응은 항원 제시 세포에 의해 제시된 합텐 단백질 복합체에 의해 준비됩니다. 동일한 합텐에 대한 후속 노출시, 합텐 특이적 효과기 및 기억 T 세포가 재활성화되고 피부에 국한되며, 이는 다양한 면역 세포 집단의 침투를 포함하는 과정입니다. 이러한 급성 염증 반응은 유도(elicitation)로 알려져 있으며, 그 결과 병변이 완전히 발달한다13. 인간 ACD는 접촉 과민증(CHS)의 동물 모델을 사용하여 연구할 수 있습니다14.

반응성, 저분자량, 유기 합텐, 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB)에 의해 유도된 CHS 모델은 ACD15,16의 병리학 및 잠재적 치료 개입 연구에 활용된 일반적으로 사용되는 쥐 모델입니다. 따라서 이 T 세포 의존성 모델은 알레르기 질환에서 Th-GM 하위 집합의 생성을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 여기서, DNFB로 CHS의 쥐 모델을 유도하고, 병변 및 배액 림프절에서 Th-GM의 생성을 분석하고, 동일한 hapten에 재노출되었을 때 Th-GM 하위 집합이 주로 확장되었음을 발견했습니다. 이는 Th-GM 하위 집합이 ACD 발달에 필수적일 수 있으며 ACD의 특정 치료 표적을 나타낼 수 있음을 시사합니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 사용된 모든 마우스는 C57BL/6 유전적 배경에 있었고, 특정 병원체가 없는 조건에서 유지되었으며, 임시로 음식과 물을 제공받았습니다. 모든 실험은 쓰촨성 대학교 중국 서부 의료 센터(West China Medical Center, 20210302059)의 동물 복지 윤리 검토 기관(Animal welfare ethical review body)의 승인을 받았다.

1. 시약 및 재료 준비

  1. 0.5% DNFB 용액을 감광제로 사용
    1. 10 마리의 마우스에 대한 감작을 위해 1.1mL의 아세톤/올리브 오일 4:1(v/v) 혼합물을 준비합니다: 880μL의 아세톤과 220μL의 올리브 오일을 혼합하여 0.1mL의 초과 부피가 경미한 부피 손실을 설명할 수 있도록 합니다. 5μL의 DNFB를 1.1mL의 균질화된 아세톤/올리브 오일 4:1 혼합물에 추가합니다.
      참고: 감작 당일에 신선하게 준비하십시오. 아세톤/올리브 오일 혼합물은 흄 후드에서 준비해야 합니다.
  2. 0.2% DNFB 솔루션을 챌린저로 사용
    1. 10마리의 마우스에 챌린지를 하려면 1.1단계에서 설명한 균질화된 아세톤/올리브 오일 4:1 혼합물 0.25mL에 0.5μL의 DNFB를 추가합니다. 아세톤/올리브 오일 4:1 혼합물을 감작 후 생쥐에게 도전할 때 매개체로 사용하십시오.
      알림: 아세톤/올리브 오일 혼합물은 흄 후드에서 준비해야 합니다.
  3. 마취제로서의 클로랄 수화물
    1. 클로랄 수화물 4g을 인산염 완충 식염수(PBS) 50mL에 녹여 8% 용액을 만듭니다. 여과하여 4°C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오. 마우스의 경우 체중 g당 5μL를 사용합니다.
  4. 50x 콜라겐분해효소 IV 스톡
    1. 100mg/mL 스톡을 만들기 위해 100mg의 콜라겐분해효소 IV를 염기성 RPMI 1640 배지(항생제 또는 소태아 혈청[FBS]가 보충되지 않음) 1mL에 용해시킵니다. -20 °C에서 100 μL 분취액에 최대 6개월 동안 보관하십시오.
  5. DNase I 재고 1,000개
    1. 5mg의 DNase I을 0.15M NaCl 1mL에 용해시켜 5mg/mL 스톡을 만듭니다. -20 °C에서 100 μL 분취액에 최대 6개월 동안 보관하십시오.
  6. 버퍼 중지
    1. 1.681g의 EDTA를 50mL의 염기성 RPMI 1640 배지에 용해시켜 100mM 스톡을 만듭니다. 4 °C에서 최대 2 주 동안 보관하십시오.
  7. 세척 매체
    1. 0.372g의 EDTA를 2mM의 최종 농도로 용해하고 5mL의 FBS를 500mL의 PBS로 1%의 최종 농도로 용해합니다. 여과하여 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
  8. 염색 완충액
    1. 0.372g의 EDTA를 2mM의 최종 농도로 용해하고 10mL의 FBS를 500mL의 PBS로 2%의 최종 농도로 용해합니다. 여과하여 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
  9. 재착취 시약
    1. 1mg의 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)를 DMSO 20mL에 용해시켜 50 μg/mL 스톡(500x)을 만들고 50 μL 분취액에 -20 °C에서 보관합니다.
    2. 용액(4mg/mL)에 포함된 이오노마이신 250μL를 DMSO 7.75mL에 희석하여 500μg/mL 스톡(500x)을 만들고 50μL 분취액에 -20°C에서 보관합니다.
    3. 단백질 수송 억제제 용액(브레펠딘 A 함유) 1mL를 50μL에 분취하고 4°C에서 부분 표본을 보관합니다.

2. 마우스에서 CHS 유도

  1. -5일째에는 400mg/kg의 클로랄 수화물을 복강내에 주입하여 마우스를 마취합니다.
  2. 애완동물 면도기를 사용하여 마우스 복부를 2cm × 2cm 면도합니다.
    알림: 마우스 피부를 긁지 마십시오. 피부 장벽의 무결성을 그대로 유지하십시오.
  3. 100μL의 0.5% DNFB 용액을 일회용 팁이 있는 마이크로피펫으로 면도한 복부에 부드럽고 고르게 문지릅니다. 쥐를 5-10초 동안 유지하여 일부 용매가 증발할 수 있도록 합니다.
  4. -4일차에 또 다른 감작을 위해 2.1-2.3단계를 반복합니다.
    참고: 두 개의 감작 이벤트가 하나보다 더 효과적입니다.
  5. 0일차에는 일회용 팁이 있는 마이크로파이펫터를 사용하여 마우스의 오른쪽 귀에 20μL의 0.2% DNFB를 투여하고 차량과 동일한 부피의 아세톤/올리브 오일 4:1 혼합물로 왼쪽 귀를 처리합니다.
    알림: 귀의 등쪽과 복부 쪽에 동일한 양의 DNFB 또는 차량으로 챌린지를 합니다.
  6. 앞으로 3 일 동안 다이얼 두께 게이지를 사용하여 매일 마우스의 오른쪽 귀와 왼쪽 귀의 귀 두께를 측정하고 귀 두께의 증가를 계산합니다 : 오른쪽 귀 두께-왼쪽 귀 두께.
    참고: 차량용으로 처리된 귀와 비교하여 0.2% DNFB 챌린지 마우스 귀에서 귀 두께의 점진적인 증가가 관찰될 수 있습니다.

3. CHS 마우스의 샘플 수집

  1. 3일차에는 400mg/kg 클로랄 하이드레이트의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 마우스가 의식 불명 상태가 될 때까지 5-10분 동안 기다렸다가 양쪽 뒷발을 부드럽게 꼬집어 마우스가 깊이 마취되었는지 확인합니다.
  2. 카메라를 사용하여 마우스당 각 귀의 사진을 찍습니다. 외피(귀에 비늘)와 귀의 발적(귀에 있는 홍반)을 독립적으로 점수화하여 0에서 5까지의 척도로 염증의 심각도를 평가합니다. 1, 약간; 2, 보통; 3, 표시; 4, 매우 현저한; 5, 가장 심각합니다.
  3. 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 귀 전체를 잘라내고 멸균되고 날카로운 가위와 집게를 사용하여 생쥐의 평행 배출 림프절을 절개합니다. 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 효소 또는 물리적 해리를 위해 5mL의 사전 냉각된 PBS가 들어 있는 얼음 위에 놓인 6웰 플레이트의 한 웰에 조직을 놓습니다(보충 그림 S1A 및 보충 그림 S2A).
  4. 조직학적 분석을 위해 귀 표본을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 탈수한 다음 다른 곳에서 설명한 바와 같이 면역조직화학적 염색을 위해 파라핀에 삽입하십시오17.

4. 귀에서 single-cell 현탁액의 준비

  1. 두 개의 구부러진 집게로 절단된 끝을 꼬집고 찢어 귀의 복부와 등쪽을 분리합니다(보충 그림 S1B). 4.5mL의 분해 완충액이 들어 있는 6웰 플레이트의 웰에 넣고 해당 조직이 분해 완충액에 완전히 잠기도록 합니다(보충 그림 S1C).
    참고: 분해 완충액은 10% FBS + 25mM HEPES + 2mg/mL 콜라겐분해효소 IV + 5μg/mL DNase I을 함유하는 RPMI 1640으로 구성되었습니다.
  2. 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 20분 동안 귀 첨판을 배양합니다. 조직 소화를 용이하게 하기 위해 가위로 귀 첨판을 가능한 한 작게 자르고(보충 그림 S1D) 검체를 다시 인큐베이터에 40분 더 넣습니다.
    참고: 효율적인 소화는 40-50분 이내에 이루어질 수 있습니다. 37°C에서 과소화는 세포 생존력에 영향을 미칩니다.
  3. 웰당 0.5mL의 스톱 버퍼를 추가하여 콜라겐분해효소 IV 및 DNase I의 효소 활성을 중화합니다. 얼음 위에서 다음 단계를 수행합니다.
  4. 한 쌍의 구부러진 집게가 있는 귀 조직 조각을 70μm 세포 여과기가 들어 있는 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 전체 부피의 배지를 동일한 세포 여과기에 피펫팅합니다.
  5. 1mL 주사기 플런저의 상단 끝을 사용하여 조직을 파괴합니다. 흰색 결합 조직만 남을 때까지 70μm 세포 스트레이너를 원을 그리며 누릅니다(보충 그림 S1D).
  6. 1,000μL의 세척 배지로 세포 여과기를 두 번 헹굽니다. 40μm 세포 여과기를 통해 웰의 전체 부피를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.

5. 림프절(dLN) 배출로 인한 단일 세포 현탁액 준비

  1. 한 쌍의 구부러진 집게로 림프절을 6-well plate의 well 위에 있는 70μm 세포 여과기로 옮깁니다(보충 그림 S2B). 1mL 주사기 플런저의 상단 끝을 사용하여 림프절을 분리합니다. 흰색 파편만 남을 때까지 70μm 세포 여과기에 대해 원을 그리며 누릅니다(보충 그림 S2C).
  2. 셀 여과기를 1,000μL의 세척 매체로 두 번 헹굽니다. 웰의 전체 부피를 5mL 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.

6. 단백질 수송 억제제의 존재 하에서 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)/이오노마이신을 사용한 Th-GM 부분 집합의 재복원

  1. 귀와 배출 림프절에서 분리된 세포를 4°C에서 400 × g 에서 8분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다. 펠릿을 1,000μL의 세척 매체로 부드럽게 재현탁합니다.
  2. 각 샘플의 작은 부분을 수집하여 혈구계를 사용하여 귀와 배출 림프절에서 유래한 세포의 총 수를 계산합니다. 0.04% 트리판 블루를 첨가하여 세포 생존율을 측정합니다.
    참고: 후속 T 세포 자극 및 분석을 위해 세포 생존율이 60% 이상이어야 합니다. 세포 밀도는 1-5 × 106/mL일 수 있습니다.
  3. 6.1단계에서 세포를 원심분리하고 상등액을 버립니다. 2% FBS가 포함된 1,000μL의 RPMI 1640 배지로 펠릿을 부드럽게 재현탁하고 12웰 평평한 바닥 조직 배양 플레이트에 단일 세포 현탁액(106 cells/mL) 1mL를 시딩합니다.
  4. 위의 단세포 현탁액 1mL가 포함된 12웰 플레이트의 각 웰에 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)(최종 농도 100ng/mL) 2μL, ionomycin(최종 농도 1,000ng/mL) 및 단백질 수송 억제제(Brefeldin A 함유) 1μL를 첨가하고 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.

7. 세포 표면 및 세포 내 염색에 의해 in vivo에서 생성된 Th-GM subsets 분석

  1. 피펫을 사용하여 자극된 세포를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리기 튜브를 실 온에서 8 ×g에서 400분간 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
  2. 1mL의 염색 완충액으로 세포 펠렛을 한 번 세척하고 7.1단계에 설명된 대로 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. 0.5mL의 염색 완충액에서 1-10× 10 6/mL로 세포를 재현탁합니다.
  3. 0.5μL의 생존도 염료 스톡 용액( 재료 표 참조)을 0.5mL의 세포 현탁액 및 와류에 즉시 첨가합니다. 혼합물을 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 1mL의 염색 완충액으로 세포를 두 번 세척하고 7.1단계에서 원심분리를 반복하여 세포를 펠릿화합니다.
  4. 펠릿을 0.1mL의 염색 완충액에 재현탁합니다. 세포 현탁액의 0.1mL 분취액 3개에 항-CD4 항체(FITC-conjugated) 1μL, 항-CD44 항체(APC-conjugated) 1μL, anti-CD62L 항체(PE/Cyanine-conjugated) 1μL를 추가합니다. 즉시 소용돌이치고 빛으로부터 보호되어 실온에서 15분 동안 배양합니다.
  5. 7.3단계에서 세척 및 원심분리를 반복합니다.
  6. 펠릿을 200μL의 IC 고정 버퍼에 재현탁시키고 어둠 속에서 20분 동안 배양합니다. 한편, 투과화 완충액(10x) 1부를 증류수 9부로 희석하여 투과화 완충액(1x)을 준비합니다. 실온에서 600 × g 의 원심분리로 1mL의 투과화 완충액(1x)으로 세포를 5분 동안 두 번 세척합니다.
  7. GM-CSF(PE-conjugated, 1 μL/test), IFN-γ(BV711-conjugated, 1 μL/test), IL-17A(BV421-conjugated, 1 μL/test) 및 IL-22(PerCP/Cyanine5.5-conjugated, 5 μL/test)에 대한 항체와 함께 0.1mL의 투과화 완충액(1x)에 펠릿을 재현탁시키고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  8. 7.6단계에서 세척 및 원심분리를 반복합니다.
  9. 세포 펠릿을 200μL의 PBS에 재현탁시키고 현탁액을 둥근 바닥 시험관으로 옮깁니다. 염색된 세포를 유세포 분석기에서 실행합니다.

8. Th-GM 하위 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략

  1. 보충 그림 S1에 설명된 게이팅 전략을 사용하여 유세포 분석 데이터를 분석합니다(사용된 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조). 여기에 사용된 소프트웨어의 경우 다운로드하여 컴퓨터에 설정하십시오.
  2. Flow Cytometry data(유세포 분석 데이터를 File |열기 | FCS 파일을 소프트웨어로 가져오고 이름 바꾸기 탭을 선택하여 각 샘플의 그룹과 이름에 주석을 추가합니다.
  3. 밀도 플롯을 클릭하여 왼쪽 하단 모서리에서 발견된 파편과 크기가 크고 입도가 높은 골수성 세포를 제외하려면 FSC 대 SSC 플롯(FSC 대 SSC 플롯, P1)에서 림프구를 선택하고, 이 플롯의 X축을 FSC-A로, Y축을 SSC-A로 표시합니다.
  4. P1의 이벤트를 두 번 클릭하여 다른 밀도 플롯을 생성하고, 이 플롯에서 셀 높이와 면적(X축 은 FSC-A , Y축 은 FSC-H)을 선택하여 단일 셀(상관 선, P2로 표시)을 셀 응집체에서 분리합니다.
  5. P2의 이벤트를 두 번 클릭하여 다른 밀도 플롯을 생성하고, 이 플롯의 X축을 FSC-A 로, Y축을 SSC-A로 표시합니다. FVS 780- 이벤트(P3)를 사용하여 생존 가능한 세포 집단을 게이트합니다.
  6. P3의 이벤트를 두 번 클릭하여 다음 밀도 플롯( X축 은 CD4-A , Y축 은 SSC-A)을 생성하고 CD4+ 집단(P4)을 선택하여 CD4 T 세포를 구별합니다.
  7. P4의 이벤트를 두 번 클릭하여 다른 밀도 플롯(X축은 CD44-A, Y축은 CD62L-A)을 생성하고, 이 플롯의 오른쪽 상단 모집단(CD62L--CD44+, P5)을 선택하여 effector T helper cells를 정의합니다.

9. 통계 분석

  1. 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 두 그룹을 비교하는 통계 분석을 수행합니다. *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 및 **** P < 0.0001 (평균 ± SD).

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결과

마우스의 DNFB 유도 CHS(접촉 과민증)
마우스에서 CHS를 유도하기 위해, 그림 1A와 같이 마우스는 귀 피부에 적용된 DNFB로 감작되고 도전 받았다. DNFB에 도전한 마우스에서는 DNFB에 도전한 마우스에서 표피 해면증의 지표인 귀 두께가 차량 처리된 마우스에 비해 현저하게 증가했습니다(그림 1B, 1일차에 70 대 3μm, 2일?...

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토론

이 프로토콜은 Th-GM 세포 subset의 생성 및 확장을 분석하기 위한 간단한 in vivo assay를 제공합니다. hapten 또는 항원에 의해 시작된 마우스에서 T 세포 매개 질병 모델을 활용하여 인간에서 활성화를 모방하는 것이 필수적입니다. DNFB는 생체 내에서 T 세포 면역 반응을 유발하기 위해 펩타이드 또는 단백질 항원보다 경제적이고 시간을 절약하는 소분자 합텐입니?...

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공개

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

본 연구는 중국국가자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, No. 81602763, 81803142, 82003347), 중국박사후연구원 우수연구자프로그램(China Postdoctoral Science Foundation) 우수연구자프로그램(No. 2017T100700), 중국박사후연구원연구원프로그램(China Postdoctoral Science Foundation) 정기연구원프로그램(등록번호: 2016M592673)의 지원을 받았다. 저자는 이 연구에서 유세포 분석에 대한 기술적 지원을 해준 Yan Wang과 Meng-Li Zhu(쓰촨성 대학교 West China Hospital의 핵심 시설)에게 감사의 뜻을 전합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4-dinitrofluorobenzeneBT REAGENTP0001746CAS NO: 70-34-8
AcetoneCHRON CHEMICALS/67-64-1
anti-CD4 antibodyBiolegend3005061:100 Diluted
anti-CD44 antibodyBiolegend1030121:100 Diluted
anti-CD62L antibodyBiolegend1044171:100 Diluted
anti-GM-CSF antibodyBD Bioscience5545071:100 Diluted
anti-IFN-γ antibodyBiolegend5058361:100 Diluted
anti-IL-17A antibodyBD Bioscience5633541:100 Diluted
anti-IL-22 antibodyBiolegend5164115 µL/test
CD45Biolegend1031011:200 Diluted
Chloral hydrateCHRON CHEMICALS/302-17-0
Dial thickness gauge (0.01 mm type)PEACOCKG-1A/
DMSOLIFESCIENCESD837167-68-5
EDTA Na2SolarbioE80306381-92-6
F4/80Biolegend1231021:200 Diluted
Fixable Viability Stain 780BD Bioscience5653881:1,000 Diluted, viability dye
Flow cytometerBD BioscienceBD FACS ARIA II SORP/
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 7Software for statistics and graphing
Intracelluar Fixtation and Permeablization Buffer SetThermo Fisher88-8824-00prepared freshly
IonomycinSigma-Aldrich407951CAS NO: 56092-81-0
Ly6GBiolegend1276021:200 Dilutied
NovoExpressAgilent/Software for flow cytometry data analysis; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Olive oilYUANYE BIOS305038001-25-0
PMASigma-AldrichP8139CAS NO: 16561-29-8
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Bioscience5550291 µL/mL

참고문헌

  1. Rasouli, J., et al. A distinct GM-CSF(+) T helper cell subset requires T-bet to adopt a TH1 phenotype and promote neuroinflammation. Science Immunology. 5 (52), (2020).
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