JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы представляем простой и стандартизированный метод анализа гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора-продуцирующего Т-хелпера in vivo.

Аннотация

Параллельно с традиционными линиями Th1/Th2/Th17/Treg, гранулоцитарно-макрофагальные колониестимулирующие фактор-продуцирующие Т-хелперы (Th-GM) были идентифицированы как отдельное подмножество Т-хелперных клеток (GM-CSF+ IFN-γ-IL-17A-IL-22-эффекторные CD4+ Т-клетки) у человека и мышей. Контактная гиперчувствительность (CHS) считается отличной животной моделью аллергического контактного дерматита (АХД) у человека, проявляющего интактный иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. Чтобы обеспечить стандартизированный и всесторонний анализ субпопуляции Th-GM клеток в Т-клеточном иммунном ответе in vivo, мышиную модель CHS индуцировали путем сенсибилизации/провокации с реактивным, низкомолекулярным, органическим гаптеном, 2,4-динитрофробензолом (DNFB). Субпопуляция Th-GM в эффекторных CD4+ Т-клетках, полученная при иммунизации гаптеном, анализировали с помощью проточной цитометрии. Мы обнаружили, что Th-GM в основном был расширен в поражениях и дренирующих лимфатических узлах в мышиной модели CHS, индуцированной DNFB. Этот метод может быть применен для дальнейшего изучения биологии Th-GM клеток и фармакологических исследований терапевтических стратегий, основанных на GM-CSF при различных состояниях, таких как ACD.

Введение

Т-хелперные клетки, продуцирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) - подмножество Th-GM - выделяются в отдельную подгруппу Т-хелперов у человека и мышей и, как считается, включают в себя "только экспрессирующие GM-CSF" (GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A- IL-22-) CD4 Т-клетки, идентифицированные с помощью анализа одноклеточной РНК, массовой цитометрии и картирования судьбы мышей GM-CSF 1,2,3. В 2014 году Sheng et al. сообщили о программировании сигнального преобразователя и активатора транскрипции 5 (STAT5) подмножества Th-GM и впервые концептуализировали подмножество «Th-GM» 4,5. Клетки Th-GM характеризуются цитокиновой экспрессией GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 и хемокиновых рецепторов типа C-X-C (CXCR) 4 или CXCR6 1,2. STAT и/или путь NF-κB имеют важное значение для дифференциации линии Th-GM. Был разработан метод in vitro для дифференцировки наивных CD4 Т-клеток в Th-GM клетки с использованием IL-7 в присутствии стимулов TCR6. Между тем, было показано, что цитокины IL-23 и IL-1β поддерживают экспрессию и патогенность клеток Th-GM ex vivo 3,7.

Повышение уровня клеток Th-GM было связано с несколькими аутоиммунными заболеваниями, такими как рассеянный склероз и ревматоидный артрит 2,8,9, что предполагает потенциальную роль в патогенезе аутоиммунитета10. Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что ГМ-КСФ может функционировать как медиатор воспаления. У мышей с генетической гиперэкспрессией Csf2 (гена, кодирующего GM-CSF) в CD4+ Т-клетках спонтанно развивался неврологический дефицит, сопровождающийся инфильтрацией фагоцитов в центральную нервную систему. В модели колита, связанного с переносом Т-клеток, адоптивный перенос Csf2−/− Т-клеток мышам Rag1−/− значительно снижал клинические и гистопатологические особенности заболевания. Тем не менее, существует мало сообщений о роли субпопуляции Th-GM в развитии аллергических заболеваний, таких как АХЗ.

АХП является одним из наиболее распространенных воспалительных дерматологических состояний с высокой распространенностью на работе и в быту11,12. Это реакция гиперчувствительности отсроченного типа IV, опосредованная интактной иммунной цепью, которая развивается в двух временных сегментированных фазах: сенсибилизация и выявление. АКД человека вызывается воздействием некоторых химических веществ (гаптенов или металлов), которые приводят к сенсибилизации. Во время этой фазы Т-клеточный ответ стимулируется гаптен-белковыми комплексами, представленными антигенпрезентирующими клетками. При последующем воздействии того же гаптена гаптен-специфические эффекторные и Т-клетки памяти реактивируются и локализуются на коже, что включает в себя инфильтрацию различных популяций иммунных клеток. Эта острая воспалительная реакция известна как элицитация, приводящая к полному развитию поражений13. ACD человека может быть изучена с использованием животных моделей контактной гиперчувствительности (CHS)14.

Модель CHS, индуцированная реакционноспособным, низкомолекулярным органическим гаптеном, 2,4-динитрофорбензолом (DNFB), является широко используемой мышиной моделью, которая использовалась при изучении патологии, а также потенциальных терапевтических вмешательств ACD15,16. Таким образом, эта Т-клеточно-зависимая модель может быть применена для изучения генерации субпопуляции Th-GM при аллергических заболеваниях. В данной работе мы индуцировали мышиную модель СЧХ с помощью DNFB, проанализировали генерацию Th-GM в поражениях и дренирующих лимфатических узлах и обнаружили, что субпопуляция Th-GM в основном расширяется при повторном воздействии того же гаптена. Это говорит о том, что субпопуляция Th-GM может быть существенной для развития АХД и представляет собой специфическую терапевтическую мишень при АХД.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все мыши, используемые в этом протоколе, находились на генетическом фоне C57BL/6, содержались в определенных условиях, свободных от патогенов, и получали пищу и воду в неограниченном количестве. Все эксперименты были одобрены органом по этической экспертизе благополучия животных Западно-Китайского медицинского центра Сычуаньского университета (20210302059).

1. Подготовка реагентов и материалов

  1. 0,5% раствор DNFB в качестве сенсибилизатора
    1. Для сенсибилизации 10 мышей приготовьте 1,1 мл смеси ацетона и оливкового масла в соотношении 4:1 (v/v): смешайте 880 мкл ацетона и 220 мкл оливкового масла, чтобы 0,1 мл избыточного объема компенсировали любые незначительные потери объема. Добавьте 5 μL DNFB к 1,1 мл смеси гомогенизированного ацетона и оливкового масла 4:1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежие продукты в день сенсибилизации. Смесь ацетона и оливкового масла следует готовить в вытяжном шкафу.
  2. Решение DNFB 0,2% в качестве претендента
    1. Чтобы испытать 10 мышей, добавьте 0,5 мкл DNFB в 0,25 мл гомогенизированной смеси ацетона и оливкового масла 4:1, описанной в шаге 1.1. Используйте смесь ацетона и оливкового масла 4:1 в качестве средства при работе с мышами после сенсибилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь ацетона и оливкового масла следует готовить в вытяжном шкафу.
  3. Хлоралгидрат в качестве обезболивающего средства
    1. Растворите 4 г хлоралгидрата в 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) до получения 8% рабочего раствора. Отфильтровать и хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев. Используйте 5 мкл на г массы тела для мыши.
  4. 50x коллагеназа внутривенно подвой
    1. Растворите 100 мг коллагеназы в/в в 1 мл базовой среды RPMI 1640 (без добавления антибиотиков или фетальной бычьей сыворотки [FBS]) до получения запаса 100 мг/мл. Хранить при температуре -20 °C в 100 μл аликвот до 6 месяцев.
  5. 1 000x DNase I stock
    1. Растворите 5 мг ДНКазы I в 1 мл 0,15 М NaCl до получения запаса 5 мг/мл. Хранить при температуре -20 °C в 100 μл аликвот до 6 месяцев.
  6. Буфер остановки
    1. Растворите 1,681 г ЭДТА в 50 мл базовой среды RPMI 1640 до получения запаса 100 мМ. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
  7. Моющая среда
    1. Растворите 0,372 г ЭДТА до конечной концентрации 2 мМ и 5 мл FBS до конечной концентрации 1% с 500 мл PBS. Отфильтровать и хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
  8. Буфер для окрашивания
    1. Растворите 0,372 г ЭДТА до конечной концентрации 2 мМ и 10 мл FBS до конечной концентрации 2% с 500 мл PBS. Отфильтровать и хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
  9. Реагенты для рестимуляции
    1. Растворите 1 мг форбола 12-миристат13-ацетата (ФМА) в 20 мл ДМСО с получением запаса 50 мкг/мл (500x) и храните его при -20 °C в 50 мкл аликвот.
    2. Разведите 250 мкл иономицина в растворе (4 мг/мл) в 7,75 мл ДМСО с получением запаса 500 мкг/мл (500x) и храните его при -20 °C в 50 мкл аликвот.
    3. Аликвоту 1 мл раствора ингибитора транспорта белка (содержащего брефельдин А) в 50 мкл и хранить аликвоты при 4 °С.

2. Индукция CHS у мышей

  1. На 5-й день обезболите мышей, введя 400 мг/кг хлоралгидрата внутрибрюшинно.
  2. С помощью бритвы для домашних животных выбрейте область живота мыши от 2 см × 2 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не царапайте кожу мыши; сохранить целостность кожного барьера в целости.
  3. Аккуратно и равномерно нанесите 100 мкл 0,5% раствора DNFB на выбритый живот с помощью микропипетки с одноразовыми наконечниками. Подержите мышей 5-10 секунд, чтобы часть растворителя испарилась.
  4. На день -4 повторите шаги 2.1-2.3 для повторной сенсибилизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два сенсибилизирующих события работают лучше, чем одно.
  5. В день 0 обработайте правое ухо мышей 20 μл 0,2% DNFB с помощью микропипеттора с одноразовыми наконечниками, а левое ухо обработайте тем же объемом смеси ацетона и оливкового масла 4:1, что и носитель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проработайте тыльную и вентральную стороны уха с помощью одинакового объема DNFB или носителя.
  6. В последующие 3 дня ежедневно измеряйте толщину уха правого и левого уха мышей с помощью циферблатного толщиномера, и рассчитывайте увеличение толщины уха: толщина правого уха - толщина левого уха.
    Примечание: Постепенное увеличение толщины ушей может наблюдаться у 0,2% ушей мышей, подвергшихся воздействию DNFB, по сравнению с ушами, обработанными носителем.

3. Выборочная коллекция мышей CHS

  1. На 3-й день обезболите мышей внутрибрюшинной инъекцией 400 мг/кг хлоралгидрата. Подождите 5-10 минут, пока мышь не войдет в бессознательное состояние, и выполните легкое ущипывание пальцев обеих задних ног, чтобы подтвердить, что мыши глубоко обезболились.
  2. Сфотографируйте каждое ухо каждой мыши с помощью камеры. Оцените инкрустацию (шелушение на ухе) и покраснение уха (эритему на ухе) самостоятельно для оценки выраженности воспаления по шкале от 0 до 5:0, нет; 1, незначительный; 2, умеренный; 3, помеченный; 4, очень заметный; 5, самый тяжелый.
  3. Усыпите мышь при вывихе шейки матки. Отрежьте все ухо и рассеките параллельно дренируемые лимфатические узлы мышей с помощью стерильных острых ножниц и щипцов. Поместите ткани в одну лунку 6-луночного планшета, помещенного на лед, содержащую 5 мл предварительно охлажденного PBS для ферментативной или физической диссоциации с получением суспензий одиночных клеток (дополнительный рисунок S1A и дополнительный рисунок S2A).
  4. Для гистологического анализа зафиксировать образцы из уха в 4% параформальдегиде, обезвожить и погрузить их в парафин для иммуногистохимического окрашивания, как описано в другом месте17.

4. Приготовление одноклеточной суспензии из ушей

  1. Разделите вентральную и тыльную стороны уха, зажав и разорвав обрезанные концы двумя изогнутыми щипцами (дополнительный рисунок S1B). Поместите их в лунку 6-луночного планшета, содержащего 4,5 мл буфера для пищеварения, убедившись, что эти ткани полностью погружены в буфер для пищеварения (дополнительный рисунок S1C).
    Примечание: Буфер для расщепления состоял из RPMI 1640, содержащего 10% FBS + 25 мМ HEPES + 2 мг/мл коллагеназы IV + 5 мкг/мл ДНКазы I.
  2. Инкубируйте листочки колоса в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C в течение 20 минут. Разрежьте ушные листочки ножницами как можно мельче, чтобы облегчить переваривание тканей (дополнительный рисунок S1D), и поместите образец обратно в инкубатор еще на 40 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективное пищеварение может быть достигнуто в течение 40-50 минут. Переваривание при 37 °C влияет на жизнеспособность клеток.
  3. Добавьте 0,5 мл стоп-буфера на лунку, чтобы нейтрализовать ферментативную активность коллагеназы IV и ДНКазы I. Выполните следующие шаги на льду.
  4. Перенесите фрагменты ткани уха с помощью пары изогнутых щипцов в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую клеточный фильтр 70 мкм, и нанесите пипетку всего объема среды в тот же клеточный фильтр.
  5. Разрушьте ткани с помощью верхнего конца поршня шприца объемом 1 мл. Надавливайте круговыми движениями на клеточный фильтр 70 мкм, пока не останутся только белые соединительные ткани (дополнительный рисунок S1D).
  6. Дважды промойте сетчатые фильтры 1 000 μл моющей среды. Перенесите весь объем лунки в центрифужную пробирку объемом 50 мл через сетчатый фильтр 40 μм. Держите трубку на льду.

5. Приготовление одноклеточных суспензий из дренирующих лимфатических узлов (дЛН)

  1. Перенесите лимфатические узлы с помощью пары изогнутых щипцов на клеточный фильтр 70 мкм, расположенный поверх лунки 6-луночного планшета (дополнительный рисунок S2B). Диссоциируйте лимфатические узлы с помощью верхнего конца поршня шприца объемом 1 мл. Надавливайте круговыми движениями на сетчатый фильтр 70 мкм до тех пор, пока не останется только белый мусор (дополнительный рисунок S2C).
  2. Дважды промойте сетчатое фильтр 1 000 μл моющей среды. Переложите весь объем лунки в трубку объемом 5 мл. Держите трубки на льду.

6. Рестимуляция субпопуляции Th-GM 12-миристатом 13-ацетатом (PMA)/иономицином в присутствии ингибитора транспорта белка

  1. Центрифугируйте клетки, выделенные из уха и образцов дренируемых лимфатических узлов, в течение 8 минут при 400 × г при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Осторожно восстановите суспендию в 1 000 μл моющей среды.
  2. Соберите небольшую часть каждого образца, чтобы подсчитать общее количество клеток, полученных из уха и дренируемого лимфатического узла, с помощью гемоцитометра. Добавьте 0,04% трипанового синего для измерения жизнеспособности клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток должна составлять более 60% для последующей стимуляции и анализа Т-клеток. Плотность клеток может составлять 1-5 × 106/мл.
  3. Центрифугируйте клетки на шаге 6.1 и выбросьте надосадочную жидкость. Осторожно ресуспендируйте гранулу 1000 мкл среды RPMI 1640, содержащей 2% FBS, и затравите 1 мл суспензии одиночных клеток (10–6 клеток/мл) в 12-луночных планшетах для культуры тканей с плоским дном.
  4. Добавьте 2 мкл форбол 12-миристат13-ацетата (PMA) (конечная концентрация 100 нг/мл), 2 мкл иономицина (конечная концентрация 1000 нг/мл) и 1 мкл ингибитора переноса белка (содержащего брефельдин А) в каждую лунку в 12-луночный планшет, содержащий 1 мл вышеуказанной суспензии одиночных клеток, и инкубируйте при 37 °C в течение 4 ч.

7. Анализ субпопуляций Th-GM, полученных in vivo путем окрашивания клеточной поверхности и внутриклеточного окрашивания

  1. Перенесите стимулированные клетки в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл с помощью пипетки. Центрифугируйте пробирки центрифуги в течение 8 мин при 400 × г при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Промойте гранулу клетки один раз 1 мл буфера для окрашивания и обеспечьте клетки центрифугированием, как описано в шаге 7.1. Ресуспендируйте клетки в дозе 1-10 × 106/мл в 0,5 мл окрашивающего буфера.
  3. Добавьте 0,5 мкл стокового раствора красителя для жизнеспособности (см. Таблицу материалов) в 0,5 мл клеточной суспензии и немедленно сделайте вихрь. Выдержать смесь в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Дважды промойте клетки 1 мл буфера для окрашивания и повторите центрифугирование в шаге 7.1 для гранулирования клеток.
  4. Суспендируйте гранулу в 0,1 мл буфера для окрашивания. Добавьте 1 мкл анти-CD4 антитела (FITC-конъюгированное), 1 мкл анти-CD44 антитела (APC-конъюгированное) и 1 мкл анти-CD62L антитела (PE/Cyanine7-конъюгированное) к трем 0,1 мл аликвот клеточной суспензии. Вихрь сразу же выдержать и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут, защищенном от света месте.
  5. Повторите промывку и центрифугирование на шаге 7.3.
  6. Повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл буфера для фиксации IC и инкубируйте в течение 20 минут в темноте. Тем временем приготовьте пермеабилизационный буфер (1x), разбавив 1 часть пермеабилизационного буфера (10x) 9 частями дистиллированной воды. Дважды промойте клетки 1 мл пермеабилизационного буфера (1x) центрифугированием при 600 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Ресуспендируют гранулу в 0,1 мл пермеабилизационного буфера (1x) с антителами против GM-CSF (PE-конъюгированный, 1 μл/анализ), ИФН-γ (BV711-конъюгированный, 1 μл/анализ), IL-17A (BV421-конъюгированный, 1 μл/анализ) и IL-22 (PerCP/Cyanine5,5-конъюгированный, 5 μл/анализ) и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
  8. Повторите промывки и центрифугирование на шаге 7.6.
  9. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл PBS и перенесите суспензию в пробирку с круглым дном. Запустите окрашенные клетки в проточный цитометр.

8. Стратегия стробирования для идентификации подмножества Th-GM

  1. Проанализируйте данные проточной цитометрии (см. Таблицу материалов для получения подробной информации об используемом программном обеспечении) с использованием стратегии стробирования, показанной на дополнительном рисунке S1. Используемое здесь программное обеспечение можно скачать и настроить на компьютере.
  2. Импортируйте данные проточной цитометрии, нажав на Файл |Открыть | Импортируйте файлы FCS в программное обеспечение и аннотируйте группу и имя каждого образца, выбрав вкладку Переименовать .
  3. Выберите лимфоциты на графике FSC и SSC ( FSC low SSC low, P1), чтобы исключить мусор, обнаруженный в нижнем левом углу, и миелоидные клетки с большим размером и высокой зернистостью, щелкнув по графику плотности, и отобразите ось X этого графика как FSC-A , а ось Y как SSC-A.
  4. Дважды щелкните события в P1, чтобы создать еще один график плотности, и отделите отдельные ячейки (показаны в виде коррелированной линии, P2) от агрегатов ячеек, выбрав высоту и площадь ячейки на этом графике (ось X как FSC-A и ось Y как FSC-H).
  5. Дважды щелкните события в P2, чтобы создать еще один график плотности, и покажите ось X этого графика как FSC-A , а ось Y как SSC-A. Гейтирование жизнеспособных клеточных популяций с помощью событий FVS 780- (P3).
  6. Дважды щелкните события в P3, чтобы построить следующий график плотности ( ось X как CD4-A , а ось Y как SSC-A), и выделите CD4 T-клетки, выбрав популяцию CD4+ (P4).
  7. Дважды щелкните события в P4, чтобы создать еще один график плотности (ось X как CD44-A, а ось Y как CD62L-A), и определите вспомогательные ячейки эффектора T, выбрав верхнюю правую популяцию этого графика (CD62L- CD44+, P5).

9. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ, сравнивая две группы с помощью непарного t-критерия. *P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 и **** P < 0,0001 (среднее значение ± SD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

DNFB-индуцированная CHS (контактная гиперчувствительность) у мышей
Чтобы индуцировать CHS у мышей, мышам проводили сенсибилизацию и вводили DNFB, наносимый на кожу уха, как показано на рисунке 1A. Толщина уха, являющаяся индикатором эпидермального ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает простой анализ in vivo для анализа генерации и расширения субпопуляции клеток Th-GM. Важно использовать Т-клеточно-опосредованную модель заболевания у мышей, инициируемую гаптенами или антигенами, имитируя эту активацию у человека. DNFB пред...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 81602763, 81803142, 82003347), Программой выдающихся исследователей Китайского фонда постдокторантуры (No 2017T100700) и Программой регулярных исследователей Китайского фонда постдокторантуры (No 2016M592673). Авторы хотели бы поблагодарить Ян Ванга и Мэн-Ли Чжу (Male Wang и Meng-Li Zhu) (Основные учреждения Западно-Китайской больницы, Сычуаньский университет) за техническую поддержку проточной цитометрии в этом исследовании.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4-dinitrofluorobenzeneBT REAGENTP0001746CAS NO: 70-34-8
AcetoneCHRON CHEMICALS/67-64-1
anti-CD4 antibodyBiolegend3005061:100 Diluted
anti-CD44 antibodyBiolegend1030121:100 Diluted
anti-CD62L antibodyBiolegend1044171:100 Diluted
anti-GM-CSF antibodyBD Bioscience5545071:100 Diluted
anti-IFN-γ antibodyBiolegend5058361:100 Diluted
anti-IL-17A antibodyBD Bioscience5633541:100 Diluted
anti-IL-22 antibodyBiolegend5164115 µL/test
CD45Biolegend1031011:200 Diluted
Chloral hydrateCHRON CHEMICALS/302-17-0
Dial thickness gauge (0.01 mm type)PEACOCKG-1A/
DMSOLIFESCIENCESD837167-68-5
EDTA Na2SolarbioE80306381-92-6
F4/80Biolegend1231021:200 Diluted
Fixable Viability Stain 780BD Bioscience5653881:1,000 Diluted, viability dye
Flow cytometerBD BioscienceBD FACS ARIA II SORP/
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 7Software for statistics and graphing
Intracelluar Fixtation and Permeablization Buffer SetThermo Fisher88-8824-00prepared freshly
IonomycinSigma-Aldrich407951CAS NO: 56092-81-0
Ly6GBiolegend1276021:200 Dilutied
NovoExpressAgilent/Software for flow cytometry data analysis; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Olive oilYUANYE BIOS305038001-25-0
PMASigma-AldrichP8139CAS NO: 16561-29-8
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Bioscience5550291 µL/mL

Ссылки

  1. Rasouli, J., et al. A distinct GM-CSF(+) T helper cell subset requires T-bet to adopt a TH1 phenotype and promote neuroinflammation. Science Immunology. 5 (52), (2020).
  2. Galli, E., et al. GM-CSF and CXCR4 define a T helper cell signature in multiple sclerosis. Nature Medicine. 25 (8), 1290-1300 (2019).
  3. Komuczki, J., et al. Fate-mapping of GM-CSF expression identifies a discrete subset of inflammation-driving T helper cells regulated by cytokines IL-23 and IL-1beta. Immunity. 50 (5), 1289-1304 (2019).
  4. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24 (12), 1387-1402 (2014).
  5. Herndler-Brandstetter, D., Flavell, R. A. Producing GM-CSF: a unique T helper subset. Cell Research. 24 (12), 1379-1380 (2014).
  6. Lu, Y., Fu, X. Y., Zhang, Y. In vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58087(2018).
  7. Hu, Y., et al. Interleukin-1beta-induced IRAK1 ubiquitination is required for TH-GM-CSF cell differentiation in T cell-mediated inflammation. Journal of Autoimmunity. 102, 50-64 (2019).
  8. Reynolds, G., et al. Synovial CD4+ T-cell-derived GM-CSF supports the differentiation of an inflammatory dendritic cell population in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (5), 899-907 (2016).
  9. Al-Mossawi, M. H., et al. Unique transcriptome signatures and GM-CSF expression in lymphocytes from patients with spondyloarthritis. Nature Communation. 8 (1), 1510(2017).
  10. Wicks, I. P., Roberts, A. W. Targeting GM-CSF in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 12 (1), 37-48 (2016).
  11. Scheinman, P. L., et al. Contact dermatitis. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 38(2021).
  12. Pesonen, M., Koskela, K., Aalto-Korte, K. Contact urticaria and protein contact dermatitis in the Finnish Register of Occupational Diseases in a period of 12 years. Contact Dermatitis. 83 (1), 1-7 (2020).
  13. Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
  14. Gaspari, A. A., Katz, S. I., Martin, S. F. Contact hypersensitivity. Current Protocols in Immunology. 113, 1-7 (2016).
  15. Manresa, M. C. Animal models of contact dermatitis: 2,4-dinitrofluorobenzene-induced contact hypersensitivity. Methods in Molecular Biology. 2223, 87-100 (2021).
  16. Kim, J. H., et al. CD1a on Langerhans cells controls inflammatory skin disease. Nature Immunology. 17 (10), 1159-1166 (2016).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Achuthan, A., et al. Cytokine-induced acute inflammatory monoarticular arthritis. Methods in Molecular Biology. 1784, 215-223 (2018).
  19. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  20. Kruisbeek, A. M., Shevach, E., Thornton, A. M. Proliferative assays for T cell function. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3 (2004).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Th GM24CD4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены