JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה וסטנדרטית לניתוח תת-קבוצת ה-T המסייעת לייצור גורמי גרנולוציטים-מקרופאגים in vivo.

Abstract

במקביל לשושלות המסורתיות של Th1/Th2/Th17/Treg, תאי T מסייעים לייצור גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (Th-GM) זוהו כתת-קבוצה מובחנת של תאי T מסייעים (GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A- IL-22- תאי T אפקטורים CD4+ ) בבני אדם ובעכברים. רגישות יתר למגע (CHS) נחשבת למודל חייתי מצוין לדלקת עור ממגע אלרגית (ACD) בבני אדם, המבטאת תגובה חיסונית שלמה בתיווך תאי T. כדי לספק בדיקה סטנדרטית ומקיפה לניתוח תת-קבוצת תאי Th-GM בתגובה החיסונית התלויה בתאי T in vivo, מודל CHS של עכברים הושרה על ידי רגישות/אתגר עם הפטנ אורגני תגובתי בעל משקל מולקולרי נמוך, 2,4-דיניטרופלואורובנזן (DNFB). תת-הקבוצה של Th-GM בתאי CD4+ T אפקטורים שנוצרו עם החיסון עם הפטן נותחה על ידי ציטומטריית זרימה. מצאנו ש-Th-GM הורחב בעיקר בנגעים ובבלוטות לימפה מנקזות במודל העכבר CHS המושרה על ידי DNFB. ניתן ליישם שיטה זו להמשך מחקר הביולוגיה של תאי Th-GM ומחקר פרמקולוגי של אסטרטגיות טיפוליות המתמקדות ב-GM-CSF במצבים שונים, כגון ACD.

Introduction

תאי ה-T המסייעים למושבת הגרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) - תת-הקבוצה Th-GM - התגלה כתת-קבוצה מובחנת של תאי T מסייעים בבני אדם ובעכברים ונחשב לכלול תאי T CD4 "המבטאים GM-CSF בלבד" (GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A- IL-22-) שזוהו על ידי ניתוח RNA של תא בודד, ציטומטריית מסה ועכברי מיפוי גורל GM-CSF 1,2,3. בשנת 2014, שנג ועמיתיו דיווחו על מתמר אותות ומפעיל תכנות שעתוק 5 (STAT5) של תת-הקבוצה Th-GM והמשיגו לראשונה את תת-הקבוצה "Th-GM" 4,5. תאי Th-GM מאופיינים בביטוי ציטוקינים של GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 וקולטני כימוקין C-X-C סוג קולטן כימוקין (CXCR) 4 או CXCR6 1,2. STAT ו/או מסלול NF-κB חיוניים להתמיינות שושלת Th-GM. הוקמה שיטה במבחנה כדי להבדיל תאי CD4 T נאיביים לתאי Th-GM באמצעות IL-7 בנוכחות גירוי TCR6. בינתיים, הציטוקינים IL-23 ו-IL-1β הוכחו כשומרים על הביטוי והפתוגניות של תאי Th-GM ex vivo 3,7.

עלייה בתאי Th-GM נקשרה למספר מחלות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה ודלקת מפרקים שגרונית 2,8,9, מה שמרמז על תפקיד פוטנציאלי בפתוגנזה של אוטואימוניות10. עדויות מצטברות מצביעות על כך ש-GM-CSF יכול לתפקד כמתווך דלקתי. עכברים המבטאים יתר גנטית Csf2 (גן המקודד GM-CSF) בתאי CD4+ T פיתחו באופן ספונטני ליקויים נוירולוגיים המלווים בחדירת פגוציטים למערכת העצבים המרכזית. במודל קוליטיס של העברת תאי T, ההעברה המאמצת של תאי Csf2−/− T לעכברי Rag1−/− הפחיתה משמעותית את המאפיינים הקליניים וההיסטופתולוגיים של המחלה. עם זאת, ישנם מעט דיווחים על תפקידי תת-הקבוצה Th-GM במחלות אלרגיות, כגון ACD.

ACD הוא בין המצבים הדרמטולוגיים הדלקתיים הנפוצים ביותר עם שכיחות גבוהה בסביבות עבודה וחיים11,12. זוהי תגובת רגישות יתר מסוג IV המתווכת על ידי מעגל חיסוני שלם המתפתח בשני שלבים מפולחים זמנית: רגישות וגירוי. ACD אנושי מופעל על ידי חשיפה לכימיקלים מסוימים (הפטנים או מתכות) המובילים לרגישות. במהלך שלב זה, תגובה מתווכת תאי T מוכנה על ידי קומפלקסים של חלבון הפטן המוצגים על ידי תאים מציגי אנטיגן. עם חשיפה לאחר מכן לאותו הפטן, תאי T וזיכרון ספציפיים להפטן מופעלים מחדש ומתמקמים בעור, תהליך הכרוך בחדירה של מגוון אוכלוסיות של תאי חיסון. תגובה דלקתית חריפה זו ידועה בשם גירוי, וכתוצאה מכך התפתחות מלאה של נגעים13. ניתן לחקור ACD אנושי באמצעות מודלים של בעלי חיים של רגישות יתר למגע (CHS)14.

מודל CHS המושרה על ידי הפטן אורגני תגובתי בעל משקל מולקולרי נמוך, 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB), הוא מודל עכברי נפוץ ששימש בחקר הפתולוגיה כמו גם התערבויות טיפוליות פוטנציאליות של ACD15,16. לפיכך, ניתן ליישם מודל תלוי תאי T זה כדי לחקור את הדור של תת-קבוצה Th-GM במחלות אלרגיות. כאן, גרמנו למודל עכברי של CHS עם DNFB, ניתחנו את הייצור של Th-GM בנגעים ובבלוטות לימפה מנקזות, ומצאנו כי תת-הקבוצה Th-GM הורחבה בעיקר עם חשיפה חוזרת לאותו הפטן. זה מצביע על כך שתת-קבוצה של Th-GM יכולה להיות חיונית להתפתחות ACD ומייצגת מטרה טיפולית ספציפית ב-ACD.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העכברים ששימשו בפרוטוקול זה היו על הרקע הגנטי C57BL/6, נשמרו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים וסופקו להם מזון ומים אד-ליביטום. כל הניסויים אושרו על ידי גוף הביקורת האתית לרווחת בעלי חיים של המרכז הרפואי של מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (20210302059).

1. מגיב והכנת חומרים

  1. תמיסת DNFB 0.5% כרגיש
    1. לרגישות של 10 עכברים, הכינו 1.1 מ"ל אצטון/שמן זית תערובת 4:1 (v/v): ערבוב של 880 מיקרוליטר אצטון ו-220 מיקרוליטר שמן זית כדי לאפשר 0.1 מ"ל של נפח עודף להסביר כל אובדן נפח קל. הוסף 5 מיקרוליטר של DNFB ל-1.1 מ"ל של תערובת אצטון/שמן זית הומוגנית 4:1.
      הערה: הכן טרי ביום הרגישות. יש להכין את תערובת האצטון/שמן זית במכסה אדים.
  2. 0.2% פתרון DNFB כמאתגר
    1. כדי לאתגר 10 עכברים, הוסף 0.5 מיקרוליטר של DNFB ב-0.25 מ"ל של תערובת אצטון/שמן זית הומוגנית 4:1 המתוארת בשלב 1.1. השתמש בתערובת האצטון/שמן זית 4:1 ככלי לאתגר את העכברים לאחר רגישות.
      הערה: יש להכין את תערובת האצטון/שמן זית במכסה אדים.
  3. כלורל הידרט כחומר הרדמה
    1. ממיסים 4 גרם של כלורל הידרט ב-50 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) כדי ליצור תמיסת עבודה של 8%. מסננים ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים. השתמש ב -5 מיקרוליטר לכל גרם משקל גוף לעכבר.
  4. מלאי 50x קולגנאז IV
    1. יש להמיס 100 מ"ג קולגנאז IV ב-1 מ"ל של מדיום RPMI 1640 בסיסי (ללא תוספת אנטיביוטיקה או סרום בקר עוברי [FBS]) כדי ליצור מלאי של 100 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ב-100 מיקרוליטר למשך עד 6 חודשים.
  5. מלאי 1,000x DNase I
    1. ממיסים 5 מ"ג של DNase I ב-1 מ"ל של 0.15 M NaCl כדי ליצור מלאי של 5 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ב-100 מיקרוליטר למשך עד 6 חודשים.
  6. עצור את המאגר
    1. ממיסים 1.681 גרם של EDTA ב-50 מ"ל של מדיום RPMI 1640 בסיסי כדי ליצור מלאי של 100 מ"מ. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
  7. כביסה בינונית
    1. ממיסים 0.372 גרם של EDTA לריכוז סופי של 2 מ"מ ו-5 מ"ל של FBS לריכוז סופי של 1% עם 500 מ"ל של PBS. מסננים ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודש.
  8. מאגר מכתים
    1. ממיסים 0.372 גרם של EDTA לריכוז סופי של 2 מ"מ ו-10 מ"ל של FBS לריכוז סופי של 2% עם 500 מ"ל של PBS. מסננים ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודש.
  9. ריאגנטים לגירוי
    1. ממיסים 1 מ"ג של phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ב-20 מ"ל של DMSO כדי ליצור מלאי של 50 מיקרוגרם/מ"ל (500x) ולאחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס ב-50 מיקרוליטר במליכות.
    2. יש לדלל 250 מיקרוליטר של יונומיצין בתמיסה (4 מ"ג/מ"ל) ב-7.75 מ"ל של DMSO כדי ליצור מלאי של 500 מיקרוגרם/מ"ל (פי 500) ולאחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס ב-50 מיקרוליטר בכמות של 50 מיקרוליטר.
    3. יש להקצות 1 מ"ל של תמיסת מעכב הובלת חלבון (המכילה ברפלדין A) ב-50 מיקרוליטר ולאחסן את המינון ב-4 מעלות צלזיוס.

2. אינדוקציה של CHS בעכברים

  1. ביום -5 יש להרדים את העכברים על ידי הזרקת 400 מ"ג/ק"ג כלורל הידרט תוך צפק.
  2. בעזרת מכונת גילוח לחיות מחמד יש לגלח שטח של 2 ס"מ × 2 ס"מ על בטן העכבר.
    הערה: הימנע מגירוד עור העכבר; שמור על שלמות המחסום העורי שלם.
  3. מרחו 100 מיקרוליטר של תמיסת DNFB 0.5% על הבטן המגולחת בעדינות ובאופן שווה בעזרת מיקרופיפטה עם קצוות חד פעמיים. החזק את העכברים 5-10 שניות כדי לאפשר לחלק מהממס להתאדות.
  4. ביום -4, חזור על שלבים 2.1-2.3 לרגישות נוספת.
    הערה: שני אירועי רגישות פועלים טוב יותר מאחד.
  5. ביום 0, אתגרו את האוזן הימנית של העכברים עם 20 מיקרוליטר של 0.2% DNFB באמצעות מיקרופיפטור עם קצות חד פעמיים, וטפלו באוזן שמאל באותו נפח של תערובת אצטון/שמן זית 4:1 כמו הרכב.
    הערה: אתגר את הצד הגבי והגחוני של האוזן עם נפחים שווים של DNFB או רכב.
  6. בשלושת הימים הבאים יש למדוד את עובי האוזן של אוזן ימין ושמאל של עכברים מדי יום באמצעות מד עובי חוגה, ולחשב את הגידול בעובי האוזן: עובי אוזן ימין - עובי אוזן שמאל.
    הערה: ניתן להבחין בעלייה הדרגתית בעובי האוזן באוזני עכבר מאותגרות של 0.2% DNFB בהשוואה לאוזניים שטופלו ברכב.

3. איסוף מדגם של עכברי CHS

  1. ביום השלישי יש להרדים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של 400 מ"ג/ק"ג כלורל הידרט. המתן 5-10 דקות עד שהעכבר יהיה במצב של חוסר הכרה ובצע צביטה עדינה בבוהן בשתי הרגליים האחוריות כדי לוודא שהעכברים מורדמים עמוק.
  2. צלם תמונה של כל אוזן לכל עכבר באמצעות מצלמה. ציון הקרום (קשקשת על האוזן) ואדמומיות האוזן (אריתמה על האוזן) באופן עצמאי כדי להעריך את חומרת הדלקת בסולם מ-0 עד 5: 0, אין; 1, קל; 2, בינוני; 3, מסומן; 4, מסומן מאוד; 5, החמור ביותר.
  3. המתת חסד של העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם. חותכים את כל האוזן ומנתחים את בלוטות הלימפה המנקזות המקבילות של עכברים בעזרת מספריים ומלקחיים חדים וסטריליים. הנח את הרקמות לבאר אחת של צלחת בת 6 בארות המונחת על קרח המכילה 5 מ"ל של PBS מקורר מראש לדיסוציאציה אנזימטית או פיזית ליצירת תרחיפים של תא בודד (איור משלים S1A ואיור משלים S2A).
  4. לניתוח היסטולוגי, יש לתקן את דגימות האוזן ב-4% פרפורמלדהיד, לייבש ולהטמיע אותן בפרפין לצביעה אימונוהיסטוכימית, כמתואר במקום אחר17.

4. הכנת תרחיף חד תאי מהאוזניים

  1. פיצול הצד הגחוני והגבי של האוזן על ידי צביטה וקריעה של הקצוות החתוכים בשני מלקחיים מעוקלים (איור משלים S1B). הניחו אותם בבאר של צלחת של 6 בארות המכילה 4.5 מ"ל של מאגר עיכול, מה שמבטיח שהרקמות הללו שקועות לחלוטין במאגר העיכול (איור משלים S1C).
    הערה: מאגר העיכול הורכב מ-RPMI 1640 המכיל 10% FBS + 25 מ"מ HEPES + 2 מ"ג/מ"ל קולגנאז IV + 5 מיקרוגרם/מ"ל DNase I.
  2. דגרו את עלוני האוזן בחממת תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. חותכים את עלוני האוזניים במספריים קטנים ככל האפשר כדי להקל על עיכול הרקמות (איור משלים S1D), והחזירו את הדגימה לחממה למשך 40 דקות נוספות.
    הערה: ניתן להשיג עיכול יעיל תוך 40-50 דקות. עיכול יתר ב-37 מעלות צלזיוס משפיע על כדאיות התאים.
  3. הוסף 0.5 מ"ל של מאגר עצירה לכל באר כדי לנטרל את הפעילויות האנזימטיות של קולגנאז IV ו-DNase I. בצע את השלבים הבאים על קרח.
  4. העבירו את שברי רקמת האוזן עם זוג מלקחיים מעוקלים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל מסננת תאים של 70 מיקרומטר ופיפטה את כל נפח המדיום לאותה מסננת תאים.
  5. לשבש את הרקמות באמצעות הקצה העליון של בוכנת מזרק של 1 מ"ל. לחץ בתנועה מעגלית כנגד מסננת התאים של 70 מיקרומטר עד שיישארו רק רקמות חיבור לבנות (איור משלים S1D).
  6. שוטפים את מסננות התאים פעמיים עם 1,000 מיקרוליטר של מדיום כביסה. העבירו את כל נפח הבאר לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. שמור את הצינור על קרח.

5. הכנת תרחיפים חד-תאיים מבלוטות לימפה מנקזות (dLNs)

  1. העבירו את בלוטות הלימפה עם זוג מלקחיים מעוקלים למסננת תאים של 70 מיקרומטר על גבי הבאר של צלחת בת 6 בארות (איור משלים S2B). נתק את בלוטות הלימפה באמצעות הקצה העליון של בוכנת מזרק 1 מ"ל. לחץ בתנועות סיבוביות כנגד מסננת התאים של 70 מיקרומטר עד שיישאר רק פסולת לבנה (איור משלים S2C).
  2. שוטפים את מסננת התאים פעמיים עם 1,000 מיקרוליטר של מדיום כביסה. העבירו את כל נפח הבאר לצינור של 5 מ"ל. שמור את הצינורות על קרח.

6. גירוי מחדש של תת-קבוצת Th-GM עם 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA)/יונומיצין בנוכחות מעכב הובלת חלבון

  1. צנטריפוגה את התאים המבודדים מהאוזן ומדגימות בלוטות הלימפה המנקזות למשך 8 דקות ב-400 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס, ומשליכים את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה עם 1,000 מיקרוליטר של מדיום כביסה בעדינות.
  2. אסוף חלק קטן מכל דגימה כדי לספור את המספר הכולל של תאים שמקורם באוזן ובבלוטת הלימפה המנקזת באמצעות המוציטומטר. הוסף 0.04% טריפן כחול כדי למדוד את כדאיות התא.
    הערה: כדאיות התאים צריכה להיות יותר מ-60% לגירוי וניתוח תאי T לאחר מכן. צפיפות התאים יכולה להיות 1-5 ×-106/מ"ל.
  3. צנטריפוגה של התאים בשלב 6.1 והשליכו את הסופרנטנט. השעו בעדינות את הגלולה עם 1,000 מיקרוליטר של מדיום RPMI 1640 המכיל 2% FBS, וזרע 1 מ"ל של תרחיף התא היחיד (106 תאים/מ"ל) בלוחות תרבית רקמה עם תחתית שטוחה של 12 בארות.
  4. הוסף 2 מיקרוליטר של פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) (ריכוז סופי של 100 ננוגרם/מ"ל), 2 מיקרוליטר של יונומיצין (ריכוז סופי של 1,000 ננוגרם/מ"ל), ו-1 מיקרוליטר של מעכב הובלת חלבון (המכיל ברפלדין A) לכל באר בצלחת של 12 בארות המכילה 1 מ"ל של תרחיף התא הבודד מעל ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.

7. ניתוח תת-קבוצות Th-GM שנוצרו in vivo על ידי פני התא וצביעה תוך-תאית

  1. העבירו את התאים המגורים לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה. צנטריפוגה את צינורות הצנטריפוגה למשך 8 דקות בטמפרטורה של 400 × גרם בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט.
  2. שטפו את גלולת התא פעם אחת עם 1 מ"ל של מאגר מכתים וגלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה, כמתואר בשלב 7.1. השעו מחדש את התאים ב-1-10 ×-106/מ"ל ב-0.5 מ"ל של מאגר מכתים.
  3. הוסף מיד 0.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי צבע כדאיות (ראה טבלת החומרים) ל-0.5 מ"ל של תרחיף תאים ומערבולת. דוגרים את התערובת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של מאגר מכתים, וחזרו על הצנטריפוגה בשלב 7.1 כדי לגלול את התאים.
  4. השעו מחדש את הגלולה ב-0.1 מ"ל של מאגר מכתים. הוסף 1 מיקרוליטר של נוגדן נגד CD4 (מצומד FITC), 1 מיקרוליטר של נוגדן נגד CD44 (מצומד APC) ו-1 מיקרוליטר של נוגדן נגד CD62L (מצומד PE/Cyanine7) לשלוש אליקוטות של 0.1 מ"ל של תרחיף התאים. מערבולת מיד ודוגרת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, מוגנת מפני אור.
  5. חזור על השטיפות והצנטריפוגה בשלב 7.3.
  6. השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר קיבוע IC ודגרו למשך 20 דקות בחושך. בינתיים, הכינו מאגר חדירות (1x) על ידי דילול חלק אחד של מאגר החדירות (10x) ב-9 חלקים של מים מזוקקים. שטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של מאגר חדירות (1x) על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. השעו מחדש את הגלולה ב-0.1 מ"ל של מאגר חדירות (1x) עם נוגדנים נגד GM-CSF (מצומד PE, 1 מיקרוליטר לבדיקה), IFN-γ (מצומד BV711, 1 מיקרוליטר לבדיקה), IL-17A (מצומד BV421, 1 מיקרוליטר לבדיקה) ו-IL-22 (מצומד PerCP/ציאנין 5.5, 5 מיקרוליטר לבדיקה) ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  8. חזור על השטיפות והצנטריפוגה בשלב 7.6.
  9. השעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של PBS והעבירו את המתלה למבחנה תחתונה עגולה. הפעל את התאים המוכתמים בציטומטר זרימה.

8. אסטרטגיית שער לזיהוי תת-הקבוצה Th-GM

  1. נתח את נתוני ציטומטריית הזרימה (ראה טבלת החומרים לפרטים על התוכנה בה נעשה שימוש) באמצעות אסטרטגיית השער המומחשת באיור משלים S1. עבור התוכנה המשמשת כאן, הורד והגדר אותה במחשב.
  2. ייבא את נתוני ציטומטריית הזרימה על ידי לחיצה על קובץ |פתוח | ייבא FCS files לתוכנה, והוסף ביאורים לקבוצה והשם של כל דוגמה על ידי בחירה בכרטיסייה שנה שם .
  3. בחר את הלימפוציטים בתרשים FSC לעומת SSC (FSC נמוך SSC נמוך, P1) כדי לא לכלול פסולת שנמצאת בפינה השמאלית התחתונה ותאים מיאלואידים עם גודל גדול וגרעיניות גבוהה על ידי לחיצה על תרשים הצפיפות, והצג את ציר ה-X של תרשים זה כ-FSC-A ואת ציר ה-Y כ-SSC-A.
  4. לחץ פעמיים על האירועים ב- P1 כדי ליצור תרשים צפיפות נוסף, והפרד את התאים הבודדים (מוצג כקו מתואם, P2) מצברי תאים על-ידי בחירת גובה התא והשטח בתרשים זה (ציר X כ - FSC-A לעומת ציר Y כ - FSC-H).
  5. לחץ פעמיים על האירועים ב- P2 כדי ליצור תרשים צפיפות נוסף, והצג את ציר ה- X של תרשים זה כ - FSC-A ואת ציר ה- Y כ- SSC-A. שער את אוכלוסיות התאים הקיימות באמצעות אירועי FVS 780 (P3).
  6. לחץ פעמיים על האירועים ב- P3 כדי ליצור את תרשים הצפיפות הבא (ציר ה- X כ- CD4-A וציר ה- Y כ- SSC-A), והבחין בין תאי CD4 T על-ידי בחירת אוכלוסיית CD4+ (P4).
  7. לחץ פעמיים על האירועים ב-P4 כדי ליצור תרשים צפיפות נוסף (ציר ה-X כ-CD44-A וציר ה-Y כ-CD62L-A), והגדר את תאי העזר של האפקטור T על ידי בחירת האוכלוסייה הימנית העליונה של תרשים זה (CD62L- CD44+, P5).

9. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוחים סטטיסטיים, תוך השוואה בין שתי קבוצות באמצעות מבחן t לא מזווג. *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 ו-**** P < 0.0001 (ממוצע ± SD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

CHS (רגישות יתר למגע) המושרה על ידי DNFB בעכברים
כדי לגרום ל-CHS בעכברים, העכברים היו רגישים ואותגרו עם DNFB שהוחל על עור האוזן, כפי שמוצג באיור 1A. עובי האוזן, אינדיקטור לספונגיוזיס אפידרמיס, גדל באופן ניכר בעכברים מאותגרים ב-DNFB בהשוואה לעכברים שטופלו ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מספק מבחן פשוט in vivo לניתוח היצירה וההרחבה של תת-קבוצת תאי Th-GM. חיוני להשתמש במודל מחלה בתיווך תאי T בעכברים המופעלים על ידי הפטנים או אנטיגנים, המחקה את ההפעלה הזו בבני אדם. DNFB הוא הפטן בעל מולקולה קטנה שהוא חסכוני יותר וחוסך זמן מאשר אנטיגנים של פפטיד או ח?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 81602763, 81803142, 82003347), תוכנית החוקר המצטיין של קרן המדע הפוסט-דוקטורט של סין (מס' 2017T100700), ותוכנית החוקרים הרגילה של קרן הפוסט-דוקטורט למדע בסין (מס' 2016M592673). המחברים רוצים להודות ליאן וואנג ומנג-לי ג'ו (מתקני הליבה של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן) על התמיכה הטכנית בזרימה ציטומטרית במחקר זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4-dinitrofluorobenzeneBT REAGENTP0001746CAS NO: 70-34-8
AcetoneCHRON CHEMICALS/67-64-1
anti-CD4 antibodyBiolegend3005061:100 Diluted
anti-CD44 antibodyBiolegend1030121:100 Diluted
anti-CD62L antibodyBiolegend1044171:100 Diluted
anti-GM-CSF antibodyBD Bioscience5545071:100 Diluted
anti-IFN-γ antibodyBiolegend5058361:100 Diluted
anti-IL-17A antibodyBD Bioscience5633541:100 Diluted
anti-IL-22 antibodyBiolegend5164115 µL/test
CD45Biolegend1031011:200 Diluted
Chloral hydrateCHRON CHEMICALS/302-17-0
Dial thickness gauge (0.01 mm type)PEACOCKG-1A/
DMSOLIFESCIENCESD837167-68-5
EDTA Na2SolarbioE80306381-92-6
F4/80Biolegend1231021:200 Diluted
Fixable Viability Stain 780BD Bioscience5653881:1,000 Diluted, viability dye
Flow cytometerBD BioscienceBD FACS ARIA II SORP/
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 7Software for statistics and graphing
Intracelluar Fixtation and Permeablization Buffer SetThermo Fisher88-8824-00prepared freshly
IonomycinSigma-Aldrich407951CAS NO: 56092-81-0
Ly6GBiolegend1276021:200 Dilutied
NovoExpressAgilent/Software for flow cytometry data analysis; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Olive oilYUANYE BIOS305038001-25-0
PMASigma-AldrichP8139CAS NO: 16561-29-8
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Bioscience5550291 µL/mL

References

  1. Rasouli, J., et al. A distinct GM-CSF(+) T helper cell subset requires T-bet to adopt a TH1 phenotype and promote neuroinflammation. Science Immunology. 5 (52), (2020).
  2. Galli, E., et al. GM-CSF and CXCR4 define a T helper cell signature in multiple sclerosis. Nature Medicine. 25 (8), 1290-1300 (2019).
  3. Komuczki, J., et al. Fate-mapping of GM-CSF expression identifies a discrete subset of inflammation-driving T helper cells regulated by cytokines IL-23 and IL-1beta. Immunity. 50 (5), 1289-1304 (2019).
  4. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24 (12), 1387-1402 (2014).
  5. Herndler-Brandstetter, D., Flavell, R. A. Producing GM-CSF: a unique T helper subset. Cell Research. 24 (12), 1379-1380 (2014).
  6. Lu, Y., Fu, X. Y., Zhang, Y. In vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58087(2018).
  7. Hu, Y., et al. Interleukin-1beta-induced IRAK1 ubiquitination is required for TH-GM-CSF cell differentiation in T cell-mediated inflammation. Journal of Autoimmunity. 102, 50-64 (2019).
  8. Reynolds, G., et al. Synovial CD4+ T-cell-derived GM-CSF supports the differentiation of an inflammatory dendritic cell population in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (5), 899-907 (2016).
  9. Al-Mossawi, M. H., et al. Unique transcriptome signatures and GM-CSF expression in lymphocytes from patients with spondyloarthritis. Nature Communation. 8 (1), 1510(2017).
  10. Wicks, I. P., Roberts, A. W. Targeting GM-CSF in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 12 (1), 37-48 (2016).
  11. Scheinman, P. L., et al. Contact dermatitis. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 38(2021).
  12. Pesonen, M., Koskela, K., Aalto-Korte, K. Contact urticaria and protein contact dermatitis in the Finnish Register of Occupational Diseases in a period of 12 years. Contact Dermatitis. 83 (1), 1-7 (2020).
  13. Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
  14. Gaspari, A. A., Katz, S. I., Martin, S. F. Contact hypersensitivity. Current Protocols in Immunology. 113, 1-7 (2016).
  15. Manresa, M. C. Animal models of contact dermatitis: 2,4-dinitrofluorobenzene-induced contact hypersensitivity. Methods in Molecular Biology. 2223, 87-100 (2021).
  16. Kim, J. H., et al. CD1a on Langerhans cells controls inflammatory skin disease. Nature Immunology. 17 (10), 1159-1166 (2016).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Achuthan, A., et al. Cytokine-induced acute inflammatory monoarticular arthritis. Methods in Molecular Biology. 1784, 215-223 (2018).
  19. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  20. Kruisbeek, A. M., Shevach, E., Thornton, A. M. Proliferative assays for T cell function. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3 (2004).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TTh GM24T CD4T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved