Analyse von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden faktorproduzierenden T-Helferzellen in einem Mausmodell der Kontaktüberempfindlichkeit

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir eine einfache und standardisierte Methode zur Analyse der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden faktorproduzierenden T-Helfer-Untergruppe in vivo vor.

Zusammenfassung

Parallel zu den traditionellen Th1/Th2/Th17/Treg-Linien wurden Granulozyten-Makrophagen-stimulierende faktorproduzierende T-Helferzellen (Th-GM) als eigenständige Untergruppe von T-Helferzellen (GM-CSF⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22-Effektor^, CD4⁺ T-Zellen) bei Menschen und Mäusen identifiziert. Die Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) gilt als hervorragendes Tiermodell für allergische Kontaktdermatitis (ACD) beim Menschen und manifestiert eine intakte T-Zell-vermittelte Immunantwort. Um einen standardisierten und umfassenden Assay zur Analyse der Th-GM-Zell-Untergruppe in der T-Zell-abhängigen Immunantwort in vivo bereitzustellen, wurde ein murines CHS-Modell durch Sensibilisierung/Provokation mit einem reaktiven, niedermolekularen, organischen Hapten, 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) induziert. Die Th-GM-Untergruppe in Effektor-CD4⁺ T-Zellen, die nach Immunisierung mit dem Hapten erzeugt wurden, wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wir fanden heraus, dass Th-GM im DNFB-induzierten CHS-Mausmodell hauptsächlich in Läsionen und drainierenden Lymphknoten expandiert war. Diese Methode kann zur weiteren Untersuchung der Biologie von Th-GM-Zellen und zur pharmakologischen Erforschung von therapeutischen Strategien mit Schwerpunkt auf GM-CSF bei verschiedenen Erkrankungen, wie z. B. ACD, angewendet werden.

Einleitung

Die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF)-produzierenden T-Helferzellen - die Th-GM-Untergruppe - hat sich als eigenständige Untergruppe von T-Helferzellen bei Menschen und Mäusen herauskristallisiert und gilt als "GM-CSF-exprimierende" (GM-CSF⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22-) CD4-T-Zellen, die durch Einzelzell-RNA-Analyse, Massenzytometrie und GM-CSF-Schicksalskartierung von Mäusen identifiziert wurden ^1,2,3. Im Jahr 2014 berichteten Sheng et al. über die Programmierung von Signalwandlern und Aktivatoren der Transkription 5 (STAT5) der Th-GM-Untergruppe und konzeptualisierten zum ersten Mal die "Th-GM"-Untergruppe ^4,5. Th-GM-Zellen zeichnen sich durch die Zytokinexpression von GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 und den Chemokinrezeptoren C-X-C Chemokinrezeptor Typ (CXCR) 4 oder CXCR6 ^1,2 aus. STAT und/oder der NF-κB-Signalweg sind essentiell für die Differenzierung der Th-GM-Linie. Es wurde eine in vitro Methode etabliert, um naive CD4-T-Zellen in Th-GM-Zellen unter Verwendung von IL-7 in Gegenwart von TCR-Stimuli zu differenzieren⁶. In der Zwischenzeit wurde gezeigt, dass die Zytokine IL-23 und IL-1β die Expression und Pathogenität von Th-GM-Zellen ex vivo aufrechterhalten ^3,7.

Die Erhöhung der Th-GM-Zellen wurde mit mehreren Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose und rheumatoider Arthritis in Verbindung gebracht ^2,8,9, was auf eine mögliche Rolle bei der Pathogenese der Autoimmunität hindeutet¹⁰. Es häufen sich die Hinweise darauf, dass GM-CSF als Entzündungsmediator fungieren kann. Mäuse, die Csf2 (Gen, das für GM-CSF kodiert) in CD4⁺ T-Zellen genetisch überexprimierten, entwickelten spontan neurologische Defizite, begleitet von der Infiltration von Fresszellen in das zentrale Nervensystem. In einem T-Zell-Transfer-Colitis-Modell reduzierte der adoptive Transfer von ^Csf2-/-T-Zellen in Rag1^-/-Mäuse die klinischen und histopathologischen Merkmale der Erkrankung signifikant. Es gibt jedoch nur wenige Berichte über die Rolle der Th-GM-Untergruppe bei allergischen Erkrankungen wie ACD.

ACD gehört zu den häufigsten entzündlichen dermatologischen Erkrankungen mit hoher Prävalenz im Arbeits- und Lebensumfeld^11,12. Es handelt sich um eine Typ-IV-Überempfindlichkeitsreaktion, die durch einen intakten Immunkreislauf vermittelt wird und sich in zwei zeitlich segmentierten Phasen entwickelt: Sensibilisierung und Auslösung. Die ACD beim Menschen wird durch die Exposition gegenüber einigen Chemikalien (Hapten oder Metallen) ausgelöst, die zu einer Sensibilisierung führen. Während dieser Phase wird eine T-Zell-vermittelte Reaktion durch Hapten-Protein-Komplexe ausgelöst, die von Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden. Bei anschließender Exposition gegenüber demselben Hapten werden Hapten-spezifische Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen reaktiviert und lokalisieren sich in der Haut, ein Prozess, der die Infiltration einer Vielzahl von Immunzellpopulationen beinhaltet. Diese akute Entzündungsreaktion wird als Auslösung bezeichnet und führt zur vollständigen Entwicklung von Läsionen¹³. ACD beim Menschen kann mit Tiermodellen der Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) untersucht ^werden14.

Das CHS-Modell, das durch ein reaktives, niedermolekulares, organisches Hapten, 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB), induziert wird, ist ein häufig verwendetes Mausmodell, das sowohl bei der Untersuchung der Pathologie als auch bei möglichen therapeutischen Interventionen von ACD verwendet wurde^15,16. Somit könnte dieses T-Zell-abhängige Modell angewendet werden, um die Bildung der Th-GM-Untergruppe bei allergischen Erkrankungen zu untersuchen. In dieser Arbeit induzierten wir ein Mausmodell von CHS mit DNFB, analysierten die Bildung von Th-GM in Läsionen und drainierenden Lymphknoten und fanden heraus, dass die Th-GM-Untergruppe hauptsächlich bei erneuter Exposition gegenüber demselben Hapten expandierte. Dies deutet darauf hin, dass die Th-GM-Untergruppe für die Entwicklung von ACD essentiell sein könnte und ein spezifisches therapeutisches Ziel bei ACD darstellt.

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Protokoll

Alle Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden auf dem genetischen Hintergrund C57BL/6 gehalten, unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten und ad libitum mit Futter und Wasser versorgt. Alle Versuche wurden von der ethischen Überprüfungsstelle für Tierschutz des West China Medical Center der Universität Sichuan (20210302059) genehmigt.

1. Reagenzien- und Materialvorbereitung

1. 0,5%ige DNFB-Lösung als Sensibilisator
   1. Für die Sensibilisierung von 10 Mäusen 1,1 ml Aceton/Olivenöl 4:1 (v/v) Mischung zubereiten: 880 μl Aceton und 220 μl Olivenöl mischen, um 0,1 ml überschüssiges Volumen zu erhalten, um geringfügige Volumenverluste auszugleichen. 5 μl DNFB zu 1,1 ml homogenisierter Aceton/Olivenöl-Mischung 4:1 hinzufügen.
      HINWEIS: Am Tag der Sensibilisierung frisch zubereiten. Das Aceton-Olivenöl-Gemisch sollte in einem Abzug zubereitet werden.
2. 0,2 % DNFB-Lösung als Herausforderer
   1. Um 10 Mäuse zu bekämpfen, fügen Sie 0,5 μl DNFB in 0,25 ml einer homogenisierten Aceton/Olivenöl-Mischung 4:1 hinzu, die in Schritt 1.1 beschrieben ist. Verwenden Sie das Aceton/Olivenöl-Gemisch 4:1 als Vehikel, wenn Sie die Mäuse nach der Sensibilisierung herausfordern.
      HINWEIS: Das Aceton-Olivenöl-Gemisch sollte in einem Abzug zubereitet werden.
3. Chloralhydrat als Anästhetikum
   1. Löse 4 g Chloralhydrat in 50 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf, um eine 8%ige Arbeitslösung herzustellen. Filtern und bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern. Verwenden Sie 5 μl pro g Körpergewicht für eine Maus.
4. 50x Kollagenase IV Vorrat
   1. Löse 100 mg Kollagenase i.v. in 1 ml basischem RPMI 1640-Medium (nicht ergänzt mit Antibiotika oder fötalem Rinderserum [FBS]), um eine 100 mg/ml-Brühe herzustellen. Bei -20 °C in 100 μl Aliquoten bis zu 6 Monate lagern.
5. 1.000x DNase I Lager
   1. 5 mg DNase I werden in 1 mL 0,15 M NaCl gelöst, um eine 5 mg/ml-Brühe herzustellen. Bei -20 °C in 100 μl Aliquoten bis zu 6 Monate lagern.
6. Stopp-Puffer
   1. 1,681 g EDTA werden in 50 mL basischem RPMI 1640-Medium gelöst, um eine 100 mM Brühe herzustellen. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.
7. Waschmittel
   1. 0,372 g EDTA bis zu einer Endkonzentration von 2 mM und 5 ml FBS bis zu einer Endkonzentration von 1 % mit 500 ml PBS lösen. Filtern und bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
8. Puffer zum Färbemittel
   1. 0,372 g EDTA bis zu einer Endkonzentration von 2 mM und 10 ml FBS bis zu einer Endkonzentration von 2 % mit 500 ml PBS auflösen. Filtern und bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
9. Restimulations-Reagenzien
   1. 1 mg Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) in 20 ml DMSO zu einem 50 μg/ml-Stamm (500x) auflösen und bei -20 °C in 50 μl Aliquoten lagern.
   2. Verdünnen Sie 250 μl Ionomycin in Lösung (4 mg/ml) in 7,75 mL DMSO, um einen 500 μg/ml-Stamm (500x) herzustellen, und lagern Sie ihn bei -20 °C in 50 μl Aliquoten.
   3. Aliquot Sie 1 ml Proteintransporthemmerlösung (enthält Brefeldin A) in 50 μl und lagern Sie die Aliquote bei 4 ΰC.

2. Induktion von CHS bei Mäusen

1. Am Tag -5 betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 400 mg/kg Chloralhydrat.
2. Rasieren Sie mit einem Haustierrasierer einen Bereich von 2 cm × 2 cm am Bauch der Maus.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Maushaut zu zerkratzen. Halten Sie die Integrität der Hautbarriere intakt.
3. 100 μl 0,5%ige DNFB-Lösung mit einer Mikropipette mit Einwegspitzen sanft und gleichmäßig auf den rasierten Bauch auftragen. Halten Sie die Mäuse 5-10 Sekunden, damit ein Teil des Lösungsmittels verdampfen kann.
4. Wiederholen Sie an Tag -4 die Schritte 2.1-2.3 für eine weitere Sensibilisierung.
   HINWEIS: Zwei Sensibilisierungsereignisse funktionieren besser als eines.
5. An Tag 0 wird das rechte Ohr der Mäuse mit 20 μl 0,2 % DNFB mit einer Mikropipette mit Einwegspitzen angegriffen und das linke Ohr mit der gleichen Menge Aceton/Olivenöl-Mischung 4:1 wie das Vehikel behandelt.
   HINWEIS: Belasten Sie die dorsale und ventrale Seite des Ohrs mit gleichen Mengen DNFB oder Vehikel.
6. Messen Sie in den nächsten 3 Tagen täglich die Ohrdicke des rechten und linken Ohrs von Mäusen mit einem Dickenmessgerät und berechnen Sie die Zunahme der Ohrdicke: Dicke des rechten Ohrs - Dicke des linken Ohrs.
   HINWEIS: Eine allmähliche Zunahme der Ohrdicke konnte bei 0,2 % DNFB-belasteten Mausohren im Vergleich zu vehikelbehandelten Ohren beobachtet werden.

3. Probenentnahme von CHS-Mäusen

1. An Tag 3 wird die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von 400 mg/kg Chloralhydrat anästhesiert. Warten Sie 5-10 Minuten, bis sich die Maus in einem Zustand der Bewusstlosigkeit befindet, und kneifen Sie sanft in die Zehen mit beiden hinteren Füßen, um zu bestätigen, dass die Mäuse tief betäubt sind.
2. Machen Sie mit einer Kamera ein Foto von jedem Ohr per Maus. Bewerten Sie die Verkrustung (Schuppung am Ohr) und die Rötung des Ohrs (Erythem am Ohr) unabhängig voneinander, um die Schwere der Entzündung auf einer Skala von 0 bis 5: 0 zu bewerten, keine; 1, leicht; 2, mäßig; 3, markiert; 4, sehr ausgeprägt; 5, am schwersten.
3. Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation. Schneiden Sie das ganze Ohr ab und präparieren Sie die parallel drainierenden Lymphknoten der Mäuse mit einer sterilen, scharfen Schere und Pinzette. Legen Sie das Gewebe in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, die auf Eis gelegt wird und 5 ml vorgekühltes PBS enthält, zur enzymatischen oder physikalischen Dissoziation zur Erzeugung von Einzelzellsuspensionen (Ergänzende Abbildung S1A und Ergänzende Abbildung S2A).
4. Für die histologische Analyse fixieren Sie die Ohrproben in 4 % Paraformaldehyd, dehydrieren Sie sie und betten Sie sie in Paraffin für die immunhistochemische Färbung ein, wie an anderer Stelle^{beschrieben 17}.

4. Herstellung einer einzelligen Suspension aus den Ohren

1. Teilen Sie die ventrale und dorsale Seite des Ohrs, indem Sie die abgeschnittenen Enden mit zwei gebogenen Pinzetten einklemmen und abreißen (Ergänzende Abbildung S1B). Legen Sie sie in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 4,5 ml Verdauungspuffer und stellen Sie sicher, dass diese Gewebe vollständig in den Verdauungspuffer eingetaucht sind (Ergänzende Abbildung S1C).
   HINWEIS: Der Verdauungspuffer bestand aus RPMI 1640 mit 10 % FBS + 25 mM HEPES + 2 mg/ml Kollagenase IV + 5 μg/ml DNase I.
2. Inkubieren Sie die Ohrsegel in einem 37 °C heißen Zellkultur-Inkubator für 20 Minuten. Schneiden Sie die Ohrblätter mit einer Schere so klein wie möglich ab, um die Verdauung des Gewebes zu erleichtern (Ergänzende Abbildung S1D), und legen Sie die Probe für weitere 40 Minuten in den Inkubator.
   HINWEIS: Ein effizienter Aufschluss kann innerhalb von 40-50 Minuten erreicht werden. Eine Überverdauung bei 37 °C beeinträchtigt die Lebensfähigkeit der Zelle.
3. Fügen Sie 0,5 ml Stopppuffer pro Vertiefung hinzu, um die enzymatischen Aktivitäten von Kollagenase IV und DNase I zu neutralisieren. Führen Sie die nächsten Schritte auf Eis durch.
4. Übertragen Sie die Ohrgewebefragmente mit einer gebogenen Pinzette in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das ein 70-μm-Zellsieb enthält, und pipettieren Sie das gesamte Volumen des Mediums in dasselbe Zellsieb.
5. Unterbrechen Sie das Gewebe mit dem oberen Ende eines 1-ml-Spritzenkolbens. In kreisenden Bewegungen gegen das 70 μm Zellsieb drücken, bis nur noch weißes Bindegewebe übrig bleibt (Ergänzende Abbildung S1D).
6. Spülen Sie die Zellsiebe zweimal mit 1.000 μl Waschmedium. Übertragen Sie das gesamte Volumen der Vertiefung durch ein 40-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Halten Sie die Tube auf Eis.

5. Herstellung von einzelligen Suspensionen aus drainierenden Lymphknoten (dLNs)

1. Übertragen Sie die Lymphknoten mit einer gebogenen Pinzette auf ein 70-μm-Zellsieb auf der Vertiefung einer 6-Well-Platte (Ergänzende Abbildung S2B). Dissoziieren Sie die Lymphknoten mit dem oberen Ende eines 1-ml-Spritzenkolbens. Drücken Sie in kreisenden Bewegungen gegen das 70 μm Zellsieb, bis nur noch weiße Ablagerungen übrig bleiben (Ergänzende Abbildung S2C).
2. Spülen Sie das Zellsieb zweimal mit 1.000 μl Waschmedium. Übertragen Sie das gesamte Volumen der Vertiefung in ein 5-ml-Röhrchen. Bewahren Sie die Röhren auf Eis auf.

6. Restimulation der Th-GM-Untergruppe mit 12-Myristat-13-acetat (PMA)/Ionomycin in Gegenwart eines Proteintransportinhibitors

1. Die aus dem Ohr isolierten Zellen und die drainierenden Lymphknotenproben werden 8 Minuten lang bei 400 × g bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 1.000 μl Waschmedium.
2. Entnehmen Sie einen kleinen Teil jeder Probe, um mit einem Hämozytometer die Gesamtzahl der Zellen aus dem Ohr und dem drainierenden Lymphknoten zu zählen. Fügen Sie 0,04 % Trypanblau hinzu, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen.
   HINWEIS: Die Zellviabilität sollte für die anschließende T-Zell-Stimulation und -Analyse mehr als 60 % betragen. Die Zelldichte kann 1-5 × 10⁶/ml betragen.
3. Die Zellen werden in Schritt 6.1 zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 1.000 μl RPMI 1640-Medium mit 2 % FBS und säen Sie 1 ml der Einzelzellsuspension (10⁶ Zellen/ml) in 12-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden aus.
4. 2 μl Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) (Endkonzentration 100 ng/ml), 2 μl Ionomycin (Endkonzentration 1.000 ng/ml) und 1 μl Proteintransportinhibitor (mit Brefeldin A) in jede Vertiefung der 12-Well-Platte, die 1 ml der obigen Einzelzellsuspension enthält, geben und 4 h lang bei 37 °C inkubieren.

7. Analyse von Th-GM-Untergruppen, die in vivo durch Zelloberflächen- und intrazelluläre Färbung erzeugt wurden

1. Übertragen Sie die stimulierten Zellen mit einer Pipette in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Die Zentrifugenröhrchen werden 8 Minuten lang bei 400 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen.
2. Waschen Sie das Zellpellet einmal mit 1 mL Färbepuffer und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, wie in Schritt 7.1 beschrieben. Resuspendieren Sie die Zellen bei 1-10 × 10⁶/ml in 0,5 ml Färbepuffer.
3. Geben Sie sofort 0,5 μl Viabilitätsfarbstoff-Stammlösung (siehe Materialtabelle) zu 0,5 ml Zellsuspension und Vortex. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL Färbepuffer und wiederholen Sie die Zentrifugation in Schritt 7.1, um die Zellen zu pelletieren.
4. Resuspendieren Sie das Pellet in 0,1 ml Färbepuffer. Fügen Sie 1 μl Anti-CD4-Antikörper (FITC-konjugiert), 1 μl Anti-CD44-Antikörper (APC-konjugiert) und 1 μl Anti-CD62L-Antikörper (PE/Cyanin7-konjugiert) zu drei 0,1-ml-Aliquoten der Zellsuspension hinzu. Sofort einziehen und 15 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren.
5. Wiederholen Sie die Waschgänge und das Zentrifugieren in Schritt 7.3.
6. Das Pellet in 200 μl IC-Fixierungspuffer resuspendieren und 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. In der Zwischenzeit den Permeabilisierungspuffer (1x) herstellen, indem 1 Teil des Permeabilisierungspuffers (10x) mit 9 Teilen destilliertem Wasser verdünnt wird. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL Permeabilisierungspuffer (1x) durch Zentrifugation bei 600 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
7. Resuspendieren Sie das Pellet in 0,1 mL Permeabilisierungspuffer (1x) mit Antikörpern gegen GM-CSF (PE-konjugiert, 1 μL/Test), IFN-γ (BV711-konjugiert, 1 μL/Test), IL-17A (BV421-konjugiert, 1 μL/Test) und IL-22 (PerCP/Cyanin5,5-konjugiert, 5 μL/Test) und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
8. Wiederholen Sie die Waschgänge und das Zentrifugieren in Schritt 7.6.
9. Das Zellpellet wird in 200 μl PBS resuspendiert und die Suspension in ein Reagenzglas mit rundem Boden überführt. Lassen Sie die gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer laufen.

8. Gating-Strategie zur Identifizierung der Th-GM-Teilmenge

1. Analysieren Sie die Durchflusszytometriedaten (Einzelheiten zur verwendeten Software finden Sie in der Materialtabelle ) unter Verwendung der in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellten Gating-Strategie. Laden Sie die hier verwendete Software herunter und richten Sie sie auf dem Computer ein.
2. Importieren Sie die Durchflusszytometrie-Daten, indem Sie auf Datei |Öffnen | Importieren Sie FCS-Dateien in die Software, und kommentieren Sie die Gruppe und den Namen der einzelnen Proben, indem Sie auf die Registerkarte Umbenennen klicken.
3. Wählen Sie die Lymphozyten in einem FSC- und SSC-Diagramm (FSC ^niedrig , SSC ^niedrig, P1) aus, um Trümmer in der unteren linken Ecke und myeloische Zellen mit großer Größe und hoher Granularität auszuschließen, indem Sie auf das Dichtediagramm klicken, und zeigen Sie die X-Achse dieses Diagramms als FSC-A und die Y-Achse als SSC-A an.
4. Doppelklicken Sie auf die Ereignisse in P1, um ein weiteres Dichtediagramm zu erstellen, und trennen Sie die einzelnen Zellen (dargestellt als korrelierte Linie, P2) von den Zellaggregaten, indem Sie die Zellenhöhe und -fläche in diesem Diagramm auswählen (X-Achse als FSC-A vs . Y-Achse als FSC-H).
5. Doppelklicken Sie auf die Ereignisse in P2, um ein weiteres Dichtediagramm zu erstellen, und zeigen Sie die X-Achse dieses Diagramms als FSC-A und die Y-Achse als SSC-A an. Gate der lebensfähigen Zellpopulationen mit Hilfe von FVS 780^- Ereignissen (P3).
6. Doppelklicken Sie auf die Ereignisse in P3, um das nächste Dichtediagramm zu generieren (die X-Achse als CD4-A und die Y-Achse als SSC-A), und unterscheiden Sie die CD4-T-Zellen, indem Sie die CD4+-Population (P4⁾ auswählen.
7. Doppelklicken Sie auf die Ereignisse in P4, um ein weiteres Dichtediagramm zu generieren (die X-Achse als CD44-A und die Y-Achse als CD62L-A), und definieren Sie die Effektor-T-Helferzellen, indem Sie die obere rechte Population dieses Diagramms auswählen (CD62L-CD44⁺, P5).

9. Statistische Auswertung

1. Führen Sie statistische Analysen durch, indem Sie zwei Gruppen mit einem ungepaarten t-Test vergleichen. *P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 und **** P < 0,0001 (Mittelwert ± SD).

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Ergebnisse

DNFB-induzierte CHS (Kontaktüberempfindlichkeit) bei Mäusen
Um CHS bei Mäusen zu induzieren, wurden die Mäuse sensibilisiert und mit DNFB auf die Ohrhaut aufgebracht, wie in Abbildung 1A dargestellt. Die Ährendicke, ein Indikator für epidermale Spongiose, war bei DNFB-provozierten Mäusen im Vergleich zu vehikelbehandelten Mäusen deutlich erhöht (Abbildung 1B, 70 vs. 3 μm an Tag 1, 203 vs. 7,5 μm an...

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Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen einfachen In-vivo-Assay zur Analyse der Erzeugung und Expansion der Th-GM-Zelluntergruppe. Es ist wichtig, ein T-Zell-vermitteltes Krankheitsmodell bei Mäusen zu verwenden, das durch Haptene oder Antigene ausgelöst wurde, und diese Aktivierung beim Menschen nachzuahmen. DNFB ist ein niedermolekulares Hapten, das kostengünstiger und zeitsparender als Peptid- oder Proteinantigene ist, um die Immunantwort der T-Zellen in vivo auszulösen

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dinitrofluorobenzene	BT REAGENT	P0001746	CAS NO: 70-34-8
Acetone	CHRON CHEMICALS	/	67-64-1
anti-CD4 antibody	Biolegend	300506	1:100 Diluted
anti-CD44 antibody	Biolegend	103012	1:100 Diluted
anti-CD62L antibody	Biolegend	104417	1:100 Diluted
anti-GM-CSF antibody	BD Bioscience	554507	1:100 Diluted
anti-IFN-γ antibody	Biolegend	505836	1:100 Diluted
anti-IL-17A antibody	BD Bioscience	563354	1:100 Diluted
anti-IL-22 antibody	Biolegend	516411	5 µL/test
CD45	Biolegend	103101	1:200 Diluted
Chloral hydrate	CHRON CHEMICALS	/	302-17-0
Dial thickness gauge (0.01 mm type)	PEACOCK	G-1A	/
DMSO	LIFESCIENCES	D8371	67-68-5
EDTA Na2	Solarbio	E8030	6381-92-6
F4/80	Biolegend	123102	1:200 Diluted
Fixable Viability Stain 780	BD Bioscience	565388	1:1,000 Diluted, viability dye
Flow cytometer	BD Bioscience	BD FACS ARIA II SORP	/
GraphPad Prism	GraphPad Software	Prism 7	Software for statistics and graphing
Intracelluar Fixtation and Permeablization Buffer Set	Thermo Fisher	88-8824-00	prepared freshly
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407951	CAS NO: 56092-81-0
Ly6G	Biolegend	127602	1:200 Dilutied
NovoExpress	Agilent	/	Software for flow cytometry data analysis; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Olive oil	YUANYE BIO	S30503	8001-25-0
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	CAS NO: 16561-29-8
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Bioscience	555029	1 µL/mL