Analyse de cellules T auxiliaires productrices de facteurs de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages dans un modèle murin d’hypersensibilité de contact

Résumé

Ici, nous présentons une méthode simple et standardisée d’analyse in vivo du sous-ensemble T auxiliaire producteur de facteurs de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages.

Résumé

Parallèlement aux lignées traditionnelles Th1/Th2/Th17/Treg, les lymphocytes T auxiliaires producteurs de facteurs de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (Th-GM) ont été identifiés comme un sous-ensemble distinct de lymphocytes T auxiliaires (cellules T CD4⁺ GM-CSF⁺ IFN-γ-IL-17A-IL-22-22⁾ chez l’homme et la souris. L’hypersensibilité de contact (SHC) est considérée comme un excellent modèle animal de dermatite de contact allergique (DCA) chez l’homme, manifestant une réponse immunitaire intacte médiée par les lymphocytes T. Afin de fournir un essai normalisé et complet pour analyser le sous-ensemble des cellules Th-GM dans la réponse immunitaire dépendante des lymphocytes T in vivo, un modèle murin de SHC a été induit par sensibilisation/provocation avec un haptène organique, 2,4-dinitrofluorobenzène réactif de faible poids moléculaire (DNFB). Le sous-ensemble Th-GM dans les lymphocytes T CD4⁺ effecteurs générés lors de l’immunisation avec l’haptène a été analysé par cytométrie en flux. Nous avons constaté que le Th-GM était principalement développé dans les lésions et les ganglions lymphatiques drainants dans le modèle murin de SHC induit par le DNFB. Cette méthode peut être appliquée pour approfondir l’étude de la biologie des cellules Th-GM et la recherche pharmacologique de stratégies thérapeutiques centrées sur le GM-CSF dans diverses conditions, telles que l’ACD.

Introduction

Le sous-ensemble Th-GM (Th-GM) qui produit le facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages (GM-CSF) est apparu comme un sous-ensemble distinct de cellules T auxiliaires chez l’homme et la souris et est considéré comme comprenant uniquement des lymphocytes T CD4 exprimant GM-CSF (GM-CSF⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^-) identifiés par analyse de l’ARN unicellulaire, cytométrie de masse et souris mappeuses du destin GM-CSF ^1,2,3. En 2014, Sheng et al. ont rapporté la programmation du transducteur de signal et de l’activateur de transcription 5 (STAT5) du sous-ensemble Th-GM et ont conceptualisé le sous-ensemble « Th-GM » pour la première fois ^4,5. Les cellules Th-GM sont caractérisées par l’expression cytokinique des récepteurs GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 et des récepteurs de chimiokines C-X-C de type 4 ou CXCR6 ^1,2. STAT et/ou la voie NF-κB sont essentielles pour la différenciation de la lignée Th-GM. Une méthode in vitro a été mise au point pour différencier les lymphocytes T CD4 naïfs en cellules Th-GM à l’aide de l’IL-7 en présence de stimuli TCR⁶. Pendant ce temps, il a été démontré que les cytokines IL-23 et IL-1β maintiennent l’expression et la pathogénicité des cellules Th-GM ex vivo ^3,7.

L’élévation des cellules Th-GM a été associée à plusieurs maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques et la polyarthrite rhumatoïde ^2,8,9, suggérant un rôle potentiel dans la pathogenèse de l’auto-immunité¹⁰. De plus en plus de preuves suggèrent que le GM-CSF peut fonctionner comme un médiateur inflammatoire. Des souris surexprimant génétiquement Csf2 (gène codant pour le GM-CSF) dans les lymphocytes T CD4⁺ ont spontanément développé des déficits neurologiques accompagnés de l’infiltration de phagocytes dans le système nerveux central. Dans un modèle de colite par transfert de lymphocytes T, le transfert adoptif de lymphocytes T Csf2^−/− dans des souris Rag1^−/− a considérablement réduit les caractéristiques cliniques et histopathologiques de la maladie. Cependant, il existe peu de rapports sur les rôles du sous-ensemble Th-GM dans les maladies allergiques, telles que l’ACD.

L’ACD est l’une des affections dermatologiques inflammatoires les plus courantes, avec une prévalence élevée dans les environnements de travail et de vie^11,12. Il s’agit d’une réponse d’hypersensibilité de type retardé de type IV médiée par un circuit immunitaire intact qui se développe en deux phases temporellement segmentées : la sensibilisation et l’élicitation. La DCA humaine est déclenchée par l’exposition à certains produits chimiques (haptènes ou métaux) qui entraînent une sensibilisation. Au cours de cette phase, une réponse médiée par les lymphocytes T est amorcée par des complexes haptène-protéine présentés par les cellules présentatrices d’antigènes. Lors d’une exposition ultérieure au même haptène, les lymphocytes T effecteurs et mémoires spécifiques aux haptènes sont réactivés et se localisent dans la peau, un processus impliquant l’infiltration d’une variété de populations de cellules immunitaires. Cette réponse inflammatoire aiguë est connue sous le nom d’élicitation, entraînant le développement complet des lésions¹³. La DCA humaine peut être étudiée à l’aide de modèles animaux d’hypersensibilité de contact (CHS)¹⁴.

Le modèle CHS induit par un haptène organique réactif, de faible poids moléculaire, le 2,4-dinitrofluorobenzène (DNFB), est un modèle murin couramment utilisé qui a été utilisé dans l’étude de la pathologie ainsi que dans les interventions thérapeutiques potentielles de l’ACD^15,16. Ainsi, ce modèle dépendant des lymphocytes T pourrait être appliqué pour étudier la génération du sous-ensemble Th-GM dans les maladies allergiques. Ici, nous avons induit un modèle murin de SHC avec DNFB, analysé la génération de Th-GM dans les lésions et les ganglions lymphatiques drainants, et constaté que le sous-ensemble de Th-GM était principalement élargi lors de la réexposition au même haptène. Cela suggère que le sous-ensemble Th-GM pourrait être essentiel au développement de l’ACD et représente une cible thérapeutique spécifique dans l’ACD.

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Protocole

Toutes les souris utilisées dans ce protocole étaient sur le fond génétique C57BL/6, maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes et fournies avec de la nourriture et de l’eau à volonté. Toutes les expériences ont été approuvées par l’organisme d’examen éthique du bien-être animal du Centre médical de Chine occidentale de l’Université du Sichuan (20210302059).

1. Préparation des réactifs et des matériaux

1. Solution DNFB à 0,5 % comme sensibilisant
   1. Pour la sensibilisation de 10 souris, préparer 1,1 mL de mélange acétone/huile d’olive 4:1 (v/v) : en mélangeant 880 μL d’acétone et 220 μL d’huile d’olive pour permettre à 0,1 mL de volume excédentaire de tenir compte de toute perte de volume mineure. Ajouter 5 μL de DNFB à 1,1 mL de mélange homogénéisé d’acétone/huile d’olive 4:1.
      REMARQUE : Préparer fraîchement le jour de la sensibilisation. Le mélange d’acétone et d’huile d’olive doit être préparé dans une hotte.
2. 0,2 % La solution DNFB comme challenger
   1. Pour défier 10 souris, ajoutez 0,5 μL de DNFB dans 0,25 mL d’un mélange homogénéisé d’acétone/huile d’olive 4:1 décrit à l’étape 1.1. Utilisez le mélange d’acétone/huile d’olive 4:1 comme véhicule lorsque vous défiez les souris après la sensibilisation.
      REMARQUE : Le mélange d’acétone / huile d’olive doit être préparé dans une hotte.
3. Hydrate de chloral comme anesthésique
   1. Dissoudre 4 g d’hydrate de chloral dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir une solution de travail à 8 %. Filtrer et conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois. Utilisez 5 μL par g de poids corporel pour une souris.
4. 50x crosse IV de collagénase
   1. Dissoudre 100 mg de collagénase IV dans 1 mL de milieu de base RPMI 1640 (non complété par des antibiotiques ou du sérum fœtal bovin [FBS]) pour obtenir un stock de 100 mg/mL. Conserver à -20 °C dans des aliquotes de 100 μL jusqu’à 6 mois.
5. 1 000x stock DNase I
   1. Dissoudre 5 mg de DNase I dans 1 mL de NaCl 0,15 M pour obtenir un stock de 5 mg/mL. Conserver à -20 °C dans des aliquotes de 100 μL jusqu’à 6 mois.
6. Tampon d’arrêt
   1. Dissoudre 1,681 g d’EDTA dans 50 mL de milieu de base RPMI 1640 pour obtenir un stock de 100 mM. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
7. Milieu de lavage
   1. Dissoudre 0,372 g d’EDTA à une concentration finale de 2 mM et 5 mL de FBS à une concentration finale de 1 % avec 500 mL de PBS. Filtrer et conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
8. Tampon de coloration
   1. Dissoudre 0,372 g d’EDTA à une concentration finale de 2 mM et 10 mL de FBS à une concentration finale de 2 % avec 500 mL de PBS. Filtrer et conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
9. Réactifs de restimulation
   1. Dissoudre 1 mg de 12-myristate 13-acétate (PMA) de phorbol dans 20 mL de DMSO pour obtenir un bouillon de 50 μg/mL (500x) et le conserver à -20 °C dans des aliquotes de 50 μL.
   2. Diluer 250 μL d’ionomycine en solution (4 mg/mL) dans 7,75 mL de DMSO pour obtenir une quantité de 500 μg/mL (500x) et la conserver à -20 °C dans des aliquotes de 50 μL.
   3. Aliquote 1 mL de solution inhibitrice du transport des protéines (contenant de la bréfeldine A) dans 50 μL et stocker les aliquotes à 4 °C.

2. Induction de la SHC chez la souris

1. Au jour -5, anesthésier les souris en injectant 400 mg/kg d’hydrate de chloral par voie intrapéritonéale.
2. À l’aide d’un rasoir pour animaux, rasez une zone de 2 cm × 2 cm sur l’abdomen de la souris.
   REMARQUE : Évitez de gratter la peau de la souris ; Conservez l’intégrité de la barrière cutanée intacte.
3. Étalez doucement et uniformément 100 μL de solution de DNFB à 0,5 % sur les abdomens rasés à l’aide d’une micropipette à embouts jetables. Tenez les souris 5 à 10 s pour permettre à une partie du solvant de s’évaporer.
4. Le jour -4, répéter les étapes 2.1 à 2.3 pour une autre sensibilisation.
   REMARQUE : Deux événements de sensibilisation fonctionnent mieux qu’un.
5. Le jour 0, testez l’oreille droite des souris avec 20 μL de DNFB à 0,2 % à l’aide d’un micropipettor avec des embouts jetables, et traitez l’oreille gauche avec le même volume de mélange d’acétone et d’huile d’olive 4:1 que le véhicule.
   REMARQUE : Défiez les côtés dorsal et ventral de l’oreille avec des volumes égaux de DNFB ou de véhicule.
6. Au cours des 3 prochains jours, mesurez quotidiennement l’épaisseur de l’oreille droite et de l’oreille gauche des souris à l’aide d’un cadran et calculez l’augmentation de l’épaisseur de l’oreille : épaisseur de l’oreille droite - épaisseur de l’oreille gauche.
   REMARQUE : Une augmentation progressive de l’épaisseur de l’oreille a pu être observée dans 0,2 % des oreilles de souris déficient par rapport aux oreilles traitées en véhicule.

3. Prélèvement d’échantillons de souris CHS

1. Au jour 3, anesthésier les souris par une injection intrapéritonéale de 400 mg/kg d’hydrate de chloral. Attendez 5 à 10 minutes pour que la souris soit dans un état d’inconscience et effectuez un léger pincement des orteils sur les deux pattes arrière pour confirmer que les souris sont profondément anesthésiées.
2. Prenez une photo de chaque oreille par souris à l’aide d’un appareil photo. Noter l’incrustation (desquamation sur l’oreille) et la rougeur de l’oreille (érythème sur l’oreille) indépendamment pour évaluer la gravité de l’inflammation sur une échelle de 0 à 5 : 0, aucun ; 1, léger ; 2, modérée ; 3, marqué ; 4, très marqué ; 5, le plus grave.
3. Euthanasier la souris par luxation cervicale. Coupez toute l’oreille et disséquez les ganglions lymphatiques drainants parallèles des souris à l’aide de ciseaux tranchants stériles et de pinces. Placez les tissus dans un puits d’une plaque à 6 puits placée sur de la glace contenant 5 mL de PBS pré-réfrigéré pour la dissociation enzymatique ou physique afin de générer des suspensions unicellulaires (figure supplémentaire S1A et figure supplémentaire S2A).
4. Pour l’analyse histologique, fixez les échantillons d’oreille dans du paraformaldéhyde à 4 %, déshydratez-les et incorporez-les dans de la paraffine pour une coloration immunohistochimique, comme décrit ailleurs¹⁷.

4. Préparation de la suspension unicellulaire à partir d’oreilles

1. Fendez les côtés ventral et dorsal de l’oreille en pinçant et en déchirant les extrémités coupées avec deux pinces incurvées (figure supplémentaire S1B). Placez-les dans un puits d’une plaque à 6 puits contenant 4,5 ml de tampon de digestion, en veillant à ce que ces tissus soient complètement immergés dans le tampon de digestion (figure supplémentaire S1C).
   REMARQUE : Le tampon de digestion était composé de RPMI 1640 contenant 10 % de FBS + 25 mM d’HEPES + 2 mg/mL de collagénase IV + 5 μg/mL de DNase I.
2. Incuber les feuillets d’oreille dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 20 min. Coupez les feuillets d’oreille avec des ciseaux aussi petits que possible pour faciliter la digestion des tissus (figure supplémentaire S1D), et remettez l’échantillon dans l’incubateur pendant encore 40 minutes.
   REMARQUE : Une digestion efficace peut être obtenue en 40-50 min. Une surdigestion à 37 °C affecte la viabilité cellulaire.
3. Ajouter 0,5 mL de tampon d’arrêt par puits pour neutraliser les activités enzymatiques de la collagénase IV et de la DNase I. Effectuez les étapes suivantes sur de la glace.
4. Transférez les fragments de tissu de l’oreille à l’aide d’une paire de pinces incurvées dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant une crépine cellulaire de 70 μm et pipetez tout le volume du milieu dans la même crépine cellulaire.
5. Perturbez les tissus à l’aide de l’extrémité supérieure d’un piston de seringue de 1 ml. Appuyez en mouvements circulaires contre la crépine cellulaire de 70 μm jusqu’à ce qu’il ne reste que des tissus conjonctifs blancs (figure supplémentaire S1D).
6. Rincez deux fois les crépines cellulaires avec 1 000 μL de produit de lavage. Transférez tout le volume du puits dans un tube à centrifuger de 50 mL à travers une crépine à cellules de 40 m. Gardez le tube sur de la glace.

5. Préparation de suspensions unicellulaires à partir de ganglions lymphatiques drainants (dLN)

1. Transférez les ganglions lymphatiques à l’aide d’une paire de pinces incurvées dans une crépine cellulaire de 70 μm au-dessus du puits d’une plaque à 6 puits (figure supplémentaire S2B). Dissociez les ganglions lymphatiques à l’aide de l’extrémité supérieure d’un piston de seringue de 1 ml. Appuyez en cercles contre la crépine de 70 μm jusqu’à ce qu’il ne reste que des débris blancs (figure supplémentaire S2C).
2. Rincez deux fois la crépine cellulaire avec 1 000 μL de produit de lavage. Transférez tout le volume du puits dans un tube de 5 ml. Gardez les tubes sur de la glace.

6. Restimulation du sous-ensemble Th-GM avec du 12-myristate 13-acétate (PMA)/ionomycine en présence d’un inhibiteur du transport des protéines

1. Centrifuger les cellules isolées de l’oreille et des ganglions lymphatiques drainants pendant 8 min à 400 × g à 4 °C et jeter le surnageant. Remettez doucement la pastille en suspension avec 1 000 μL de produit de lavage.
2. Prélevez une petite partie de chaque échantillon pour compter le nombre total de cellules dérivées de l’oreille et du ganglion lymphatique drainant à l’aide d’un hémocytomètre. Ajouter 0,04 % de bleu trypan pour mesurer la viabilité cellulaire.
   REMARQUE : La viabilité cellulaire doit être supérieure à 60 % pour la stimulation et l’analyse ultérieures des lymphocytes T. La densité cellulaire pourrait être de 1-5 × 10⁶/mL.
3. Centrifugez les cellules à l’étape 6.1 et jetez le surnageant. Remettre doucement la pastille en suspension avec 1 000 μL de milieu RPMI 1640 contenant 2 % de FBS, et semer 1 mL de suspension unicellulaire (10^{6 cellules} /mL) dans des plaques de culture de tissus à fond plat à 12 puits.
4. Ajouter 2 μL de phorbol-12-myristate 13-acétate (PMA) (concentration finale de 100 ng/mL), 2 μL d’ionomycine (concentration finale de 1 000 ng/mL) et 1 μL d’inhibiteur de transport des protéines (contenant de la Brefeldin A) dans chaque puits de la plaque de 12 puits contenant 1 mL de suspension unicellulaire au-dessus et incuber à 37 °C pendant 4 h.

7. Analyse des sous-ensembles de Th-GM générés in vivo par coloration à la surface cellulaire et intracellulaire

1. Transférez les cellules stimulées dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL à l’aide d’une pipette. Centrifugez les tubes de fermentation pendant 8 min à 400 × g à température ambiante et jetez le surnageant.
2. Lavez une fois la pastille cellulaire avec 1 mL de tampon de coloration et granulez les cellules par centrifugation, comme décrit à l’étape 7.1. Remettre les cellules en suspension à 1-10 × 10⁶/mL dans 0,5 mL de tampon de coloration.
3. Ajouter immédiatement 0,5 μL de solution mère de colorant de viabilité (voir le tableau des matériaux) à 0,5 mL de suspension cellulaire et vortex. Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité. Lavez les cellules deux fois avec 1 mL de tampon de coloration et répétez la centrifugation à l’étape 7.1 pour granuler les cellules.
4. Remettre la pastille en suspension dans 0,1 mL de tampon de coloration. Ajoutez 1 μL d’anticorps anti-CD4 (conjugué à la FITC), 1 μL d’anticorps anti-CD44 (conjugué à l’APC) et 1 μL d’anticorps anti-CD62L (conjugué PE/Cyanine7) à trois aliquotes de 0,1 mL de suspension cellulaire. Vortex immédiatement et incuber à température ambiante pendant 15 min, à l’abri de la lumière.
5. Répétez les lavages et la centrifugation à l’étape 7.3.
6. Remettre la pastille en suspension dans 200 μL de tampon de fixation IC et incuber pendant 20 min dans l’obscurité. Pendant ce temps, préparez le tampon de perméabilisation (1x) en diluant 1 partie de tampon de perméabilisation (10x) avec 9 parties d’eau distillée. Laver les cellules deux fois avec 1 mL de tampon de perméabilisation (1x) par centrifugation à 600 × g pendant 5 min à température ambiante.
7. Remettre la pastille en suspension dans 0,1 mL de tampon de perméabilisation (1x) avec des anticorps contre le GM-CSF (conjugué au PE, 1 μL/test), l’IFN-γ (conjugué au BV711, 1 μL/test), l’IL-17A (conjugué au BV421, 1 μL/test) et l’IL-22 (conjugué au PerCP/cyanine5.5, 5 μL/test) et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l’obscurité.
8. Répétez les lavages et la centrifugation à l’étape 7.6.
9. Remettez la pastille en suspension dans 200 μL de PBS et transférez la suspension dans un tube à essai à fond rond. Faites passer les cellules colorées dans un cytomètre en flux.

8. Stratégie de contrôle pour identifier le sous-ensemble Th-GM

1. Analysez les données de cytométrie en flux (voir la Table des matériaux pour plus de détails sur le logiciel utilisé) à l’aide de la stratégie de contrôle illustrée à la figure supplémentaire S1. Pour le logiciel utilisé ici, téléchargez-le et configurez-le sur l’ordinateur.
2. Importez les données de cytométrie en flux en cliquant sur Fichier |Ouvrir | Importez des fichiers FCS dans le logiciel et annotez le groupe et le nom de chaque échantillon en sélectionnant l’onglet Renommer .
3. Choisissez les lymphocytes sur un graphique FSC en fonction d’un graphique SSC (FSC ^faible , SSC ^faible, P1) pour exclure les débris trouvés dans le coin inférieur gauche et les cellules myéloïdes de grande taille et de granularité élevée en cliquant sur le graphique de densité, et montrez l’axe X de ce graphique comme FSC-A et l’axe Y comme SSC-A.
4. Double-cliquez sur les événements de P1 pour générer un autre graphique de densité et séparez les cellules individuelles (illustrées par une ligne corrélée, P2) des agrégats de cellules en sélectionnant la hauteur et l’aire de la cellule dans ce graphique (axe X en tant que FSC-A ou axe Y en tant que FSC-H).
5. Double-cliquez sur les événements dans P2 pour générer un autre graphique de densité et afficher l’axe X de ce graphique sous la forme FSC-A et l’axe Y sous la forme SSC-A. Gate les populations cellulaires viables à l’aide des événements FVS 780^- (P3).
6. Double-cliquez sur les événements dans P3 pour générer le graphique de densité suivant ( l’axe X en tant que CD4-A et l’axe Y en tant que SSC-A) et distinguez les cellules T CD4 en choisissant la population CD4⁺ (P4).
7. Double-cliquez sur les événements dans P4 pour générer un autre graphique de densité (l’axe X comme CD44-A et l’axe Y comme CD62L-A), et définissez les cellules d’assistance effecteur T en choisissant la population en haut à droite de ce graphique (CD62L^- CD44⁺, P5).

9. Analyse statistique

1. Effectuez des analyses statistiques en comparant deux groupes à l’aide d’un test t non apparié. *P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 et **** P < 0,0001 (moyenne ± écart-type).

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Résultats

CHS (hypersensibilité de contact) induite par DNFB chez la souris
Pour induire la SHC chez les souris, les souris ont été sensibilisées et testées avec du DNFB appliqué sur la peau de l’oreille, comme l’illustre la figure 1A. L’épaisseur de l’oreille, un indicateur de spongiose épidermique, a été nettement augmentée chez les souris exposées à un DNFB par rapport aux souris traitées par véhicule (

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Discussion

Ce protocole fournit un test in vivo simple pour analyser la génération et l’expansion du sous-ensemble de cellules Th-GM. Il est essentiel d’utiliser un modèle de maladie médiée par les lymphocytes T chez la souris initiée par des haptènes ou des antigènes, imitant cette activation chez l’homme. Le DNFB est une petite molécule haptène qui est plus économique et plus rapide que les antigènes peptidiques ou protéiques pour déclencher la réponse immunitaire de...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dinitrofluorobenzene	BT REAGENT	P0001746	CAS NO: 70-34-8
Acetone	CHRON CHEMICALS	/	67-64-1
anti-CD4 antibody	Biolegend	300506	1:100 Diluted
anti-CD44 antibody	Biolegend	103012	1:100 Diluted
anti-CD62L antibody	Biolegend	104417	1:100 Diluted
anti-GM-CSF antibody	BD Bioscience	554507	1:100 Diluted
anti-IFN-γ antibody	Biolegend	505836	1:100 Diluted
anti-IL-17A antibody	BD Bioscience	563354	1:100 Diluted
anti-IL-22 antibody	Biolegend	516411	5 µL/test
CD45	Biolegend	103101	1:200 Diluted
Chloral hydrate	CHRON CHEMICALS	/	302-17-0
Dial thickness gauge (0.01 mm type)	PEACOCK	G-1A	/
DMSO	LIFESCIENCES	D8371	67-68-5
EDTA Na2	Solarbio	E8030	6381-92-6
F4/80	Biolegend	123102	1:200 Diluted
Fixable Viability Stain 780	BD Bioscience	565388	1:1,000 Diluted, viability dye
Flow cytometer	BD Bioscience	BD FACS ARIA II SORP	/
GraphPad Prism	GraphPad Software	Prism 7	Software for statistics and graphing
Intracelluar Fixtation and Permeablization Buffer Set	Thermo Fisher	88-8824-00	prepared freshly
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407951	CAS NO: 56092-81-0
Ly6G	Biolegend	127602	1:200 Dilutied
NovoExpress	Agilent	/	Software for flow cytometry data analysis; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Olive oil	YUANYE BIO	S30503	8001-25-0
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	CAS NO: 16561-29-8
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Bioscience	555029	1 µL/mL