JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم عرض بروتوكول للفحص المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM). تستخدم LR-ExM مجموعة جديدة من المراسي ثلاثية الوظائف ، والتي توفر كفاءة أفضل في وضع العلامات مقارنة بمجهر التوسع التي تم إدخالها سابقا.

Abstract

المجهر التوسعي (ExM) هو تقنية تحضير العينات التي يمكن دمجها مع معظم طرق الفحص المجهري الضوئي لزيادة الدقة. بعد تضمين الخلايا أو الأنسجة في هيدروجيل قابل للتضخم ، يمكن توسيع العينات فيزيائيا من ثلاثة إلى ستة عشر ضعفا (البعد الخطي) مقارنة بالحجم الأصلي. لذلك ، يتم زيادة الدقة الفعالة لأي مجهر بواسطة عامل التوسع. أحد القيود الرئيسية على ExM الذي تم إدخاله سابقا هو تقليل التألق بعد البلمرة وإجراء الهضم. وللتغلب على هذا القيد، تم تطوير الفحص المجهري لتوسيع نطاق الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM)، الذي يمنع فقدان الإشارة ويعزز إلى حد كبير كفاءة وضع العلامات باستخدام مجموعة من المراسي ثلاثية الوظائف الجديدة. تسمح هذه التقنية للمرء بتحقيق دقة أعلى عند التحقيق في الهياكل الخلوية أو دون الخلوية على نطاق نانومتري مع الحد الأدنى من فقدان إشارة الفلورسنت. يمكن استخدام LR-ExM ليس فقط لوضع العلامات على التألق المناعي ، ولكن أيضا مع علامات البروتين ذاتية الوسم ، مثل علامات SNAP و CLIP ، وبالتالي تحقيق كفاءة أعلى في وضع العلامات. يقدم هذا العمل الإجراء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا النهج القائم على التلطيخ المناعي ، بالإضافة إلى مناقشة نهج وضع العلامات الذاتية ل LR-ExM كبديل.

Introduction

تم استخدام المجهر التوسعي (ExM) من قبل الباحثين منذ تقديمه لأول مرة كنهج مناسب لتحقيق تصوير فائق الدقة باستخدام المجاهر التقليدية ، مثل المجاهر فوق الفلورية والمجاهر البؤرية1،2،3،4،5،6،7 . باستخدام ExM ، من الممكن تحقيق دقة جانبية ~ 70 نانومتر حتى مع المجاهر البؤرية العادية. عندما يتم دمج ExM مع التصوير فائق الدقة ، يتم تحسين الدقة بشكل أكبر. على سبيل المثال ، يمكن للمرء تحقيق دقة 30 نانومتر تقريبا باستخدام مجهر الإضاءة المنظم (SIM) ، ودقة 4 نانومتر تقريبا باستخدام مجهر إعادة الإعمار البصري العشوائي (STORM) 1,5.

ومع ذلك ، فإن كفاءة وضع العلامات المنخفضة هي مشكلة حرجة في طرق ExM القياسية. يمكن أن يختلف فقدان التألق بناء على نوع مجموعات الفلورسنت ووقت الهضم. ومع ذلك ، في المتوسط ، تم الإبلاغ عن فقدان أكثر من 50٪ من الفلوروفورات بعد البلمرة وخطوات هضم البروتين في ExM ، مما يضر بجودة التصوير 3,4.

وهكذا، تم تطوير الفحص المجهري لتوسيع نطاق الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM)، والذي يمكنه الاحتفاظ بالملصقات بكفاءة وتقليل فقدان الإشارة1. الابتكار الرئيسي ل LR-ExM هو استخدام مجموعة من المراسي ثلاثية الوظائف بدلا من مجرد استخدام أصباغ الفلورسنت - كما هو الحال في إجراء ExM القياسي - لتلطيخ البروتينات ذات الأهمية. تتكون هذه الروابط ثلاثية الوظائف من ثلاثة أجزاء: (1) الموصل (على سبيل المثال ، N-hydroxysuccinimide (NHS)) للاتصال بالجسم المضاد ، (2) المرساة (على سبيل المثال ، ميثاكريلاميد (MA)) لتثبيت البروتينات على البوليمر ، و (3) المراسل (على سبيل المثال ، البيوتين أو الديجوكسيجينين (DIG)) للاقتران بصبغة عضوية. تنجو المراسي ثلاثية الوظائف من خطوات البلمرة وهضم البروتين ، وبالتالي تمنع فقدان الفلوروفور.

علاوة على ذلك ، تحمل هذه الطريقة إمكانات كبيرة لأنها متوافقة مع العلامات الأنزيمية ذاتية التصنيف مثل SNAP أو CLIP. نهج العلامة الأنزيمية لها بعض الفوائد على نهج تلطيخ المناعة فيما يتعلق بالخصوصية العالية وكفاءة وضع العلامات8،9،10.

في هذه المخطوطة، يظهر إجراء مفصل ل LR-ExM. LR-ExM هي طريقة فعالة ومرنة للغاية لتحقيق دقة مكانية عالية مع تحسين كفاءة وضع العلامات.

Protocol

1. زراعة الخلايا

  1. استخدم خلايا U2OS المستزرعة في وسط 5A من McCoy مع 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
  2. خلايا الاستزراع على 16 غطاء زجاجي قابل للإزالة بشكل جيد (منطقة الاستزراع 0.4 سم2) لسهولة التعامل.

2. التثبيت والنفاذية

ملاحظة: تعتمد ظروف التثبيت والنفاذية على بروتوكولات التلطيخ المناعي المحسنة. فيما يلي بروتوكول التثبيت والتخلل للنبيبات الدقيقة المناعية المشتركة والحفر المطلية بالكلاثرين (CCPs).

  1. بمجرد أن يصل عدد الخلايا إلى ~ 0.04 × 10 6 ، قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 100 ميكرولتر من 3.2٪ paraformaldehyde (PFA) في المخزن المؤقت PEM (أنابيب 100 mM ، 1 mM EGTA ، و 1 mM MgCl2 ، الرقم الهيدروجيني6.9) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (الجدول 1).
    ملاحظة: يتم إجراء التثبيت باستخدام PFA في غطاء أمان معتمد.
  2. اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 200 ميكرولتر من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS).
  3. تخلل الخلايا مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (الجدول 1).
    ملاحظة: تابع وضع العلامات في أقرب وقت ممكن لتجنب البروتين المستهدف أو الحمض النووي الريبي أو تدهور الحمض النووي ، والحصول على النتيجة المثلى. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين العينات الثابتة لفترة طويلة (تصل إلى شهر) في مخزن مؤقت PBS عند 4 درجات مئوية. استبدل أي PBS متبخر وقم بحماية العينة من التبييض الضوئي.

3. الستربتافيدين الذاتية المنشأ ومنع البيوتين

  1. احتضان الخلايا بمحلول الستربتافيدين المخفف في مخزن مؤقت لحجب الخلايا (100 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الجدول 1).
  2. شطف لفترة وجيزة مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت حجب الخلايا.
  3. احتضان الخلايا مع 100 ميكرولتر من محلول البيوتين المخفف في مخزن مؤقت لمنع الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: عند استخدام نهج وضع العلامات الذاتي التصنيف، مثل استخدام علامات SNAP أو CLIP، تخطي الخطوة 4، وانتقل إلى الخطوة 5.1: نهج وضع العلامات على التسمية الذاتية.

4. تلطيخ الأجسام المضادة الأولية

  1. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد للفئران المضادة α-توبولين (تخفيف 1:500) والأجسام المضادة المضادة للأرنب المضادة للكلاثرين ذات السلسلة الثقيلة (تخفيف 1:100) في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحجب الخلايا لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية أو 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. مضاعفة وقت الحضانة لعينات الأنسجة.
  2. اغسل العينات أربع مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.

5. LR-ExM محددة تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية

  1. اقترن الأجسام المضادة IgG مع الروابط ثلاثية الوظائف مثل N-hydroxysuccinimide (NHS) - ميثاكريلاميد (MA) - البيوتين أو NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (الشكل 1B). تم إدخال توليف المراسي ثلاثية الوظائف واقتران الأجسام المضادة الثانوية سابقا في Shi et al.1. نهج وضع العلامات الذاتي: اقتران الأجسام المضادة IgG مع الروابط ثلاثية الوظائف ، مثل MA- البنزيل الغوانين (BG) - البيوتين أو MA- البنزيلسيتوزين (BC) - الحفر (الشكل 1B). تم إدخال توليف المراسي ثلاثية الوظائف واقتران الأجسام المضادة الثانوية سابقا في Shi et al.1.
  2. احتضان الخلايا مع الحمار المضاد للأرانب-Dig-MA (تخفيف 1:100) والحمار المضاد للفئران البيوتين-MA (1:100 تخفيف) الأجسام المضادة الثانوية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحجب الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ضاعف وقت الحضانة هذا لعينات الأنسجة.
  3. اغسل العينات أربع مرات في 200 ميكرولتر من PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.

6. إرساء إضافي

  1. احتضان الخلايا مع 0.25٪ glutaraldehyde (GA) في PBS (100 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من أجل تثبيت البروتينات على هيدروجيل. بدلا من ذلك ، استخدم 25 mM حمض الميثاكريليك N-hydroxysuccinimide ester (MA-NHS) للتثبيت. يتم تشجيع الحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  2. اغسل العينات ثلاث مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.

7. الهلام

ملاحظة: يتم تحديد سرعة التمدد من خلال وقت انتشار الملح والماء خارج أو في الجل. وبالتالي ، فإن صب المواد الهلامية الرقيقة يسرع وقت التوسع.

  1. قم بإزالة الهيكل العلوي للوحة الجل المكونة من 16 بئرا. أضف 40 ميكرولتر من محلول المونومر إلى كل بئر لتكييف الخلايا على الجليد. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
    1. لإعداد حل مونومر، انظر الجدول 2.
  2. تحضير محلول التبلور على الجليد. أضف الماء المقطر المزدوج ومسرع 10٪ N ، N ، N ′ ، N ′ رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) إلى محلول المونومر (10٪ TEMED: محلول المونومر = 1:47) ؛ لا تقم بإضافة البادئ بعد (الجدول 3).
  3. بالنسبة لغرفة زراعة الخلايا التي تبلغ مساحتها 0.4 سم2 ، استخدم حجم محلول هلام يبلغ حوالي 40 ميكرولتر.
  4. أضف 10٪ من بيرسلفات الأمونيوم (APS) إلى محلول الهلام ، واحتضن على الجليد ، وقم على الفور بماصة 40 ميكرولتر من محلول الهلام في كل طوقا سيليكون جيدا على الجليد. احتضان على الجليد لمدة 3 دقائق (10٪ APS: 10٪ TEMED: محلول مونومر = 1: 1: 47).
  5. احم العينة من الضوء وانقل الغطاء الزجاجي في طبق بتري 10 سم إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للتبلور. للحفاظ على رطوبة الجل أثناء حضانة 37 درجة مئوية ، قم بتغطية طبق بتري بالغطاء ، ووضع بضع قطرات من الماء في طبق بتري.

8. الهضم

  1. بعد التبلور ، قم بإزالة الزجاج لفصل الجل ونقل الجل إلى 6 أطباق جيدة. هضم الخلايا المدمجة مع 2 مل من مخزن الهضم المؤقت (الجدول 1) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. استخدم ما لا يقل عن 10 أضعاف الحجم الزائد من المخزن المؤقت للهضم.
  2. اغسل المواد الهلامية بحجم زائد من الماء لا يقل عن 10 أضعاف حجم الجل النهائي. كرر خطوة الغسيل أربع مرات لمدة 20 إلى 30 دقيقة في كل مرة. يتوسع الجل بحوالي ضعفين في كل بعد.
    ملاحظة: يمكن تخزين عينات الجل لمدة تصل إلى 1 شهر في مخزن مؤقت PBS عند 4 درجات مئوية. استبدل أي ماء متبخر لتجنب التجفيف، وقم بحماية العينة من الضوء أثناء التخزين. لتجنب تدهور المراسي ثلاثية الوظائف ، يجب تلطيخ العينات في أقرب وقت ممكن بعد الهضم والغسيل.

9. تلطيخ التألق بعد الهضم

  1. احتضان المواد الهلامية في حجم 2 مل من الستربتافيدين (STV) / الديجوكسيجينين (DIG) العازلة تلطيخ مع 2 إلى 5 ميكرومتر STV-صبغة و / أو المضادة ل DIG-dye لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بالعينات في الظلام.

10. التوسع

  1. اغسل الجل وقم بتوسيعه أربع مرات بالماء الزائد (2-3 مل) لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة في كل مرة.
  2. لتسهيل تصور الخلايا تحت المجهر الفلوري ، قم بتلطيخ الخلايا باستخدام DAPI خلال ثلث عمليات الغسيل الخمسة. تخفيف تركيز مخزون DAPI (5 ملغ / مل ، مخزنة عند 4 درجات مئوية) في 1: 5000 تخفيف في مياه الغسيل. احتضن الجل بمحلول ماء DAPI (2 مل) لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
  3. اغسل مرتين إضافيتين ب 3 مل من الماء.
  4. قم بتوسيع المواد الهلامية في أي طبق مسطح كبير بما يكفي لاحتواء العينات. المواد الهلامية الموسعة التي يتم إعدادها على 0.4 سم2 منطقة coverglass تناسب بشكل جيد في لوحة زجاجية سفلية 6 آبار.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات الملطخة بعد التمدد لمدة تصل إلى 4 أشهر في مخزن مؤقت PBS عند 4 درجات مئوية، وأضف كمية كافية من الماء لتجنب التجفيف وحماية العينة من التبييض الضوئي. كرر خطوة التوسيع وتلطيخ DAPI قبل التصوير. لتجنب أي خطر من تدهور الفلوروفور ، يجب تصوير العينات في أقرب وقت ممكن.

11. التصوير

  1. قم بتغطية غرفة التصوير ذات القاع الزجاجي المكون من 6 آبار بنسبة 0.01٪ من البولي إل-ليسين (3 مل لكل منهما) لشل حركة عينات الجل.
  2. انقل عينات الجل إلى غرفة التصوير المطلية.
  3. صور العينات مع أي نطاقات التألق المطلوبة.

النتائج

الحفر المطلية بالكلاثرين (CCPs) ملطخة بالمناعة باستخدام مراسي ثلاثية الوظائف (الشكل 1B) ويتم تنفيذ LR-ExM كما هو موضح في الشكل 1A. وتبين LR-ExM (الشكل 2C,E) كثافة تألق أعلى بكثير مقارنة بالفحص المجهري لتوسع الاحتفاظ بالبروتين (proExM، الشكل 2A) أو البيوتين-ExM (

Discussion

الابتكار الرئيسي ل LR-ExM هو استخدام المراسي ثلاثية الوظائف لتسمية البروتينات المستهدفة بفعالية وتحسين جودة الصورة. هذه الطريقة محدودة بالمراسي ثلاثية الوظائف ، والتي ليست متاحة بسهولة للباحثين. ومع ذلك ، يمكن مشاركة المراسي ثلاثية الوظائف مع باحثين آخرين عند الطلب ، وتتوفر الآن منتجات مم?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (R00 GM126136 to X.S.) والمؤسسة الوطنية الأمريكية للعلوم (DMS1763272 to S.P.) ومؤسسة سيمونز (594598 إلى S.P).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylamide Sigma A9099 ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearchH+L, 711–005-152Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson ImmunoResearchH+L, 712–005-153Antibody
Alexa Fluor 488-StreptavidinJackson ImmunoResearch016-540-084Fluorescent probes 
Alexa Fluor 594 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-580-084Fluorescent probes 
Alexa Fluor 647 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-600-084Fluorescent probes 
Ammonium Persulfate Sigma A3678 ExM Gel
anti-H3K4me3Abcamab8580Antibody
anti-H3K9me3Abcamab176916Antibody
DAPI dilacetateThermofisher ScientificD3571Fluorescent probes 
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)Vector LaboratoriesDI-7488Fluorescent probes 
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)Vector LaboratoriesDI-7594Fluorescent probes 
EGTAEMD Millipore Corp.324626-25GMFixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma EDTADigestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM GradeElectron Microscopy Sciences50-262-13Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglassGrace Bio-Labs GBL112358-8EACell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal toolGrace Bio-Labs GBL103259Removal tool
Guanidine HCl Sigma G3272 Digestion buffer
Magnesium chlorideSigmaM8266-1KGFixation buffer
McCoy's 5aATCC30–2007Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)Sigma 730300-1GAnchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibodyAbcamab24700Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide Sigma M7279 ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma T7024 ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionsElectron Microscopy Sciences50-980-487Fixation buffer
PIPESSigmaP6757-25GFixation buffer
Poly-L-LysineSigmaP8920-100MLChamber coating
Proteinase K Sigma-AldrichP4850-5MLDigestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibodyAbcamab21679Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2Millipore SigmaMAB1864-IAntibody
Sodium Acrylate Sigma408220ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kitVector LaboratoriesSP-2002Blocking buffer
Tris-HCl Life Technologies AM9855 Digestion buffer
U2OSATCCHTB-96Cell line
6 well glass bottom platesCellvisP06-1.5H-NImaging plate

References

  1. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067 (2021).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  4. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  5. Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  9. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  10. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  11. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
  13. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

188SNAP tag

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved