La microscopia a espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM) consente l'imaging a super-risoluzione e l'etichettatura ad alta efficienza

Riepilogo

Viene dimostrato un protocollo di microscopia ad espansione di ritenzione dell'etichetta (LR-ExM). LR-ExM utilizza un nuovo set di ancoraggi trifunzionali, che fornisce una migliore efficienza di etichettatura rispetto alle microscopie di espansione introdotte in precedenza.

Abstract

La microscopia ad espansione (ExM) è una tecnica di preparazione del campione che può essere combinata con la maggior parte dei metodi di microscopia ottica per aumentare la risoluzione. Dopo aver incorporato cellule o tessuti in idrogel gonfiabile, i campioni possono essere fisicamente espansi da tre a sedici volte (dimensione lineare) rispetto alla dimensione originale. Pertanto, la risoluzione effettiva di qualsiasi microscopio è aumentata dal fattore di espansione. Una delle principali limitazioni dell'ExM precedentemente introdotto è la fluorescenza ridotta dopo la polimerizzazione e la procedura di digestione. Per superare questa limitazione, è stata sviluppata la microscopia a espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM), che previene la perdita di segnale e migliora notevolmente l'efficienza dell'etichettatura utilizzando una serie di nuovi ancoraggi trifunzionali. Questa tecnica consente di ottenere una risoluzione più elevata quando si studiano strutture cellulari o subcellulari su scala nanometrica con una minima perdita di segnale fluorescente. LR-ExM può essere utilizzato non solo per la marcatura con immunofluorescenza, ma anche con tag proteici auto-etichettanti, come i tag SNAP e CLIP, ottenendo così una maggiore efficienza di etichettatura. Questo lavoro presenta la procedura e la risoluzione dei problemi per questo approccio basato sull'immunocolorazione, nonché la discussione degli approcci di etichettatura automatica di LR-ExM come alternativa.

Introduzione

La microscopia ad espansione (ExM) è stata utilizzata dai ricercatori sin da quando è stata introdotta per la prima volta come approccio conveniente per ottenere immagini a super risoluzione con microscopi convenzionali, come l'epifluorescenza e i microscopi confocali 1,2,3,4,5,6,7 . Utilizzando ExM, è possibile raggiungere una risoluzione laterale di ~ 70 nm anche con normali microscopi confocali. Quando ExM è combinato con l'imaging a super-risoluzione, la risoluzione viene ulteriormente migliorata. Ad esempio, si può ottenere una risoluzione di circa 30 nm con la microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e una risoluzione di circa 4 nm con la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM)^1,5.

Tuttavia, la bassa efficienza dell'etichettatura è un problema critico con i metodi ExM standard. La perdita di fluorescenza può variare in base al tipo di gruppi fluorescenti e al tempo di digestione. In media, tuttavia, è stato riportato che oltre il 50% dei fluorofori viene perso dopo la polimerizzazione e le fasi di digestione delle proteine di ExM, il che è dannoso per la qualità dell'imaging ^3,4.

Pertanto, è stata sviluppata la microscopia ad espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM), che può conservare in modo efficiente le etichette e ridurre la perdita di segnale¹. L'innovazione chiave di LR-ExM è l'uso di una serie di ancoraggi trifunzionali invece di utilizzare semplicemente coloranti fluorescenti - come nella procedura standard ExM - per colorare le proteine di interesse. Questi linker trifunzionali sono costituiti da tre parti: (1) il connettore (ad esempio, N-idrossisuccinimide (NHS)) per connettersi all'anticorpo, (2) l'ancora (ad esempio, metacrilammide (MA)) per ancorare le proteine al polimero e (3) il reporter (ad esempio, biotina o digossigenina (DIG)) per coniugare a un colorante organico. Le ancore trifunzionali sopravvivono alle fasi di polimerizzazione e digestione delle proteine, e quindi prevengono la perdita di fluorofori.

Inoltre, questo metodo ha un grande potenziale poiché è compatibile con tag enzimatici auto-etichettanti come SNAP o CLIP. Gli approcci di tag enzimatici hanno alcuni vantaggi rispetto all'approccio immunocolorante per quanto riguarda l'elevata specificità e l'efficienza di etichettatura ^8,9,10.

In questo manoscritto viene dimostrata una procedura dettagliata di LR-ExM. LR-ExM è un metodo altamente efficace e flessibile per ottenere un'elevata risoluzione spaziale con una maggiore efficienza di etichettatura.

Protocollo

1. Coltura cellulare

1. Utilizzare cellule U2OS coltivate nel mezzo 5A di McCoy integrato con FBS al 10% a 37 °C in CO 2 al 5%.
2. Celle di coltura su un vetro di copertura a camera rimovibile a 16 pozzetti (area di coltura 0,4 cm²) per una facile manipolazione.

2. Fissazione e permeabilizzazione

NOTA: Le condizioni di fissazione e permeabilizzazione dipendono dai protocolli di immunocolorazione ottimizzati. Di seguito è riportato un protocollo di fissazione e permeabilizzazione per microtubuli co-immunostain e pozzi rivestiti di clatrina (CCP).

1. Una volta che la conta cellulare raggiunge ~0,04 x 10 6, fissare le cellule con 100 μL di paraformaldeide (PFA) al 3,2% in tampone PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA e 1 mM MgCl₂, pH^6,9) per 10 minuti a temperatura ambiente (Tabella 1).
   NOTA: La fissazione mediante PFA viene eseguita in un cappuccio di sicurezza certificato.
2. Lavare le celle tre volte per 5 minuti ciascuna con 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
3. Permeabilizzare le cellule con 100 μL di tampone di permeabilizzazione a temperatura ambiente per 15 minuti (Tabella 1).
   NOTA: Procedere con l'etichettatura il prima possibile per evitare la degradazione della proteina bersaglio, dell'RNA o del DNA e per ottenere un risultato ottimale. Se necessario, tuttavia, i campioni fissi possono essere conservati per un tempo prolungato (fino a un mese) in un tampone PBS a 4 °C. Sostituire qualsiasi PBS evaporato e proteggere il campione dal fotosbiancamento.

3. Streptavidina endogena e blocco della biotina

1. Incubare le cellule con la soluzione di streptavidina diluita in un tampone bloccante cellulare (100 μL) per 15 minuti a temperatura ambiente (Tabella 1).
2. Risciacquare brevemente con 200 μL di tampone bloccante cellulare.
3. Incubare le cellule con 100 μL di soluzione di biotina diluite in un tampone bloccante cellulare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: quando si utilizza un approccio di tagging autoetichettante, ad esempio utilizzando tag SNAP o CLIP, ignorare il passaggio 4 e procedere al passaggio 5.1: approccio di tagging autoetichettante.

4. Colorazione degli anticorpi primari

1. Incubare cellule con anticorpo anti-α-tubulina di ratto (diluizione 1:500) e anticorpo anti-lattrina a catena pesante di coniglio (diluizione 1:100) in 100 μL di tampone bloccante cellulare per 16 h a 4 °C o 1 h a temperatura ambiente. Raddoppiare il tempo di incubazione dei campioni di tessuto.
2. Lavare i campioni quattro volte con 200 μL di PBS per 5 minuti ciascuno.

5. Colorazione anticorpale secondaria specifica LR-ExM

1. Coniugare gli anticorpi IgG con i linker trifunzionali come N-idrossisuccinimide (NHS) - metacrilammide (MA) -Biotina o NHS-MA-Digoxigenina (Dig) (Figura 1B). La sintesi di ancore trifunzionali e la coniugazione degli anticorpi secondari sono state precedentemente introdotte in Shi et ^al.1. Approccio di tagging auto-etichettante: coniugare gli anticorpi IgG con i linker trifunzionali, come MA- benzilguanina (BG)-biotina o MA- benzilcitosina (BC)-Dig (Figura 1B). La sintesi di ancore trifunzionali e una coniugazione degli anticorpi secondari sono state precedentemente introdotte in Shi et ^al.1.
2. Incubare le cellule con gli anticorpi secondari anti-coniglio-Dig-MA (diluizione 1:100) e anti-ratto-biotina-MA dell'asino (diluizione 1:100) in 100 μL di tampone bloccante cellulare per 1 ora a temperatura ambiente. Raddoppia questo tempo di incubazione per i campioni di tessuto.
3. Lavare i campioni quattro volte in 200 μL di PBS per 5 minuti ciascuno.

6. Ancoraggio aggiuntivo

1. Incubare le cellule con lo 0,25% di glutaraldeide (GA) in PBS (100 μL) per 15 minuti a temperatura ambiente per ancorare le proteine sull'idrogel. In alternativa, utilizzare 25 mM di acido metacrilico N-idrossisuccinimide estere (MA-NHS) per l'ancoraggio. È incoraggiata l'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.
2. Lavare i campioni tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno.

7. Gelificazione

NOTA: La velocità di espansione è determinata dal tempo di diffusione del sale e dell'acqua fuori o nel gel; Pertanto, la colata di gel sottili accelera il tempo di espansione.

1. Rimuovere la struttura superiore della piastra di gel a 16 pozzetti. Aggiungere 40 μL di soluzione monomerica a ciascun pozzetto per condizionare le cellule sul ghiaccio. Incubare su ghiaccio per 5 min.
   1. Per preparare una soluzione monomerica, vedere Tabella 2.
2. Preparare la soluzione di gelificazione su ghiaccio. Aggiungere acqua bidistillata e un acceleratore al 10% di N,N,N′,N′ Tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione monomerica (10% TEMED: soluzione monomerica = 1:47); non aggiungere ancora l'iniziatore (Tabella 3).
3. Per una camera di coltura cellulare con un'area di 0,4 cm², utilizzare un volume di soluzione di gelificazione di circa 40 μL. Preparare 45 μL di soluzione di gelificazione per ciascun pozzetto.
4. Aggiungere il 10% di persolfato di ammonio (APS) alla soluzione di gelificazione, incubare su ghiaccio e pipettare immediatamente 40 μL di soluzione di gelificazione in ciascuna guarnizione siliconica bene sul ghiaccio. Incubare su ghiaccio per 3 minuti (10% APS:10% TEMED:soluzione monomerica = 1:1:47).
5. Proteggere il campione dalla luce e spostare il vetro di copertura nella capsula di Petri da 10 cm in un incubatore a 37 °C per 1,5 ore per la gelificazione. Per mantenere l'umidità del gel durante l'incubazione a 37 °C, coprire la capsula di Petri con il coperchio e mettere qualche goccia d'acqua nella capsula di Petri.

8. Digestione

1. Dopo la gelificazione, rimuovere il vetro per separare il gel e trasferire il gel in 6 pozzetti. Digerire le cellule incorporate con 2 ml di tampone digestivo (Tabella 1) durante la notte a temperatura ambiente o 4 ore a 37 °C. Utilizzare almeno 10 volte il volume in eccesso di tampone di digestione.
2. Lavare i gel con un volume d'acqua in eccesso di almeno 10 volte rispetto al volume finale del gel. Ripetere la fase di lavaggio quattro volte per 20-30 minuti ogni volta. Il gel si espande di circa due volte in ogni dimensione.
   NOTA: I campioni di gel possono essere conservati fino a 1 mese in un tampone PBS a 4 °C. Sostituire l'acqua evaporata per evitare l'essiccazione e proteggere il campione dalla luce durante lo stoccaggio. Per evitare il degrado degli ancoraggi trifunzionali, i campioni devono essere colorati il prima possibile dopo la digestione e il lavaggio.

9. Colorazione a fluorescenza post-digestione

1. Incubare gel in 2 mL di volume di tampone colorante streptavidina (STV)/digoxigenina (DIG) con colorante STV da 2 a 5 μM e/o colorante anti-DIG per 24 ore a temperatura ambiente. Conservare i campioni al buio.

10. Espansione

1. Lavare ed espandere il gel quattro volte con acqua eccessiva (2-3 ml) per 30 minuti a 1 ora ogni volta.
2. Per una più facile visualizzazione delle cellule al microscopio fluorescente, colorare le cellule con DAPI durante il terzo dei cinque lavaggi. Diluire la concentrazione di DAPI (5 mg/ml, conservata a 4 °C) in 1:5.000 diluizioni in acqua di lavaggio. Incubare il gel con una soluzione DAPI-acqua (2 ml) per 30 minuti a 1 ora.
3. Lavare altre due volte con 3 ml di acqua.
4. Espandi i gel in qualsiasi piatto piatto abbastanza grande da contenere i campioni. I gel espansi che vengono preparati su 0,4 cm² area coverglass si adattano bene in una piastra di vetro inferiore a 6 pozzetti.
   NOTA: I campioni colorati post-espansione possono essere conservati fino a 4 mesi in un tampone PBS a 4 ° C. Aggiungere acqua sufficiente per evitare l'essiccazione e proteggere il campione dal fotosbiancamento. Ripetere la fase di espansione e colorazione DAPI prima dell'imaging. Per evitare qualsiasi rischio di degradazione dei fluorofori, i campioni devono essere ripresi il prima possibile.

11. Imaging

1. Rivestire la camera di imaging con fondo in vetro a 6 pozzetti con poli-L-lisina allo 0,01% (3 ml ciascuno) per immobilizzare i campioni di gel.
2. Trasferire i campioni di gel nella camera di imaging rivestita.
3. Immagina i campioni con qualsiasi oscilloscopio a fluorescenza desiderato.

Risultati

I pozzi rivestiti di clatrina (CCP) sono immunocolorati utilizzando ancore trifunzionali (Figura 1B) e LR-ExM viene eseguito come descritto nella Figura 1A. LR-ExM (Figura 2C,E) mostra un'intensità di fluorescenza molto più elevata rispetto alla microscopia ad espansione di ritenzione proteica (proExM, Figura 2A) o biotina-ExM (Figura 2B); il segnale per ...

Discussione

L'innovazione chiave di LR-ExM è l'utilizzo di ancoraggi trifunzionali per etichettare efficacemente le proteine bersaglio e migliorare la qualità dell'immagine. Questo metodo è limitato da ancore trifunzionali, che non sono così facilmente disponibili per i ricercatori. Tuttavia, le ancore trifunzionali possono essere condivise con altri ricercatori su richiesta e prodotti simili come le sonde ExM di Chrometa sono ora disponibili in commercio.

In questo protocollo, è stata eseguita un'in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate