Etiket Tutma Genişletme Mikroskobu (LR-ExM), Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Yüksek Verimli Etiketleme Sağlar

Özet

Bir etiket tutma genişletme mikroskobu protokolü (LR-ExM) gösterilmiştir. LR-ExM, daha önce tanıtılan genleşme mikroskopilerine kıyasla daha iyi etiketleme verimliliği sağlayan yeni bir üç işlevli ankraj seti kullanır.

Özet

Genleşme mikroskobu (ExM), çözünürlüğü artırmak için çoğu ışık mikroskobu yöntemiyle birleştirilebilen bir numune hazırlama tekniğidir. Hücreleri veya dokuları şişirilebilir hidrojele gömdükten sonra, numuneler orijinal boyuta kıyasla fiziksel olarak üç ila on altı kat (doğrusal boyut) genişletilebilir. Bu nedenle, herhangi bir mikroskobun etkili çözünürlüğü genişleme faktörü ile arttırılır. Daha önce tanıtılan ExM'nin önemli bir sınırlaması, polimerizasyon ve sindirim prosedüründen sonra floresanın azaltılmasıdır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, sinyal kaybını önleyen ve bir dizi yeni üç işlevli ankraj kullanarak etiketleme verimliliğini büyük ölçüde artıran etiket tutma genleşme mikroskobu (LR-ExM) geliştirilmiştir. Bu teknik, nanometrik ölçekte hücresel veya hücre altı yapıları araştırırken minimum floresan sinyal kaybı ile daha yüksek çözünürlük elde edilmesini sağlar. LR-ExM sadece immünofloresan etiketleme için değil, aynı zamanda SNAP ve CLIP etiketleri gibi kendinden etiketli protein etiketleriyle de kullanılabilir, böylece daha yüksek etiketleme verimliliği elde edilir. Bu çalışma, bu immün boyama temelli yaklaşım için prosedür ve sorun gidermenin yanı sıra LR-ExM'nin kendi kendini etiketleme yaklaşımlarının alternatif olarak tartışılmasını sunmaktadır.

Giriş

Genleşme mikroskobu (ExM), epifloresan ve konfokal mikroskoplar^gibi geleneksel mikroskoplarla süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için uygun bir yaklaşım olarak ilk kez tanıtıldığından beri araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7 . ExM kullanarak, düzenli konfokal mikroskoplarla bile ~ 70 nm yanal çözünürlük elde etmek mümkündür. ExM, süper çözünürlüklü görüntüleme ile birleştirildiğinde, çözünürlük daha da geliştirilir. Örneğin, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ile kabaca 30 nm çözünürlüğe ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ^1,5 ile kabaca 4 nm çözünürlüğe ulaşılabilir.

Bununla birlikte, düşük etiketleme verimliliği, standart ExM yöntemleriyle ilgili kritik bir konudur. Floresan kaybı, floresan gruplarının türüne ve sindirim süresine bağlı olarak değişebilir. Bununla birlikte, ortalama olarak, ExM'nin polimerizasyonundan ve protein sindirim adımlarından sonra floroforların% 50'sinden fazlasının kaybolduğu ve bunun görüntüleme kalitesine zarar verdiği bildirilmiştir ^3,4.

Böylece, etiketleri verimli bir şekilde tutabilen ve sinyal kaybını azaltabilen etiket tutma genleşme mikroskobu (LR-ExM) geliştirilmiştir¹. LR-ExM'in temel yeniliği, ilgilenilen proteinleri boyamak için standart ExM prosedüründe olduğu gibi sadece floresan boyalar kullanmak yerine bir dizi üç fonksiyonlu ankrajın kullanılmasıdır. Bu üç fonksiyonlu bağlayıcılar üç bölümden oluşur: (1) antikora bağlanmak için konektör (örneğin, N-hidroksisüksinamid (NHS)), (2) proteinleri polimere sabitlemek için çapa (örneğin, metakrilamit (MA)) ve (3) organik bir boyaya konjuge etmek için muhabir (örneğin, biyotin veya digoxigenin (DIG)). Üç fonksiyonlu ankrajlar polimerizasyon ve protein sindirim adımlarında hayatta kalır ve bu nedenle florofor kaybını önler.

Ayrıca, bu yöntem SNAP veya CLIP gibi kendi kendini etiketleyen enzimatik etiketlerle uyumlu olduğu için büyük bir potansiyele sahiptir. Enzimatik etiket yaklaşımlarının immün boyama yaklaşımına göre yüksek özgüllük ve etiketleme verimliliği^açısından bazı faydaları vardır ^8,9,10.

Bu yazıda LR-ExM'in ayrıntılı bir prosedürü gösterilmiştir. LR-ExM, gelişmiş etiketleme verimliliği ile yüksek uzamsal çözünürlük elde etmek için son derece etkili ve esnek bir yöntemdir.

Protokol

1. Hücre kültürü

1. McCoy'un 5A ortamında kültürlenmiş U2OS hücrelerini,% 5 CO_2'de% 10 FBS ile 37 ° C'de% 5 ile desteklenmiş olarak kullanın.
2. Kullanım kolaylığı için 16 adet iyi çıkarılabilir odacıklı kapak camı (kültür alanı 0,4^cm2) üzerine kültür hücreleri.

2. Fiksasyon ve geçirgenlik

NOT: Fiksasyon ve geçirgenlik koşulları, optimize edilmiş immün boyama protokollerine bağlıdır. Aşağıdakiler, ko-immünostain mikrotübül ve klatrin kaplı çukurlara (CCP'ler) bir fiksasyon ve geçirgenlik protokolüdür.

1. Hücre sayıları ~0.04 x 10 6'ya ulaştığında, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PEM tamponunda (100 mM PIPES, 1 mM EGTA ve 1 mM MgCl 2, pH^6.9) 100 μL%_3.2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin (Tablo 1).
   NOT: PFA kullanılarak sabitleme, sertifikalı bir güvenlik başlığında gerçekleştirilir.
2. Hücreleri her biri 5 dakika boyunca üç kez 200 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
3. Oda sıcaklığında 100 μL geçirgenlik tamponu ile hücreleri 15 dakika boyunca geçirgenleştirin (Tablo 1).
   NOT: Hedef protein, RNA veya DNA bozulmasını önlemek ve en uygun sonucu elde etmek için mümkün olan en kısa sürede etiketlemeye devam edin. Bununla birlikte, ihtiyaç duyulursa, sabit numuneler 4 ° C'de bir PBS tamponunda uzun bir süre (bir aya kadar) saklanabilir. Buharlaşmış PBS'leri değiştirin ve numuneyi fotobeyazlatmaya karşı koruyun.

3. Endojen streptavidin ve biyotin blokajı

1. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda (100 μL) seyreltilmiş streptavidin çözeltisi ile hücreleri inkübe edin (Tablo 1).
2. 200 μL hücre bloke edici tampon ile kısaca durulayın.
3. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda seyreltilmiş 100 μL biyotin çözeltisi içeren hücreleri inkübe edin.
   NOT: SNAP- veya CLIP- etiketlerini kullanmak gibi kendi kendini etiketleme yaklaşımı kullanırken, adım 4'ü atlayın ve adım 5.1: kendinden etiketleme etiketleme yaklaşımına geçin.

4. Primer antikor boyama

1. Sıçan anti-α-tübülin antikoru (1:500 seyreltme) ve tavşan anti-klatrin ağır zincirli antikoru (1:100 seyreltme) içeren hücreleri, 4 ° C'de 16 saat veya oda sıcaklığında 1 saat boyunca 100 μL hücre bloke edici tamponda inkübe edin. Doku örnekleri için kuluçka süresini iki katına çıkarın.
2. Numuneleri her biri 5 dakika boyunca 200 μL PBS ile dört kez yıkayın.

5. LR-ExM'e özgü sekonder antikor boyama

1. IgG antikorlarını N-hidroksisüksinamid (NHS) - metakrilatid (MA) -Biotin veya NHS-MA-Digoxigenin (Dig) gibi üç fonksiyonlu bağlayıcılarla birleştirin (Şekil 1B). Trifonksiyonel çapaların sentezi ve sekonder antikorların konjugasyonu daha önce Shi ve ^ark.1'de tanıtılmıştır. Kendi kendini etiketleme yaklaşımı: IgG antikorlarını MA- benzilguanin (BG)-Biotin veya MA- benzilsitozin (BC)-Dig gibi üç fonksiyonlu bağlayıcılarla birleştirin (Şekil 1B). Üç fonksiyonlu çapaların sentezi ve ikincil antikorların konjugasyonu daha önce Shi ve ^ark.1'de tanıtılmıştır.
2. Hücreleri eşek anti-tavşan-Dig-MA (1:100 seyreltme) ve eşek anti-sıçan-biotin-MA (1:100 seyreltme) sekonder antikorları ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca 100 μL hücre bloke edici tamponda inkübe edin. Doku örnekleri için bu kuluçka süresini iki katına çıkarın.
3. Numuneleri her biri 5 dakika boyunca 200 μL PBS'de dört kez yıkayın.

6. Ek ankraj

1. Proteinleri hidrojel üzerine sabitlemek için hücreleri PBS'de (100 μL) 15 dakika boyunca oda sıcaklığında % 0.25 glutaraldehit (GA) ile inkübe edin. Alternatif olarak, ankraj için 25 mM metakrilik asit N-hidroksisüksinamid ester (MA-NHS) kullanın. Oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon teşvik edilir.
2. Numuneleri PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.

7. Jelleşme

NOT: Genleşme hızı, tuz ve suyun jelin dışına veya içine difüzyon süresi ile belirlenir; böylece ince jellerin dökümü genleşme süresini hızlandırır.

1. 16 delikli jel plakanın üst yapısını çıkarın. Buz üzerindeki hücreleri koşullandırmak için her bir kuyucuğa 40 μL monomer çözeltisi ekleyin. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
   1. Bir monomer çözeltisi hazırlamak için bkz: Tablo 2.
2. Jelasyon çözeltisini buz üzerinde hazırlayın. Monomer çözeltisine çift damıtılmış su ve% 10 N,N, N′,N′ Tetrametilenidiamin (TEMED) hızlandırıcı ekleyin (%10 TEMED: monomer çözeltisi = 1:47); başlatıcıyı henüz eklemeyin (Tablo 3).
3. 0.4^cm2'lik bir alana sahip bir hücre kültürü odası için, yaklaşık 40 μL'lik bir jelasyon çözeltisi hacmi kullanın.
4. Jelasyon çözeltisine% 10 amonyum persülfat (APS) ekleyin, buz üzerinde inkübe edin ve hemen buz üzerindeki her silikon contaya 40 μL jelasyon çözeltisi pipetin. 3 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin (%10 APS:%10 TEMED:monomer çözeltisi = 1:1:47).
5. Numuneyi ışıktan koruyun ve 10 cm'lik Petri kabındaki kapak camını jelasyon için 1,5 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre taşıyın. 37 ° C inkübasyon sırasında jelin nemini korumak için, Petri kabını kapakla örtün ve Petri kabına birkaç damla su koyun.

8. Sindirim

1. Jelleşmeden sonra, jeli ayırmak için camı çıkarın ve jeli 6 kuyucuklu plakaya aktarın. Gömülü hücreleri 2 mL sindirim tamponu (Tablo 1) ile oda sıcaklığında gece boyunca veya 37 °C'de 4 saat sindirin. En az 10 kat fazla hacimli sindirim tamponu kullanın.
2. Jelleri, son jel hacminden en az 10 kat fazla su hacmiyle yıkayın. Yıkama adımını her seferinde 20 ila 30 dakika boyunca dört kez tekrarlayın. Jel her boyutta yaklaşık iki kat genişler.
   NOT: Jel numuneleri, 4 °C'de PBS tamponunda 1 aya kadar saklanabilir. Kurumasını önlemek için buharlaşan suyu değiştirin ve depolama sırasında numuneyi ışıktan koruyun. Üç fonksiyonlu ankrajların bozulmasını önlemek için, numuneler sindirim ve yıkamadan sonra mümkün olan en kısa sürede lekelenmelidir.

9. Sindirim sonrası floresan boyama

1. Jelleri, oda sıcaklığında 24 saat boyunca 2 ila 5 μM STV-boya ve/veya anti-DIG-boya ile 2 mL hacimli streptavidin (STV)/digoxigenin (DIG) boyama tamponunda inkübe edin. Örnekleri karanlıkta tutun.

10. Genişleme

1. Jeli her seferinde 30 dakika ila 1 saat arasında aşırı suyla (2-3 mL) dört kez yıkayın ve genişletin.
2. Floresan mikroskopi altındaki hücrelerin daha kolay görselleştirilmesi için, beş yıkamanın üçüncüsü sırasında hücreleri DAPI ile lekeleyin. DAPI stok konsantrasyonunu (5 mg/mL, 4 °C'de depolanır) yıkama suyunda 1:5.000 seyreltmede seyreltin. Jeli 30 dakika ila 1 saat boyunca bir DAPI-su çözeltisi (2 mL) ile inkübe edin.
3. 3 mL su ile iki kez daha yıkayın.
4. Numuneleri içerecek kadar büyük olan herhangi bir düz tabakta jelleri genişletin. 0,4^cm2 alan kapak camı üzerine hazırlanan genişletilmiş jeller, cam tabanlı 6 delikli bir plakaya güzel bir şekilde oturur.
   NOT: Genleşme sonrası lekeli numuneler, 4°C'de PBS tamponunda 4 aya kadar saklanabilir. kurumasını önlemek ve numuneyi fotobeyazlatmaya karşı korumak için yeterli su ekleyin. Görüntülemeden önce genişletme ve DAPI boyama adımını tekrarlayın. Florofor bozulması riskini önlemek için, numunelerin mümkün olan en kısa sürede görüntülenmesi gerekir.

11. Görüntüleme

1. Jel numunelerini hareketsiz hale getirmek için 6 delikli cam tabanlı görüntüleme odasını %0,01 poli-L-lizin (her biri 3 mL) ile kaplayın.
2. Jel numunelerini kaplanmış görüntüleme odasına aktarın.
3. Numuneleri istenen floresan kapsamlarıyla görüntüleyin.

Sonuçlar

Klatrin kaplı çukurlar (CCP'ler) üç fonksiyonlu ankrajlar (Şekil 1B) kullanılarak immünoboyalıdır ve LR-ExM, Şekil 1A'da açıklandığı gibi gerçekleştirilir. LR-ExM (Şekil 2C, E), protein tutma genleşme mikroskobu (proExM, Şekil 2A) veya biotin-ExM'ye (Şekil 2B) kıyasla çok daha yüksek floresan yoğunluğu gösterir; LR-ExM sinyali pro...

Tartışmalar

LR-ExM'in temel yeniliği, hedef proteinleri etkili bir şekilde etiketlemek ve görüntü kalitesini artırmak için üç fonksiyonlu ankrajlar kullanmaktır. Bu yöntem, araştırmacılar için çok kolay bulunmayan üç işlevli çapalarla sınırlıdır. Bununla birlikte, trifonksiyonel çapalar talep üzerine diğer araştırmacılarla paylaşılabilir ve Chrometa'nın ExM probları gibi benzer ürünler artık ticari olarak da temin edilebilir.

Bu protokolde primer ve sekonder antikor bo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate