Etiket Tutma Genişletme Mikroskobu (LR-ExM), Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Yüksek Verimli Etiketleme Sağlar

Özet

Bir etiket tutma genişletme mikroskobu protokolü (LR-ExM) gösterilmiştir. LR-ExM, daha önce tanıtılan genleşme mikroskopilerine kıyasla daha iyi etiketleme verimliliği sağlayan yeni bir üç işlevli ankraj seti kullanır.

Özet

Genleşme mikroskobu (ExM), çözünürlüğü artırmak için çoğu ışık mikroskobu yöntemiyle birleştirilebilen bir numune hazırlama tekniğidir. Hücreleri veya dokuları şişirilebilir hidrojele gömdükten sonra, numuneler orijinal boyuta kıyasla fiziksel olarak üç ila on altı kat (doğrusal boyut) genişletilebilir. Bu nedenle, herhangi bir mikroskobun etkili çözünürlüğü genişleme faktörü ile arttırılır. Daha önce tanıtılan ExM'nin önemli bir sınırlaması, polimerizasyon ve sindirim prosedüründen sonra floresanın azaltılmasıdır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, sinyal kaybını önleyen ve bir dizi yeni üç işlevli ankraj kullanarak etiketleme verimliliğini büyük ölçüde artıran etiket tutma genleşme mikroskobu (LR-ExM) geliştirilmiştir. Bu teknik, nanometrik ölçekte hücresel veya hücre altı yapıları araştırırken minimum floresan sinyal kaybı ile daha yüksek çözünürlük elde edilmesini sağlar. LR-ExM sadece immünofloresan etiketleme için değil, aynı zamanda SNAP ve CLIP etiketleri gibi kendinden etiketli protein etiketleriyle de kullanılabilir, böylece daha yüksek etiketleme verimliliği elde edilir. Bu çalışma, bu immün boyama temelli yaklaşım için prosedür ve sorun gidermenin yanı sıra LR-ExM'nin kendi kendini etiketleme yaklaşımlarının alternatif olarak tartışılmasını sunmaktadır.

Giriş

Genleşme mikroskobu (ExM), epifloresan ve konfokal mikroskoplar^gibi geleneksel mikroskoplarla süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için uygun bir yaklaşım olarak ilk kez tanıtıldığından beri araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7 . ExM kullanarak, düzenli konfokal mikroskoplarla bile ~ 70 nm yanal çözünürlük elde etmek mümkündür. ExM, süper çözünürlüklü görüntüleme ile birleştirildiğinde, çözünürlük daha da gelişti....

Protokol

1. Hücre kültürü

1. McCoy'un 5A ortamında kültürlenmiş U2OS hücrelerini,% 5 CO_2'de% 10 FBS ile 37 ° C'de% 5 ile desteklenmiş olarak kullanın.
2. Kullanım kolaylığı için 16 adet iyi çıkarılabilir odacıklı kapak camı (kültür alanı 0,4^cm2) üzerine kültür hücreleri.

2. Fiksasyon ve geçirgenlik

NOT: Fiksasyon ve geçirgenlik koşulları, optimize edilmiş immün boyama protokollerine bağlıdır. Aşağıdakiler, ko-immünostain mikrotübül ve klatrin kaplı çukurlara (CCP'ler) bir fiksasyon ve geçirgenlik protokolüdür.

1. Hücre sayıları ~0.04 x 10 6....

Sonuçlar

Klatrin kaplı çukurlar (CCP'ler) üç fonksiyonlu ankrajlar (Şekil 1B) kullanılarak immünoboyalıdır ve LR-ExM, Şekil 1A'da açıklandığı gibi gerçekleştirilir. LR-ExM (Şekil 2C, E), protein tutma genleşme mikroskobu (proExM, Şekil 2A) veya biotin-ExM'ye (Şekil 2B) kıyasla çok daha yüksek floresan yoğunluğu gösterir; LR-ExM sinyali pro.......

Tartışmalar

LR-ExM'in temel yeniliği, hedef proteinleri etkili bir şekilde etiketlemek ve görüntü kalitesini artırmak için üç fonksiyonlu ankrajlar kullanmaktır. Bu yöntem, araştırmacılar için çok kolay bulunmayan üç işlevli çapalarla sınırlıdır. Bununla birlikte, trifonksiyonel çapalar talep üzerine diğer araştırmacılarla paylaşılabilir ve Chrometa'nın ExM probları gibi benzer ürünler artık ticari olarak da temin edilebilir.

Bu protokolde primer ve sekonder antikor bo.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate