Label-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) ermöglicht hochauflösende Bildgebung und hocheffiziente Markierung

Zusammenfassung

Ein Protokoll der Markierungsretentionsexpansionsmikroskopie (LR-ExM) wird demonstriert. LR-ExM verwendet einen neuartigen Satz trifunktionaler Anker, der im Vergleich zu zuvor eingeführten Expansionsmikroskopien eine bessere Markierungseffizienz bietet.

Zusammenfassung

Die Expansionsmikroskopie (ExM) ist eine Probenvorbereitungstechnik, die mit den meisten lichtmikroskopischen Methoden kombiniert werden kann, um die Auflösung zu erhöhen. Nach dem Einbetten von Zellen oder Geweben in quellbares Hydrogel können die Proben im Vergleich zur ursprünglichen Größe physikalisch um das Drei- bis Sechzehnfache (lineare Dimension) erweitert werden. Daher wird die effektive Auflösung eines Mikroskops um den Expansionsfaktor erhöht. Eine wesentliche Einschränkung des zuvor eingeführten ExM ist die reduzierte Fluoreszenz nach der Polymerisation und dem Aufschlussverfahren. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde die Markierungs-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) entwickelt, die Signalverluste verhindert und die Markierungseffizienz mit einer Reihe neuartiger trifunktionaler Anker erheblich verbessert. Diese Technik ermöglicht es, eine höhere Auflösung zu erreichen, wenn zelluläre oder subzelluläre Strukturen im Nanometerbereich mit minimalem Fluoreszenzsignalverlust untersucht werden. LR-ExM kann nicht nur zur Immunfluoreszenzmarkierung, sondern auch mit selbstmarkierenden Proteinmarkierungen wie SNAP- und CLIP-Tags verwendet werden, wodurch eine höhere Markierungseffizienz erreicht wird. Diese Arbeit präsentiert das Verfahren und die Fehlerbehebung für diesen immunfärbungsbasierten Ansatz sowie die Diskussion von selbstmarkierenden Tagging-Ansätzen von LR-ExM als Alternative.

Einleitung

Die Expansionsmikroskopie (ExM) wird von Forschern seit ihrer Einführung als bequemer Ansatz verwendet, um hochauflösende Bildgebung mit herkömmlichen Mikroskopen wie Epifluoreszenz und konfokalen Mikroskopen zu erreichen 1,2,3,4,5,6,7 . Mit ExM ist es möglich, auch mit normalen konfokalen Mikroskopen eine laterale Auflösung von ~70 nm zu erreichen. Wenn ExM mit hochauflösender Bildgebung kombiniert wird, wird die Auflösung weiter verbessert. Zum Beispiel kann man mit der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) eine Auflösung von etwa 30 nm und mit der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (^{STORM) eine} Auflösung von etwa 4 nm erreichen1,5.

Die geringe Etikettiereffizienz ist jedoch bei Standard-ExM-Methoden ein kritisches Problem. Der Fluoreszenzverlust kann je nach Art der Fluoreszenzgruppen und Aufschlusszeit variieren. Im Durchschnitt wurde jedoch berichtet, dass mehr als 50% der Fluorophore nach der Polymerisation und den Proteinverdauungsschritten von ExM verloren gehen, was sich nachteilig auf die Bildqualität auswirkt ^3,4.

So wurde die Label-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) entwickelt, die Etiketten effizient zurückhalten und Signalverluste reduzieren kann¹. Die Schlüsselinnovation von LR-ExM ist die Verwendung eines Satzes von trifunktionalen Ankern anstelle von Fluoreszenzfarbstoffen - wie im Standard-ExM-Verfahren - zur Färbung von Proteinen von Interesse. Diese trifunktionalen Linker bestehen aus drei Teilen: (1) dem Konnektor (z. B. N-Hydroxysuccinimid (NHS)) zur Verbindung mit dem Antikörper, (2) dem Anker (z. B. Methacrylamid (MA)) zur Verankerung von Proteinen im Polymer und (3) dem Reporter (z. B. Biotin oder Digoxigenin (DIG)) zur Konjugierung mit einem organischen Farbstoff. Die trifunktionellen Anker überleben die Polymerisations- und Proteinverdauungsschritte und verhindern so den Verlust von Fluorophoren.

Darüber hinaus birgt diese Methode großes Potenzial, da sie mit selbstmarkierenden enzymatischen Tags wie SNAP oder CLIP kompatibel ist. Enzymatische Tag-Ansätze haben einige Vorteile gegenüber dem Immunfärbungsansatz in Bezug auf hohe Spezifität und Markierungseffizienz 8,9,10.

In diesem Manuskript wird eine detaillierte Vorgehensweise von LR-ExM demonstriert. LR-ExM ist eine hocheffektive und flexible Methode, um eine hohe räumliche Auflösung bei verbesserter Beschriftungseffizienz zu erreichen.

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Protokoll

1. Zellkultur

1. Verwenden Sie U2OS-Zellen, die in McCoys 5A-Medium kultiviert wurden, ergänzt mit 10% FBS bei 37 °C in 5%_CO2.
2. Kulturzellen auf ein 16 gut abnehmbares Kammerdeckglas (Kulturfläche 0,4 cm²) für eine einfache Handhabung.

2. Fixierung und Permeabilisierung

HINWEIS: Die Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen hängen von den optimierten Immunfärbungsprotokollen ab. Das Folgende ist ein Fixierungs- und Permeabilisierungsprotokoll für Co-Immunfärbung von Mikrotubuli und Clathrin-beschichteten Pits (CCPs).

1. Sobald die Zellzahl ~0,04 x 10⁶ erreicht, fixieren Sie die Zellen mit 100 μL 3,2% Paraformaldehyd (PFA) im PEM-Puffer (100 mM PIPES, 1 mM EGTA und 1 mM MgCl₂, pH 6,9) für 10 min bei Raumtemperatur (Tabelle 1).
   HINWEIS: Die Fixierung mit PFA erfolgt in einer zertifizierten Sicherheitshaube.
2. Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min mit 200 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Permeabilisieren Sie Zellen mit dem 100 μL Permeabilisierungspuffer bei Raumtemperatur für 15 min (Tabelle 1).
   HINWEIS: Fahren Sie so schnell wie möglich mit der Markierung fort, um den Abbau von Zielproteinen, RNA oder DNA zu vermeiden und ein optimales Ergebnis zu erzielen. Bei Bedarf können jedoch feste Proben für eine längere Zeit (bis zu einem Monat) in einem PBS-Puffer bei 4 °C gelagert werden. Ersetzen Sie verdampftes PBS und schützen Sie die Probe vor Photobleiche.

3. Endogene Streptavidin- und Biotinblockierung

1. Inkubieren Sie die Zellen mit der in einem Zellblockierungspuffer (100 μL) verdünnten Streptavidinlösung für 15 min bei Raumtemperatur (Tabelle 1).
2. Spülen Sie kurz mit 200 μL Zellblockerpuffer ab.
3. Inkubieren Sie Zellen mit 100 μL Biotinlösung, verdünnt in einem Zellblockierpuffer für 15 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Wenn Sie einen selbstbeschriftenden Tagging-Ansatz verwenden, z. B. SNAP- oder CLIP-Tags, überspringen Sie Schritt 4 und fahren Sie mit Schritt 5.1: Selbstbeschriftungs-Tagging-Ansatz fort.

4. Primäre Antikörperfärbung

1. Inkubieren Sie Zellen mit Ratten-Anti-α-Tubulin-Antikörper (1:500 Verdünnung) und Kaninchen-Anti-Clathrin-Schwerkettenantikörper (1:100 Verdünnung) in 100 μL Zellblockierpuffer für 16 h bei 4 °C oder 1 h bei Raumtemperatur. Verdoppeln Sie die Inkubationszeit für die Gewebeproben.
2. Waschen Sie die Proben viermal mit 200 μL PBS für jeweils 5 Minuten.

5. LR-ExM-spezifische sekundäre Antikörperfärbung

1. Konjugierte IgG-Antikörper mit den trifunktionellen Linkern wie N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Methacrylamid (MA)-Biotin oder NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (Abbildung 1B). Die Synthese von trifunktionellen Ankern und die Konjugation der sekundären Antikörper wurden bereits in Shi et ^al.1 eingeführt. Selbstmarkierender Tagging-Ansatz: Konjugierte IgG-Antikörper mit den trifunktionellen Linkern, wie MA-Benzylguanin (BG)-Biotin oder MA-Benzylcytosin (BC)-Dig (Abbildung 1B). Die Synthese von trifunktionellen Ankern und eine Konjugation der sekundären Antikörper wurden zuvor in Shi et ^al.1 eingeführt.
2. Inkubieren Sie Zellen mit den sekundären Antikörpern Esel-Anti-Kaninchen-Dig-MA (1:100 Verdünnung) und Esel-Anti-Ratten-Biotin-MA (1:100 Verdünnung) in 100 μL Zellblockierpuffer für 1 h bei Raumtemperatur. Verdoppeln Sie diese Inkubationszeit für die Gewebeproben.
3. Waschen Sie die Proben viermal in 200 μL PBS für jeweils 5 Minuten.

6. Zusätzliche Verankerung

1. Zellen mit 0,25% Glutaraldehyd (GA) in PBS (100 μL) für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Proteine auf dem Hydrogel zu verankern. Alternativ können 25 mM Methacrylsäure-N-hydroxysuccinimidester (MA-NHS) zur Verankerung verwendet werden. Eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur wird empfohlen.
2. Waschen Sie die Proben dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten.

7. Gelierung

HINWEIS: Die Ausdehnungsgeschwindigkeit wird durch die Diffusionszeit von Salz und Wasser aus oder in das Gel bestimmt; So beschleunigt das Gießen dünner Gele die Expansionszeit.

1. Entfernen Sie die obere Struktur der 16-Well-Gelplatte. Fügen Sie 40 μL Monomerlösung in jede Vertiefung hinzu, um die Zellen auf Eis zu konditionieren. Auf Eis 5 min inkubieren.
   1. Informationen zur Herstellung einer Monomerlösung finden Sie in Tabelle 2.
2. Bereiten Sie die Gelierlösung auf Eis vor. Fügen Sie der Monomerlösung doppelt destilliertes Wasser und 10% N,N,N′,N′ Tetramethylethylendiamin (TEMED)-Beschleuniger hinzu (10% TEMED: Monomerlösung = 1:47); Fügen Sie den Initiator noch nicht hinzu (Tabelle 3).
3. Für eine Zellkulturkammer mit einer Fläche von 0,4^cm2 verwenden Sie ein Gelationslösungsvolumen von etwa 40 μL. Bereiten Sie 45 μL Gelationslösung für jede Vertiefung vor.
4. 10% Ammoniumpersulfat (APS) in die Gelierlösung geben, auf Eis inkubieren und sofort 40 μL Gelierlösung in jede Silikondichtung auf Eis pipettieren. Auf Eis 3 min inkubieren (10% APS:10% TEMED:Monomerlösung = 1:1:47).
5. Schützen Sie die Probe vor Licht und bewegen Sie das Deckglas in der 10 cm Petrischale für 1,5 h zur Gelierung in einen 37 °C Inkubator. Um die Feuchtigkeit des Gels während der 37 °C Inkubation zu halten, decken Sie die Petrischale mit dem Deckel ab und geben Sie einige Tropfen Wasser in die Petrischale.

8. Verdauung

1. Entfernen Sie nach der Gelierung das Glas, um das Gel zu trennen, und übertragen Sie das Gel auf die 6-Well-Platte. Aufschluss eingebetteter Zellen mit 2 ml Aufschlusspuffer (Tabelle 1) über Nacht bei Raumtemperatur oder 4 h bei 37 °C. Verwenden Sie mindestens das 10-fache überschüssige Volumen des Verdauungspuffers.
2. Waschen Sie Gele mit mindestens einem 10-fachen überschüssigen Wasservolumen als das endgültige Gelvolumen. Wiederholen Sie den Waschschritt viermal für jeweils 20 bis 30 Minuten. Das Gel dehnt sich in jeder Dimension um etwa das Zweifache aus.
   HINWEIS: Gelproben können bis zu 1 Monat in einem PBS-Puffer bei 4 °C gelagert werden. Ersetzen Sie verdampftes Wasser, um ein Austrocknen zu vermeiden, und schützen Sie die Probe während der Lagerung vor Licht. Um einen Abbau von trifunktionalen Ankern zu vermeiden, sollten die Proben so schnell wie möglich nach dem Aufschluss und Waschen gefärbt werden.

9. Fluoreszenzfärbung nach der Verdauung

1. Inkubieren Sie Gele in 2 ml Volumen Streptavidin (STV)/Digoxigenin (DIG) Färbepuffer mit 2 bis 5 μM STV-Farbstoff und/oder Anti-DIG-Farbstoff für 24 h bei Raumtemperatur. Bewahren Sie die Proben im Dunkeln auf.

10. Erweiterung

1. Waschen und expandieren Sie das Gel viermal mit überschüssigem Wasser (2-3 ml) für jeweils 30 min bis 1 h.
2. Zur leichteren Visualisierung von Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie färben Sie Zellen während der dritten der fünf Waschgänge mit DAPI. Verdünnte DAPI-Stammkonzentration (5 mg/ml, gelagert bei 4 °C) in 1:5.000 Verdünnungen in Waschwasser. Inkubieren Sie das Gel mit einer DAPI-Wasserlösung (2 ml) für 30 min bis 1 h.
3. Zwei weitere Male mit 3 ml Wasser waschen.
4. Expandieren Sie Gele in jeder flachen Schale, die groß genug ist, um die Proben aufzunehmen. Die expandierten Gele, die auf 0,4 cm 2-Flächen-Deckglas hergestellt werden, passen gut in eine 6-Well-Platte mit Glasboden.
   HINWEIS: Nachexpansionsgefärbte Proben können bis zu 4 Monate in einem PBS-Puffer bei 4° C gelagert werden. Fügen Sie genügend Wasser hinzu, um ein Austrocknen zu vermeiden und die Probe vor Photobleiche zu schützen. Wiederholen Sie den Erweiterungs- und DAPI-Färbeschritt vor der Bildgebung. Um jegliches Risiko eines Fluorophorabbaus zu vermeiden, müssen die Proben so schnell wie möglich abgebildet werden.

11. Bildgebung

1. Beschichten Sie die 6-Well-Glasboden-Bildgebungskammer mit 0,01% Poly-L-Lysin (je 3 ml), um die Gelproben zu immobilisieren.
2. Gelproben in die beschichtete Bildgebungskammer überführen.
3. Bilden Sie die Proben mit den gewünschten Fluoreszenzbereichen ab.

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Ergebnisse

Clathrin-beschichtete Gruben (CCPs) werden mit trifunktionalen Ankern immungefärbt (Abbildung 1B) und LR-ExM wird wie in Abbildung 1A beschrieben durchgeführt. LR-ExM (Abbildung 2C,E) zeigt eine viel höhere Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Proteinretentionsexpansionsmikroskopie (proExM, Abbildung 2A) oder Biotin-ExM (Abbildung 2B); Das Signal fü...

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Diskussion

Die Schlüsselinnovation von LR-ExM besteht darin, trifunktionale Anker zu verwenden, um die Zielproteine effektiv zu markieren und die Bildqualität zu verbessern. Diese Methode wird durch trifunktionale Anker begrenzt, die den Forschern nicht so leicht zur Verfügung stehen. Trifunktionale Anker können jedoch auf Anfrage mit anderen Forschern geteilt werden, und ähnliche Produkte wie ExM-Sonden von Chrometa sind jetzt auch kommerziell erhältlich.

In diesem Protokoll wurde eine 1-stündige...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate