Расширительная микроскопия с удержанием этикеток (LR-ExM) обеспечивает визуализацию со сверхвысоким разрешением и высокоэффективную маркировку

Резюме

Показан протокол расширительной микроскопии удержания этикеток (LR-ExM). LR-ExM использует новый набор трифункциональных анкеров, который обеспечивает лучшую эффективность маркировки по сравнению с ранее введенными микроскопиями расширения.

Аннотация

Расширительная микроскопия (ExM) - это метод подготовки образцов, который можно комбинировать с большинством методов световой микроскопии для увеличения разрешения. После встраивания клеток или тканей в набухающий гидрогель образцы могут быть физически расширены в три-шестнадцать раз (линейный размер) по сравнению с исходным размером. Поэтому эффективное разрешение любого микроскопа увеличивается на коэффициент расширения. Основным ограничением ранее введенного ExM является снижение флуоресценции после полимеризации и процедуры пищеварения. Чтобы преодолеть это ограничение, была разработана расширительная микроскопия для удержания меток (LR-ExM), которая предотвращает потерю сигнала и значительно повышает эффективность маркировки с использованием набора новых трифункциональных анкеров. Этот метод позволяет достичь более высокого разрешения при исследовании клеточных или субклеточных структур в нанометрическом масштабе с минимальными потерями флуоресцентного сигнала. LR-ExM может использоваться не только для иммунофлуоресцентной маркировки, но и с самомаркировкой белковых меток, таких как SNAP- и CLIP-метки, тем самым достигая более высокой эффективности маркировки. В этой работе представлена процедура и устранение неполадок для этого подхода, основанного на иммуноокрашении, а также обсуждение подходов к самомаркировке маркировки LR-ExM в качестве альтернативы.

Введение

Расширительная микроскопия (ExM) используется исследователями с тех пор, как она была впервые представлена в качестве удобного подхода для достижения изображения сверхвысокого разрешения с помощью обычных микроскопов, таких как эпифлуоресценция и конфокальные микроскопы ^{1,2,3,4,5,6,7} . Используя ExM, можно достичь бокового разрешения ~ 70 нм даже с обычными конфокальными микроскопами. Когда ExM сочетается с изображениями со сверхвысоким разрешением, разрешение еще больше улучшается. Например, можно достичь разрешения примерно 30 нм при структурированной микроскопии освещения (SIM) и примерно 4 нм при стохастической оптической реконструкционной микроскопии (STORM)^1,5.

Однако низкая эффективность маркировки является критической проблемой для стандартных методов ExM. Потеря флуоресценции может варьироваться в зависимости от типа флуоресцентных групп и времени пищеварения. В среднем, однако, сообщалось, что более 50% флуорофоров теряются после полимеризации и стадий переваривания белка ExM, что наносит ущерб качеству изображения ^3,4.

Так, была разработана расширительная микроскопия для удержания меток (LR-ExM), которая может эффективно удерживать метки и уменьшать потери сигнала¹. Ключевым новшеством LR-ExM является использование набора трифункциональных анкеров вместо простого использования флуоресцентных красителей, как в стандартной процедуре ExM, для окрашивания интересующих белков. Эти трифункциональные линкеры состоят из трех частей: (1) соединитель (например, N-гидроксисукцинимид (NHS)) для соединения с антителом, (2) якорь (например, метакриламид (MA)) для закрепления белков к полимеру и (3) репортер (например, биотин или дигоксигенин (DIG)) для сопряжения с органическим красителем. Трифункциональные анкеры выдерживают этапы полимеризации и переваривания белка и, следовательно, предотвращают потерю флуорофора.

Кроме того, этот метод обладает большим потенциалом, поскольку он совместим с самомаркирующими ферментативными тегами, такими как SNAP или CLIP. Ферментативные подходы имеют некоторые преимущества по сравнению с иммуноокрашивающим подходом в отношении высокой специфичности и эффективности маркировки ^8,9,10.

В этой рукописи показана подробная процедура LR-ExM. LR-ExM - это высокоэффективный и гибкий метод для достижения высокого пространственного разрешения с повышенной эффективностью маркировки.

протокол

1. Клеточная культура

1. Используйте клетки U2OS, культивируемые в среде McCoy 5A, дополненной 10% FBS при 37 ° C в 5% CO₂.
2. Культивируйте клетки на 16 хорошо съемное камерное покровное стекло (площадь культивирования 0,4^см2) для удобства обработки.

2. Фиксация и пермеабилизация

ПРИМЕЧАНИЕ: Условия фиксации и пермеабилизации зависят от оптимизированных протоколов иммуноокрашения. Ниже приведен протокол фиксации и пермеабилизации для коиммуноразморазвитых микротрубочек и ямок с клатриновым покрытием (CCP).

1. Как только количество клеток достигнет ~0,04 х 10⁶, зафиксируйте ячейки со 100 мкл 3,2% параформальдегида (PFA) в буфере PEM (100 мМ PIPES, 1 мМ EGTA и 1 мМ MgCl₂, pH 6,9) в течение 10 мин при комнатной температуре (таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация с помощью PFA выполняется в сертифицированной защитной вытяжке.
2. Промывайте клетки три раза в течение 5 мин каждая 200 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
3. Пермеабилизируйте клетки 100 мкл буфера пермеабилизации при комнатной температуре в течение 15 мин (таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приступайте к маркировке как можно скорее, чтобы избежать деградации целевого белка, РНК или ДНК и получить оптимальный результат. Однако, если это необходимо, фиксированные образцы могут храниться в течение длительного времени (до месяца) в буфере PBS при 4 °C. Замените любую испарившуюся PBS и защитите образец от фотоотбеливания.

3. Блокирование эндогенного стрептавидина и биотина

1. Инкубировать клетки раствором стрептавидина, разбавленным в клеточном блокирующем буфере (100 мкл) в течение 15 мин при комнатной температуре (таблица 1).
2. Ненадолго промойте 200 мкл буфера блокировки клеток.
3. Инкубировать клетки со 100 мкл раствора биотина, разбавленного в клеточном блокирующем буфере в течение 15 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании подхода к самомаркировке тегов, такого как использование тегов SNAP- или CLIP-, пропустите шаг 4 и перейдите к шагу 5.1: подход к самовымещению тегов.

4. Первичное окрашивание антителами

1. Инкубировать клетки с антителом против α-тубулина крыс (разведение 1:500) и антителом с тяжелой цепью против клатрина кролика (разведение 1:100) в 100 мкл буфера блокировки клеток в течение 16 ч при 4 °C или 1 ч при комнатной температуре. Удвоение времени инкубации образцов тканей.
2. Промывайте образцы четыре раза 200 мкл PBS в течение 5 минут каждый.

5. Окрашивание LR-ExM специфическими вторичными антителами

1. Конъюгируют антитела IgG с трифункциональными линкерами, такими как N-гидроксисукцинимид (NHS) - метакриламид (MA) -биотин или NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (Рисунок 1B). Синтез трифункциональных якорей и конъюгация вторичных антител ранее введены в Shi et ^al.1. Подход к самовымещению маркировки: конъюгированные антитела IgG с трифункциональными линкерами, такими как MA-бензилгуанин (BG)-Биотин или MA-бензилцитозин (BC)-Dig (Рисунок 1B). Синтез трифункциональных якорей и конъюгация вторичных антител ранее введены в Shi et ^al.1.
2. Инкубировать клетки с ослиными анти-кролик-Dig-MA (разведение 1:100) и ослиным анти-крысо-биотин-МА (1:100 разведение) вторичными антителами в 100 мкл клеточного блокирующего буфера в течение 1 ч при комнатной температуре. Удвойте это время инкубации для образцов тканей.
3. Промывайте образцы четыре раза в 200 мкл PBS в течение 5 минут каждый.

6. Дополнительная анкеровка

1. Инкубировать клетки с 0,25% глутаровым альдегидом (GA) в PBS (100 мкл) в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы закрепить белки на гидрогеле. В качестве альтернативы для анкеровки используют эфир метакриловой кислоты N-гидроксисукцинимида (MA-NHS) 25 мМ. Рекомендуется одночасовая инкубация при комнатной температуре.
2. Промывайте образцы три раза в PBS в течение 5 минут каждый.

7. Гелеобразование

ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость расширения определяется временем диффузии соли и воды наружу или в гель; таким образом, литье тонких гелей ускоряет время расширения.

1. Удалите верхнюю структуру 16-луночной гелевой пластины. Добавьте 40 мкл раствора мономера в каждую лунку, чтобы кондиционировать клетки на льду. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
   1. Для приготовления раствора мономера см. Таблицу 2.
2. Приготовьте гелеобразный раствор на льду. Добавьте двойную дистиллированную воду и 10% N,N,N',N' тетраметилэтилендиамина (TEMED) в раствор мономера (10% TEMED: раствор мономера = 1:47); пока не добавляйте инициатора (таблица 3).
3. Для камеры клеточной культуры площадью 0,4^см2 используют гелеобразующий раствор объемом около 40 мкл. Приготовьте 45 мкл гелеобразующего раствора для каждой лунки.
4. Добавьте 10% персульфат аммония (APS) в гелеобразный раствор, инкубируйте на льду и немедленно выпейте 40 мкл раствора для гелеобразования в каждую силиконовую прокладку на льду. Инкубировать на льду в течение 3 мин (10% APS:10% TEMED:раствор мономера = 1:1:47).
5. Защитите образец от света и переместите покровное стекло в чашке Петри 10 см в инкубатор при температуре 37 °C в течение 1,5 ч для гелеобразования. Чтобы сохранить влажность геля во время инкубации 37 °C, накройте чашку Петри крышкой и положите несколько капель воды в чашку Петри.

8. Пищеварение

1. После гелеобразования снимите стакан, чтобы отделить гель и переложить гель на 6-луночную пластину. Переваривайте внедренные клетки с 2 мл буфера пищеварения (таблица 1) в течение ночи при комнатной температуре или 4 ч при 37 °C. Используйте не менее 10-кратного избыточного объема буфера пищеварения.
2. Гели для мытья с по крайней мере 10-кратным избыточным объемом воды, чем конечный объем геля. Повторяйте этап стирки четыре раза в течение 20-30 минут каждый раз. Гель расширяется примерно в два раза в каждом измерении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы геля могут храниться до 1 месяца в буфере PBS при 4 °C. Замените испарившуюся воду, чтобы избежать высыхания и защитить образец от света во время хранения. Чтобы избежать деградации трифункциональных анкеров, образцы следует окрашивать как можно скорее после переваривания и промывки.

9. Флуоресцентное окрашивание после пищеварения

1. Инкубировать гели в буфере окрашивания стрептавидином (STV)/дигоксигенином (DIG) объемом 2 мл с STV-красителем от 2 до 5 мкМ и/или анти-DIG-красителем в течение 24 ч при комнатной температуре. Храните образцы в темноте.

10. Расширение

1. Вымойте и разверните гель четыре раза, запивая водой (2-3 мл) в течение 30 мин до 1 ч каждый раз.
2. Для более легкой визуализации клеток под флуоресцентной микроскопией окрашивайте клетки с помощью DAPI во время третьей из пяти промывок. Разбавить концентрацию запаса DAPI (5 мг/мл, хранить при 4 °C) в 1:5000 разведениях в промывочной воде. Инкубировать гель водным раствором DAPI (2 мл) в течение 30 мин - 1 ч.
3. Два дополнительных раза промыть 3 мл воды.
4. Разверните гели в любой плоской посуде, которая достаточно велика, чтобы содержать образцы. Расширенные гели, которые готовятся на покровном стекле площадью 0,4^см2 , хорошо вписываются в стеклянную нижнюю 6-луночную пластину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, окрашенные после расширения, могут храниться до 4 месяцев в буфере PBS при 4°C. Добавьте достаточно воды, чтобы избежать высыхания и защитить образец от фотоотбеливания. Повторите этап расширения и окрашивания DAPI перед визуализацией. Чтобы избежать риска деградации флуорофоров, образцы должны быть изображены как можно скорее.

11. Визуализация

1. Покройте камеру визуализации 6-луночного стеклянного дна 0,01% поли-L-лизином (по 3 мл каждая), чтобы обездвижить образцы геля.
2. Перенесите образцы геля в камеру визуализации с покрытием.
3. Изобразите образцы с любыми желаемыми флуоресцентными прицелами.

Результаты

Котлованные ямы (CCP), покрытые клатрином, иммуноокрашены с использованием трифункциональных анкеров (рисунок 1B), а LR-ExM выполняется, как описано на рисунке 1A. LR-ExM (Рисунок 2C,E) показывает гораздо более высокую интенсивность флуорес?...

Обсуждение

Ключевым новшеством LR-ExM является использование трифункциональных якорей для эффективной маркировки целевых белков и улучшения качества изображения. Этот метод ограничен трифункциональными якорями, которые не так легко доступны исследователям. Тем не менее, трифункциональные якоря ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate