A microscopia de expansão de retenção de etiquetas (LR-ExM) permite imagens de super-resolução e rotulagem de alta eficiência

Resumo

Um protocolo de microscopia de expansão de retenção de rótulo (LR-ExM) é demonstrado. O LR-ExM usa um novo conjunto de âncoras trifuncionais, o que proporciona melhor eficiência de rotulagem em comparação com as microscopias de expansão introduzidas anteriormente.

Resumo

A microscopia de expansão (ExM) é uma técnica de preparação de amostras que pode ser combinada com a maioria dos métodos de microscopia de luz para aumentar a resolução. Após a incorporação de células ou tecidos em hidrogel inchado , as amostras podem ser fisicamente expandidas de três a dezesseis vezes (dimensão linear) em comparação com o tamanho original. Portanto, a resolução efetiva de qualquer microscópio é aumentada pelo fator de expansão. Uma das principais limitações do ExM introduzido anteriormente é a fluorescência reduzida após a polimerização e o procedimento de digestão. Para superar essa limitação, a microscopia de expansão de retenção de rótulo (LR-ExM) foi desenvolvida, o que evita a perda de sinal e aumenta muito a eficiência de rotulagem usando um conjunto de novas âncoras trifuncionais. Esta técnica permite alcançar maior resolução ao investigar estruturas celulares ou subcelulares em uma escala nanométrica com perda mínima de sinal fluorescente. O LR-ExM pode ser usado não apenas para marcação por imunofluorescência, mas também com etiquetas proteicas automarcantes, como as tags SNAP e CLIP, alcançando assim maior eficiência de rotulagem. Este trabalho apresenta o procedimento e a solução de problemas para essa abordagem baseada em imunocoloração, bem como a discussão das abordagens de marcação de auto-rotulagem do LR-ExM como uma alternativa.

Introdução

A microscopia de expansão (ExM) tem sido utilizada por pesquisadores desde que foi introduzida pela primeira vez como uma abordagem conveniente para alcançar imagens de super resolução com microscópios convencionais, como epifluorescência e microscópios confocais 1,2,3,4,5,6,7 . Usando o ExM, é possível alcançar uma resolução lateral de ~70 nm, mesmo com microscópios confocais regulares. Quando o ExM é combinado com imagens de super-resolução, a resolução é melhorada ainda mais. Por exemplo, pode-se alcançar uma resolução de aproximadamente 30 nm com microscopia de iluminação estruturada (SIM) e aproximadamente 4 nm de resolução com microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM)^1,5.

No entanto, a baixa eficiência de rotulagem é um problema crítico com os métodos padrão do ExM. A perda de fluorescência pode variar com base no tipo de grupos fluorescentes e no tempo de digestão. Em média, no entanto, tem sido relatado que mais de 50% dos fluoróforos são perdidos após a polimerização e as etapas de digestão proteica do ExM, o que é prejudicial à qualidade de imagem ^3,4.

Assim, foi desenvolvida a microscopia de expansão de retenção de rótulos (LR-ExM), que pode reter eficientemente os rótulos e reduzir a perda de sinal¹. A principal inovação do LR-ExM é o uso de um conjunto de âncoras trifuncionais em vez de simplesmente usar corantes fluorescentes - como no procedimento padrão ExM - para coloração de proteínas de interesse. Esses ligadores trifuncionais consistem em três partes: (1) o conector (por exemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS)) para se conectar ao anticorpo, (2) a âncora (por exemplo, metacrilamida (MA)) para ancorar proteínas ao polímero e (3) o repórter (por exemplo, biotina ou digoxigenina (DIG)) para se conjugar a um corante orgânico. As âncoras trifuncionais sobrevivem às etapas de polimerização e digestão de proteínas e, portanto, evitam a perda de fluoróforo.

Além disso, este método tem um grande potencial, uma vez que é compatível com tags enzimáticas de auto-rotulagem, como SNAP ou CLIP. As abordagens enzimáticas de marcação têm alguns benefícios em relação à abordagem de imunocoloração quanto à alta especificidade e eficiência de marcação ^8,9,10.

Neste manuscrito, um procedimento detalhado do LR-ExM é demonstrado. LR-ExM é um método altamente eficaz e flexível para alcançar alta resolução espacial com maior eficiência de rotulagem.

Protocolo

1. Cultura celular

1. Use células U2OS cultivadas em meio 5A de McCoy suplementado com 10% de FBS a 37 °C em 5% de CO₂.
2. Células de cultura em um vidro de cobertura de câmara removível de 16 poços (área de cultura de 0,4 cm²) para facilitar o manuseio.

2. Fixação e permeabilização

NOTA: As condições de fixação e permeabilização dependem dos protocolos de imunocoloração otimizados. A seguir, um protocolo de fixação e permeabilização para co-imunocorantes microtúbulos e cavidades revestidas de clatrina (CCPs).

1. Quando a contagem de células atingir ~0,04 x 10 6, fixe células com 100 μL de paraformaldeído (PFA) a 3,2% em tampão PEM (PIPES 100 mM, EGTA 1 mM e 1 mM MgCl₂, pH^6,9) por 10 min à temperatura ambiente (Tabela 1).
   NOTA: A fixação usando PFA é realizada em um exaustor de segurança certificado.
2. Lave as células três vezes por 5 min cada com 200 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Permeabilizar células com o tampão de permeabilização de 100 μL à temperatura ambiente por 15 min (Tabela 1).
   NOTA: Prossiga com a marcação o mais rápido possível para evitar a degradação da proteína-alvo, RNA ou DNA e para obter um resultado ideal. Se for necessário, no entanto, as amostras fixas podem ser armazenadas por um tempo alongado (até um mês) em um buffer PBS a 4 °C. Substitua qualquer PBS evaporado e proteja a amostra do fotobranqueamento.

3. Estreptavidina endógena e bloqueio de biotina

1. Incubar as células com a solução de estreptavidina diluída num tampão bloqueador celular (100 μL) durante 15 min à temperatura ambiente (Tabela 1).
2. Enxaguar brevemente com 200 μL de tampão de bloqueio celular.
3. Incubar células com 100 μL de solução de biotina diluída em tampão de bloqueio celular durante 15 min à temperatura ambiente.
   Observação : ao usar uma abordagem de marcação de auto-rotulagem, como o uso de marcas SNAP ou CLIP, ignore a etapa 4 e prossiga para a etapa 5.1: abordagem de marcação de auto-rotulagem.

4. Coloração de anticorpos primários

1. Incubar células com anticorpo anti-α-tubulina de rato (diluição 1:500) e anticorpo anti-clatrina de cadeia pesada de coelho (diluição 1:100) em 100 μL de tampão de bloqueio celular durante 16 h a 4 °C ou 1 h à temperatura ambiente. Dobrar o tempo de incubação para as amostras de tecido.
2. Lave as amostras quatro vezes com 200 μL de PBS por 5 min cada.

5. Coloração de anticorpos secundários específicos para LR-ExM

1. Conjugar anticorpos IgG com os ligantes trifuncionais como N-hidroxisuccinimida (NHS) - metacrilamida (MA) -Biotina ou NHS-MA-Digoxigenina (Dig) (Figura 1B). A síntese das âncoras trifuncionais e a conjugação dos anticorpos secundários são previamente introduzidas em Shi et ^al.1. Abordagem de marcação automarcante: Conjugar anticorpos IgG com os ligantes trifuncionais, como MA-benzilguanina (BG)-Biotina ou MA-benzilcitosina (BC)-Dig (Figura 1B). A síntese de âncoras trifuncionais e a conjugação dos anticorpos secundários são previamente introduzidas em Shi et ^al.1.
2. Incubar células com os anticorpos secundários burro anti-coelho-Dig-MA (diluição 1:100) e burro anti-rato-biotina-MA (diluição 1:100) em 100 μL de tampão bloqueador celular por 1 h à temperatura ambiente. O dobro desse tempo de incubação para as amostras de tecido.
3. Lave as amostras quatro vezes em 200 μL de PBS por 5 min cada.

6. Ancoragem adicional

1. Incubar células com glutaraldeído (GA) a 0,25% em PBS (100 μL) por 15 min à temperatura ambiente, a fim de ancorar as proteínas no hidrogel. Alternativamente, use 25 mM ácido metacrílico N-hidroxisuccinimida éster (MA-NHS) para ancoragem. Uma hora de incubação à temperatura ambiente é encorajada.
2. Lave as amostras três vezes em PBS por 5 min cada.

7. Gelificação

NOTA: A velocidade de expansão é determinada pelo tempo de difusão de sal e água para fora ou para dentro do gel; assim, a fundição de géis finos acelera o tempo de expansão.

1. Remova a estrutura superior da placa de gel de 16 poços. Adicionar 40 μL de solução de monômero a cada poço para condicionar as células no gelo. Incubar no gelo por 5 min.
   1. Para preparar uma solução de monómero, ver Tabela 2.
2. Prepare a solução de gelificação no gelo. Adicionar água destilada dupla e acelerador de tetrametiletilenodiamina (TEMED) a 10% de N,N,N′ à solução de monómero (TEMED a 10%: solução de monómero = 1:47); ainda não adicione o iniciador (Tabela 3).
3. Para uma câmara de cultura celular com uma área de 0,4 cm², use um volume de solução de gelificação de cerca de 40 μL. Prepare 45 μL de solução de gelificação para cada poço.
4. Adicionar persulfato de amónio a 10% (APS) à solução de gelificação, incubar sobre gelo e pipetar imediatamente 40 μL de solução de gelificação em cada junta de silicone bem sobre gelo. Incubar sobre gelo por 3 min (10% APS:10% TEMED:solução de monômero = 1:1:47).
5. Proteger a amostra da luz e mover o vidro de cobertura da placa de Petri de 10 cm para uma incubadora de 37 °C durante 1,5 h para gelificação. Para manter a umidade do gel durante a incubação de 37 °C, cubra a placa de Petri com a tampa e coloque algumas gotas de água na placa de Petri.

8. Digestão

1. Após a gelificação, retire o vidro para separar o gel e transfira o gel para a placa de 6 poços. Digerir as células embutidas com 2 mL de tampão de digestão (Tabela 1) durante a noite à temperatura ambiente ou 4 h a 37 °C. Use pelo menos 10 vezes o excesso de volume de tampão de digestão.
2. Lave os géis com pelo menos um volume de água 10 vezes superior ao volume final do gel. Repita a etapa de lavagem quatro vezes por 20 a 30 minutos de cada vez. O gel se expande em cerca de duas vezes em cada dimensão.
   NOTA: As amostras de gel podem ser armazenadas por até 1 mês em um tampão PBS a 4 °C. Substitua qualquer água evaporada para evitar a secagem e proteja a amostra da luz durante o armazenamento. Para evitar a degradação das âncoras trifuncionais, as amostras devem ser coradas o mais rapidamente possível após a digestão e lavagem.

9. Coloração por fluorescência pós-digestão

1. Incubar géis em volume de 2 mL de tampão de coloração estreptavidina (STV)/digoxigenina (DIG) com corante STV de 2 a 5 μM e/ou corante anti-DIG por 24 h à temperatura ambiente. Mantenha as amostras no escuro.

10. Expansão

1. Lave e expanda o gel quatro vezes com excesso de água (2-3 mL) por 30 min a 1 h de cada vez.
2. Para facilitar a visualização das células sob microscopia fluorescente, core as células com DAPI durante a terceira das cinco lavagens. Diluir a concentração de DAPI (5 mg/ml, armazenada a 4 °C) em diluições 1:5.000 em água de lavagem. Incubar o gel com uma solução de DAPI-água (2 mL) por 30 min a 1 h.
3. Lave mais duas vezes com 3 mL de água.
4. Expanda os géis em qualquer prato plano que seja grande o suficiente para conter as amostras. Os géis expandidos que são preparados em vidro de cobertura de 0,4 cm² área se encaixam bem em uma placa de 6 poços com fundo de vidro.
   NOTA: Amostras coradas pós-expansão podem ser armazenadas por até 4 meses em um tampão PBS a 4 ° C. Adicione água suficiente para evitar a secagem e proteja a amostra do fotobranqueamento. Repita a etapa de expansão e coloração DAPI antes da imagem. Para evitar qualquer risco de degradação do fluoróforo, as amostras precisam ser fotografadas o mais rápido possível.

11. Imagens

1. Revestir a câmara de imagem do fundo de vidro de 6 poços com poli-L-lisina a 0,01% (3 mL cada) para imobilizar as amostras de gel.
2. Transfira amostras de gel para a câmara de imagem revestida.
3. Fotografe as amostras com quaisquer escopos de fluorescência desejados.

Resultados

Os poços revestidos de clatrina (CCPs) são imunocorados usando âncoras trifuncionais (Figura 1B) e o LR-ExM é realizado conforme descrito na Figura 1A. LR-ExM (Figura 2C,E) apresenta intensidade de fluorescência muito maior em comparação com a microscopia de expansão de retenção de proteínas (proExM, Figura 2A) ou biotina-ExM (Figura 2B); o sinal...

Discussão

A principal inovação do LR-ExM é usar âncoras trifuncionais para rotular efetivamente as proteínas-alvo e melhorar a qualidade da imagem. Este método é limitado por âncoras trifuncionais, que não estão tão prontamente disponíveis para os pesquisadores. No entanto, âncoras trifuncionais podem ser compartilhadas com outros pesquisadores mediante solicitação, e produtos semelhantes, como sondas ExM da Chrometa, agora também estão disponíveis comercialmente.

Neste protocolo, foi ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate