라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM)으로 초고해상도 이미징 및 고효율 라벨링 가능

요약

라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM) 프로토콜이 시연됩니다. LR-ExM은 새로운 다기능 앵커 세트를 사용하여 이전에 도입된 확장 현미경에 비해 더 나은 라벨링 효율성을 제공합니다.

초록

확장 현미경(ExM)은 대부분의 광학 현미경 방법과 결합하여 분해능을 높일 수 있는 샘플 준비 기술입니다. 세포 또는 조직을 팽윤성 하이드로겔에 매립한 후, 샘플은 원래 크기에 비해 물리적으로 3-16배(선형 치수)로 확장될 수 있습니다. 따라서 모든 현미경의 유효 해상도는 팽창 계수에 의해 증가합니다. 이전에 도입된 ExM의 주요 한계는 중합 및 소화 절차 후에 감소된 형광이다. 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 삼중 기능 앵커 세트를 사용하여 신호 손실을 방지하고 라벨링 효율성을 크게 향상시키는 라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM)이 개발되었습니다. 이 기술을 사용하면 최소한의 형광 신호 손실로 나노미터 규모의 세포 또는 세포하 구조를 조사할 때 더 높은 분해능을 달성할 수 있습니다. LR-ExM은 면역형광 라벨링뿐만 아니라 SNAP 및 CLIP-태그와 같은 자가 라벨링 단백질 태그와 함께 사용할 수 있어 라벨링 효율을 높일 수 있습니다. 이 연구는 이 면역염색 기반 접근법에 대한 절차 및 문제 해결뿐만 아니라 대안으로 LR-ExM의 자가 라벨링 태깅 접근법에 대한 논의를 제시합니다.

서문

확장 현미경(ExM)은 에피형광 및 컨포칼 현미경 1,2,3,4,5,6,7과 같은 기존 현미경으로 초고해상도 이미징을 달성하기 위한 편리한 접근 방식으로 처음 도입된 이후 연구자들에 의해 사용되어 왔습니다. . ExM을 사용하면 일반 컨포칼 현미경으로도 ~70nm의 측면 분해능을 달성할 수 있습니다. ExM을 초고해상도 이미징과 결합하면 해상도가 더욱 향상됩니다. 예를 들어, 구조 조명 현미경(SIM)으로 약 30nm, 확률적 광학 재구성 현미경(^STORM)으로 약 4nm 분해능을 달성할 수 있습니다^1,5.

그러나 낮은 라벨링 효율은 표준 ExM 분석법에서 중요한 문제입니다. 형광 손실은 형광 그룹의 유형과 분해 시간에 따라 달....

프로토콜

1. 세포 배양

1. 5%_CO2 중 37°C에서 10% FBS가 보충된 McCoy's 5A 배지에서 배양된 U2OS 세포를 사용한다.
2. 배양 세포를 취급의 용이성을 위해 16개의 잘 제거가능한 챔버 커버글라스(배양 영역 0.4^cm2) 상에 놓는다.

2. 고정 및 투과

참고: 고정 및 투과화 조건은 최적화된 면역염색 프로토콜에 따라 다릅니다. 다음은 공동 면역 염색 미세 소관 및 클라 트린 코팅 피트 (CCP)에 대한 고정 및 투과화 프로토콜입니다.

1. 세포 수가 ~0.04 x 10 6에 도달하면 실온에서 10분 동안 PEM 완충액(100mM PIPES, 1mM EGTA 및 1mM_MgCl2, pH^6.9)에 100μL의 3.2% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 고정합니다(표 1).
   알림: PFA를 사용한 고정은 인증된 안전 후드에서 수행됩니다.
2. 200μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 각각 5분 동안 세포를 3회 세척합니다.
3. 실온에서....

결과

클라트린 코팅 피트(CCP)는 삼작용성 앵커(그림 1B)를 사용하여 면역염색되고 LR-ExM은 그림 1A에 설명된 대로 수행됩니다. LR-ExM (그림 2C, E)은 단백질 보유 확장 현미경 (proExM, 그림 2A) 또는 비오틴 -ExM (그림 2B)에 비해 훨씬 높은 형광 강도를 보여줍니다. LR-ExM의 신호는 proExM보?.......

토론

LR-ExM의 핵심 혁신은 삼중 기능 앵커를 사용하여 표적 단백질을 효과적으로 라벨링하고 이미지 품질을 개선하는 것입니다. 이 방법은 연구자가 쉽게 사용할 수없는 삼중 기능 앵커에 의해 제한됩니다. 그러나 요청 시 삼중 기능 앵커를 다른 연구자와 공유할 수 있으며 Chrometa의 ExM 프로브와 같은 유사한 제품도 현재 상용화되고 있습니다.

이 프로토콜에서, 실온에서 1시간 인큐.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate