라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM)으로 초고해상도 이미징 및 고효율 라벨링 가능

요약

라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM) 프로토콜이 시연됩니다. LR-ExM은 새로운 다기능 앵커 세트를 사용하여 이전에 도입된 확장 현미경에 비해 더 나은 라벨링 효율성을 제공합니다.

초록

확장 현미경(ExM)은 대부분의 광학 현미경 방법과 결합하여 분해능을 높일 수 있는 샘플 준비 기술입니다. 세포 또는 조직을 팽윤성 하이드로겔에 매립한 후, 샘플은 원래 크기에 비해 물리적으로 3-16배(선형 치수)로 확장될 수 있습니다. 따라서 모든 현미경의 유효 해상도는 팽창 계수에 의해 증가합니다. 이전에 도입된 ExM의 주요 한계는 중합 및 소화 절차 후에 감소된 형광이다. 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 삼중 기능 앵커 세트를 사용하여 신호 손실을 방지하고 라벨링 효율성을 크게 향상시키는 라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM)이 개발되었습니다. 이 기술을 사용하면 최소한의 형광 신호 손실로 나노미터 규모의 세포 또는 세포하 구조를 조사할 때 더 높은 분해능을 달성할 수 있습니다. LR-ExM은 면역형광 라벨링뿐만 아니라 SNAP 및 CLIP-태그와 같은 자가 라벨링 단백질 태그와 함께 사용할 수 있어 라벨링 효율을 높일 수 있습니다. 이 연구는 이 면역염색 기반 접근법에 대한 절차 및 문제 해결뿐만 아니라 대안으로 LR-ExM의 자가 라벨링 태깅 접근법에 대한 논의를 제시합니다.

서문

확장 현미경(ExM)은 에피형광 및 컨포칼 현미경 1,2,3,4,5,6,7과 같은 기존 현미경으로 초고해상도 이미징을 달성하기 위한 편리한 접근 방식으로 처음 도입된 이후 연구자들에 의해 사용되어 왔습니다. . ExM을 사용하면 일반 컨포칼 현미경으로도 ~70nm의 측면 분해능을 달성할 수 있습니다. ExM을 초고해상도 이미징과 결합하면 해상도가 더욱 향상됩니다. 예를 들어, 구조 조명 현미경(SIM)으로 약 30nm, 확률적 광학 재구성 현미경(^STORM)으로 약 4nm 분해능을 달성할 수 있습니다^1,5.

그러나 낮은 라벨링 효율은 표준 ExM 분석법에서 중요한 문제입니다. 형광 손실은 형광 그룹의 유형과 분해 시간에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나 평균적으로 ExM의 중합 및 단백질 분해 단계 후에 형광단의 50% 이상이 손실되는 것으로 보고되었으며, 이는 이미징 품질 ^3,4에 해롭습니다.

따라서 라벨을 효율적으로 유지하고^{신호 손실을 줄일} 수 있는 라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM)이 개발되었습니다1. LR-ExM의 핵심 혁신은 관심 단백질을 염색하기 위해 표준 ExM 절차에서와 같이 형광 염료를 사용하는 대신 삼중 앵커 세트를 사용하는 것입니다. 이들 삼작용성 링커는 3개의 부분으로 구성된다: (1) 항체에 연결하는 커넥터 (예를 들어, N-하이드록시숙신이미드 (NHS)), (2) 단백질을 중합체에 앵커하는 앵커 (예를 들어, 메타크릴아미드 (MA)), 및 (3) 유기 염료에 접합하기 위한 리포터 (예를 들어, 비오틴 또는 디곡시제닌 (DIG)). 삼작용성 앵커는 중합 및 단백질 분해 단계에서 살아남아 형광단 손실을 방지합니다.

또한 이 방법은 SNAP 또는 CLIP과 같은 자체 라벨링 효소 태그와 호환되기 때문에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 효소 태그 접근법은 높은 특이성 및 표지 효율 ^8,9,10과 관련하여 면역염색 접근법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다.

이 원고에서는 LR-ExM의 자세한 절차를 보여줍니다. LR-ExM은 향상된 라벨링 효율성으로 높은 공간 해상도를 달성하는 매우 효과적이고 유연한 방법입니다.

프로토콜

1. 세포 배양

1. 5%_CO2 중 37°C에서 10% FBS가 보충된 McCoy's 5A 배지에서 배양된 U2OS 세포를 사용한다.
2. 배양 세포를 취급의 용이성을 위해 16개의 잘 제거가능한 챔버 커버글라스(배양 영역 0.4^cm2) 상에 놓는다.

2. 고정 및 투과

참고: 고정 및 투과화 조건은 최적화된 면역염색 프로토콜에 따라 다릅니다. 다음은 공동 면역 염색 미세 소관 및 클라 트린 코팅 피트 (CCP)에 대한 고정 및 투과화 프로토콜입니다.

1. 세포 수가 ~0.04 x 10 6에 도달하면 실온에서 10분 동안 PEM 완충액(100mM PIPES, 1mM EGTA 및 1mM_MgCl2, pH^6.9)에 100μL의 3.2% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 고정합니다(표 1).
   알림: PFA를 사용한 고정은 인증된 안전 후드에서 수행됩니다.
2. 200μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 각각 5분 동안 세포를 3회 세척합니다.
3. 실온에서 15분 동안 100μL의 투과화 완충액으로 세포를 투과화합니다(표 1).
   참고: 표적 단백질, RNA 또는 DNA 분해를 방지하고 최적의 결과를 얻기 위해 가능한 한 빨리 라벨링을 진행하십시오. 그러나 필요한 경우 고정 된 샘플을 4 ° C의 PBS 버퍼에 연장 된 시간 (최대 한 달) 동안 저장할 수 있습니다. 증발된 PBS를 교체하고 광퇴색으로부터 샘플을 보호합니다.

3. 내인성 스트렙타비딘 및 비오틴 차단

1. 세포 차단 완충액(100 μL)에 희석된 스트렙타비딘 용액과 함께 실온에서 15분 동안 세포를 배양한다(표 1).
2. 200μL의 세포 차단 완충액으로 간단히 헹굽니다.
3. 실온에서 15분 동안 세포 차단 완충액에 희석된 100μL의 비오틴 용액으로 세포를 배양합니다.
   참고: SNAP- 또는 CLIP- 태그 사용과 같이 자체 레이블 지정 태그 지정 방법을 사용하는 경우 4단계를 건너뛰고 5.1단계: 자체 레이블 지정 태그 지정 방법으로 진행합니다.

4. 1차 항체 염색

1. 쥐 항-α-튜불린 항체(1:500 희석) 및 토끼 항-클라트린 중쇄 항체(1:100 희석)와 함께 세포를 100μL의 세포 차단 완충액에서 4°C에서 16시간 또는 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 조직 샘플에 대한 배양 시간을 두 배로 늘립니다.
2. 200μL의 PBS로 샘플을 각각 5분 동안 4회 세척합니다.

5. LR-ExM 특이적 2차 항체 염색

1. IgG 항체를 N-하이드록시숙신이미드(NHS)-메타크릴아미드(MA)-비오틴 또는 NHS-MA-디곡시제닌(Dig)과 같은 삼관능성 링커와 접합합니다(그림 1B). 삼관능성 앵커의 합성 및 2차 항체의 접합은 이전에 Shi et ^al.1에 소개되었습니다. 자가 표지 태깅 접근법: IgG 항체를 삼관능성 링커, 예컨대 MA-벤질구아닌(BG)-비오틴 또는 MA-벤질시토신(BC)-디그와 접합시킨다(도 1B). 삼관능성 앵커의 합성 및 2차 항체의 접합은 이전에 Shi et ^al.1에 소개되었다.
2. 당나귀 항-토끼-Dig-MA(1:100 희석) 및 당나귀 항-래트-비오틴-MA(1:100 희석) 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 세포 차단 완충액 100μL로 세포를 배양합니다. 조직 샘플에 대해 이 배양 시간을 두 배로 늘립니다.
3. 샘플을 200μL의 PBS에서 각각 5분 동안 4회 세척합니다.

6. 추가 앵커링

1. 단백질을 하이드로겔 상에 고정시키기 위해 PBS(100μL) 중 0.25% 글루타르알데히드(GA)로 세포를 실온에서 15분 동안 배양한다. 또는 앵커링을 위해 25mM 메타크릴산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MA-NHS)를 사용하십시오. 실온에서 1 시간 배양하는 것이 좋습니다.
2. PBS에서 샘플을 각각 5분 동안 3회 세척합니다.

7. 겔화

알림: 팽창 속도는 소금과 물이 젤 밖으로 또는 젤로 확산되는 시간에 의해 결정됩니다. 따라서 얇은 젤을 주조하면 팽창 시간이 단축됩니다.

1. 16-웰 겔 플레이트의 상부 구조물을 제거한다. 각 웰에 40μL의 단량체 용액을 추가하여 얼음 위의 세포를 컨디셔닝합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
   1. 단량체 용액을 제조하려면 표 2를 참조하십시오.
2. 얼음 위에 겔화 용액을 준비하십시오. 이중 증류수와 10 % N, N, N', N'테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED) 촉진제를 단량체 용액에 첨가하십시오 (10 % TEMED : 단량체 용액 = 1:47). 아직 초기자를 추가하지 마십시오(표 3).
3. 면적이 0.4^cm2인 세포 배양 챔버의 경우, 약 40 μL의 겔화 용액 부피를 사용한다. 각 웰에 대해 45μL의 겔화 용액을 준비합니다.
4. 겔화 용액에 10% 과황산암모늄(APS)을 넣고 얼음 위에서 배양한 다음 즉시 40μL의 겔화 용액을 얼음 위의 각 실리콘 개스킷에 잘 피펫팅합니다. 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다(10% APS:10% TEMED:단량체 용액 = 1:1:47).
5. 빛을 으로부터 시료를 보호하고 겔화를 위해 10cm 페트리 접시의 커버 글라스를 37°C 인큐베이터로 1.5시간 동안 옮깁니다. 37°C 인큐베이션 동안 겔의 습도를 유지하기 위해, 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고, 페트리 접시에 몇 방울의 물을 넣는다.

8. 소화

1. 겔화 후, 유리를 제거하여 겔을 분리하고 겔을 6 웰 플레이트로 옮긴다. 2mL의 분해 완충액(표 1)으로 실온에서 밤새 또는 37°C에서 4시간 동안 포매된 세포를 분해합니다. 적어도 10배 초과량의 소화 완충액을 사용하십시오.
2. 최종 젤 부피보다 최소 10배 더 많은 양의 물로 젤을 세척하십시오. 매번 20 내지 30분 동안 세척 단계를 4회 반복한다. 젤은 각 차원에서 약 2 배 팽창합니다.
   참고: 겔 샘플은 4°C의 PBS 버퍼에 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. 건조를 피하기 위해 증발된 물을 교체하고 보관 중에 빛으로부터 샘플을 보호하십시오. 삼중 앵커의 분해를 방지하려면 소화 및 세척 후 가능한 한 빨리 샘플을 염색해야합니다.

9. 소화 후 형광 염색

1. 2mL 부피의 스트렙타비딘(STV)/디곡시제닌(DIG) 염색 완충액에 2-5μM STV-염료 및/또는 항-DIG 염료를 사용하여 실온에서 24시간 동안 겔을 배양합니다. 샘플을 어둠 속에 보관하십시오.

10. 확장

1. 과도한 물 (2-3 mL)로 매번 30 분에서 1 시간 동안 젤을 4 번 씻고 팽창시킵니다.
2. 형광 현미경으로 세포를 더 쉽게 시각화하려면 5회 세척 중 3차 세척 중에 DAPI로 세포를 염색합니다. 세척수에서 1:5,000 희석액으로 DAPI 스톡 농도(5mg/mL, 4°C에서 보관)를 희석합니다. DAPI-물 용액(2mL)과 함께 겔을 30분에서 1시간 동안 배양합니다.
3. 3mL의 물로 2회 더 세척합니다.
4. 샘플을 담을 수 있을 만큼 충분히 큰 평평한 접시에 젤을 펼칩니다. 0.4cm2 면적의 커버글라스 상에 제조된 팽창된 젤은 유리 바닥 6웰 플레이트에 잘 들어맞는다.
   참고: 팽창 후 염색된 샘플은 4°C의 PBS 버퍼에 최대 4개월 동안 보관할 수 있습니다. 건조를 방지하고 샘플을 광표백으로부터 보호하기 위해 충분한 물을 추가하십시오. 이미징하기 전에 확장 및 DAPI 염색 단계를 반복합니다. 형광단 분해의 위험을 방지하려면 가능한 한 빨리 샘플을 이미징해야 합니다.

11. 이미징

1. 6웰 유리 바닥 이미징 챔버를 0.01% 폴리-L-라이신(각각 3mL)으로 코팅하여 겔 샘플을 고정화합니다.
2. 겔 샘플을 코팅된 이미징 챔버로 옮깁니다.
3. 원하는 형광 스코프를 사용하여 샘플을 이미지화합니다.

결과

클라트린 코팅 피트(CCP)는 삼작용성 앵커(그림 1B)를 사용하여 면역염색되고 LR-ExM은 그림 1A에 설명된 대로 수행됩니다. LR-ExM (그림 2C, E)은 단백질 보유 확장 현미경 (proExM, 그림 2A) 또는 비오틴 -ExM (그림 2B)에 비해 훨씬 높은 형광 강도를 보여줍니다. LR-ExM의 신호는 proExM보?...

토론

LR-ExM의 핵심 혁신은 삼중 기능 앵커를 사용하여 표적 단백질을 효과적으로 라벨링하고 이미지 품질을 개선하는 것입니다. 이 방법은 연구자가 쉽게 사용할 수없는 삼중 기능 앵커에 의해 제한됩니다. 그러나 요청 시 삼중 기능 앵커를 다른 연구자와 공유할 수 있으며 Chrometa의 ExM 프로브와 같은 유사한 제품도 현재 상용화되고 있습니다.

이 프로토콜에서, 실온에서 1시간 인큐...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate