标签保留扩展显微镜 （LR-ExM） 可实现超分辨率成像和高效标记

摘要

展示了标签保留扩展显微镜（LR-ExM）的方案。LR-ExM使用一组新颖的三功能锚点，与之前引入的扩展显微镜相比，它提供了更好的标记效率。

摘要

膨胀显微镜（ExM）是一种样品制备技术，可以与大多数光学显微镜方法结合使用以提高分辨率。将细胞或组织包埋在可溶胀的水凝胶中后，与原始尺寸相比，样品可以物理扩展三到十六倍（线性尺寸）。因此，任何显微镜的有效分辨率都会因膨胀系数而增加。先前引入的ExM的一个主要限制是聚合和消化过程后的荧光降低。为了克服这一限制，已经开发了标签保留扩展显微镜（LR-ExM），它使用一组新型的三功能锚点来防止信号损失并大大提高标记效率。该技术允许人们在纳米级研究细胞或亚细胞结构时实现更高的分辨率，同时将荧光信号损失降至最低。LR-ExM不仅可以用于免疫荧光标记，还可以与自标记蛋白标签（如SNAP-和CLIP-标签）一起使用，从而实现更高的标记效率。这项工作介绍了这种基于免疫染色的方法的程序和故障排除，以及LR-ExM作为替代方案的自标记标记方法的讨论。

引言

扩展显微镜（ExM）自首次作为传统显微镜（如落射荧光和共聚焦显微镜1，²，³，⁴，^5，6，⁷）实现超分辨率成像的便捷方法而引入以来，就已被研究人员使用.使用ExM，即使使用常规共聚焦显微镜也可以实现~70 nm的横向分辨率。当ExM与超分辨率成像相结合时，分辨率会进一步提高。例如，使用结构照明显微镜 （SIM） 可以实现大约 30 nm 的分辨率，使用随机光学重建显微镜 （STORM） 可以实现大约 4 nm 的分辨率^1，5。

然而，低标记效率是标准ExM方法的一个关键问题。荧光损失可能因荧光基团的类型和消化时间而异。然而，据报道，平均而言，在ExM的聚合和蛋白质消化步骤之后，超过50%的荧光团丢失，这对^{成像质量不利}3^，4。

因此，已经开发了标签保留扩展显微镜（LR-ExM），它可以有效地保留标签并减少信号损失¹。LR-ExM的关键创新是使用一组三功能锚，而不是仅仅使用荧光染料 - 如标准ExM程序 - 用于对感兴趣的蛋白质进行染色。这些三官能团接头由三部分组成:（1）连接到抗体的连接器（例如，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）），（2）锚定（例如，甲基丙烯酰胺（MA））将蛋白质锚定到聚合物上，以及（3）报告基因（例如，生物素或地高辛（DIG））与有机染料偶联。三官能团锚在聚合和蛋白质消化步骤中存活，因此可防止荧光团损失。

此外，该方法具有巨大的潜力，因为它与自标记的酶标签（如SNAP或CLIP）兼容。与免疫染色方法相比，酶标签方法在高特异性和标记效率方面具有一些优势⁸，^9，10。

在本手稿中，演示了LR-ExM的详细程序。LR-ExM是一种高效且灵活的方法，可实现高空间分辨率和增强的标记效率。

研究方案

1. 细胞培养

1. 使用在McCoy的5A培养基中培养的U2OS细胞，该培养基在37°C的5%CO₂中补充有10%FBS。
2. 将细胞培养到16孔可拆卸的腔室盖玻片（培养区域0.4cm²）上，以便于处理。

2. 固定和透化

注意:固定和透化条件取决于优化的免疫染色方案。以下是共免疫染色微管和网格蛋白包被坑 （CCP） 的固定和透化方案。

1. 一旦细胞计数达到~0.04 x 10 6，在室温下将细胞与100μL的3.2%多聚甲醛（PFA）固定在PEM缓冲液（100mM PIPES，1mM EGTA和1mM MgCl₂，pH^6.9）中10分钟（表1）。
   注意:使用PFA的固定是在经过认证的安全罩中进行的。
2. 用 200 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
3. 用100μL透化缓冲液在室温下透化细胞15分钟（表1）。
   注意:尽快进行标记，以避免靶蛋白，RNA或DNA降解，并获得最佳结果。但是，如果需要，固定样品可以在4°C的PBS缓冲液中长时间储存（长达一个月）。 更换任何蒸发的PBS并保护样品免受光漂白。

3. 内源性链霉亲和素和生物素阻断

1. 将细胞与在细胞封闭缓冲液（100μL）中稀释的链霉亲和素溶液在室温下孵育15分钟（表1）。
2. 用 200 μL 细胞封闭缓冲液短暂冲洗。
3. 将细胞与在细胞封闭缓冲液中稀释的 100 μL 生物素溶液在室温下孵育 15 分钟。
   注意:使用自标记标记方法（例如使用 SNAP 或 CLIP- 标记）时，请跳过步骤 4，然后继续执行步骤 5.1:自标记标记方法。

4. 一抗染色

1. 用大鼠抗α-微管蛋白抗体（1:500稀释）和兔抗网格蛋白重链抗体（1:100稀释）在100μL细胞封闭缓冲液中孵育细胞在4°C下孵育16小时或在室温下孵育1小时。将组织样品的孵育时间加倍。
2. 用 200 μL PBS 洗涤样品四次，每次 5 分钟。

5. LR-ExM特异性二抗染色

1. 与三官能团接头（如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）-甲基丙烯酰胺（MA）-生物素或NHS-MA-地高辛（Dig））的偶联IgG抗体（图1B）。三官能锚的合成和二抗的偶联先前在Shi等人1中^介绍过。自标记标记方法:将IgG抗体与三功能接头偶联，例如MA-苄基鸟嘌呤（BG）-生物素或MA-苄基胞嘧啶（BC）-Dig（图1B）。三官能锚的合成和二抗的偶联先前在Shi等人1中介绍^过。
2. 将细胞与驴抗兔-Dig-MA（1:100稀释）和驴抗大鼠生物素-MA（1:100稀释）二抗在100μL细胞封闭缓冲液中孵育1小时。组织样品的孵育时间加倍。
3. 在 200 μL PBS 中洗涤样品四次，每次 5 分钟。

6. 附加锚定

1. 在室温下将细胞与0.25%戊二醛（GA）在PBS（100μL）中孵育15分钟，以使蛋白质锚定在水凝胶上。或者，使用25 mM甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MA-NHS）进行锚定。鼓励在室温下孵育一小时。
2. 在PBS中洗涤样品三次，每次5分钟。

7. 凝胶化

注意:膨胀速度由盐和水流出或进入凝胶的扩散时间决定;因此，浇注薄凝胶可加快扩增时间。

1. 去除16孔凝胶板的上部结构。向每个孔中加入 40 μL 单体溶液以调理冰上的细胞。在冰上孵育5分钟。
   1. 要制备单体溶液，请参见 表2。
2. 在冰上制备凝胶溶液。在单体溶液中加入双蒸水和10%N，N，N′，N′四甲基乙二胺（TEMED）促进剂（10%TEMED:单体溶液= 1:47）;不要添加启动器（表 3）。
3. 对于面积为 0.4 cm² 的细胞培养室，使用约 40 μL 的凝胶溶液体积。 为每个孔准备 45 μL 凝胶溶液。
4. 向凝胶溶液中加入 10% 过硫酸铵 （APS），在冰上孵育，并立即将 40 μL 凝胶溶液移液到冰上每个硅胶垫圈孔中。在冰上孵育3分钟（10%APS:10%TEMED:单体溶液= 1:1:47）。
5. 保护样品免受光照，并将10cm培养皿中的盖玻片移至37°C培养箱中1.5小时以进行凝胶化。为了在37°C孵育期间保持凝胶的湿度，用盖子盖住培养皿，并在培养皿中滴几滴水。

8. 消化

1. 凝胶化后，取出玻璃以分离凝胶并将凝胶转移到6孔板中。用2mL消化缓冲液（表1）在室温下或37°C下消化4小时。 使用至少 10 倍多余体积的消化缓冲液。
2. 用比最终凝胶体积多10倍的水洗涤凝胶。重复洗涤步骤四次，每次20至30分钟。凝胶在每个维度上膨胀约两倍。
   注意:凝胶样品可在4°C的PBS缓冲液中储存长达1个月。 更换任何蒸发的水以避免干燥，并在储存过程中保护样品避光。为避免三官能锚降解，样品应在消化和洗涤后尽快染色。

9. 消化后荧光染色

1. 将凝胶在 2 mL 体积的链霉亲和素 （STV）/地高辛 （DIG） 染色缓冲液中与 2 至 5 μM STV 染料和/或抗 DIG 染料在室温下孵育 24 小时。将样品放在黑暗中。

10. 扩展

1. 用过量的水（2-3mL）洗涤并展开凝胶四次，每次30分钟至1小时。
2. 为了在荧光显微镜下更容易地观察细胞，在五次洗涤中的第三次洗涤期间用DAPI对细胞进行染色。在洗涤水中以 1:5，000 稀释液稀释 DAPI 原液浓度（5 mg/mL，储存在 4 °C）。将凝胶与DAPI水溶液（2mL）孵育30分钟至1小时。
3. 用 3 mL 水再清洗两次。
4. 在任何足够大的扁平培养皿中扩增凝胶以容纳样品。在0.4cm² 面积盖玻片上制备的膨胀凝胶非常适合玻璃底部6孔板。
   注意:膨胀后染色的样品可以在4°C的PBS缓冲液中储存长达4个月，加入足够的水以避免干燥并保护样品免受光漂白。成像前重复扩增和DAPI染色步骤。为避免荧光基团降解的风险，需要尽快对样品进行成像。

11. 成像

1. 用 0.01% 聚-L-赖氨酸（每个 3 mL）涂覆 6 孔玻璃底部成像室以固定凝胶样品。
2. 将凝胶样品转移到包被的成像室中。
3. 使用任何所需的荧光范围对样品进行成像。

结果

使用三功能锚对Clathrin包被的凹坑（CCP）进行免疫染色（图1B），并如图1A所述进行LR-ExM。与蛋白质保留扩展显微镜（proExM，图2A）或生物素-ExM（图2B）相比，LR-ExM（图2C，E）显示出更高的荧光强度;LR-ExM的信号比proExM高约六倍（图2D）。LR-ExM可以有效地...

讨论

LR-ExM的关键创新是使用三功能锚点有效地标记目标蛋白并提高图像质量。这种方法受到三功能锚的限制，研究人员并不容易获得三功能锚。然而，三功能锚可以根据要求与其他研究人员共享，类似的产品，如Chrometa的ExM探针现在也可以商业化。

在该协议中，一抗和二抗染色步骤已在室温下孵育1小时。然而，这些步骤也可以在4°C下过夜，并且观察到过夜染色降低了背景噪音。<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate