دراسة تأثير المبيدات الحشرية على الخلايا العصبية Caenorhabditis elegans

Summary

تتعرض الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans البالغة لتركيزات مختلفة من المبيدات التجارية أو غيرها من المواد السامة لمدة 2-24 ساعة. بعد ذلك ، يمكن تصور الخلايا العصبية المختلفة باستخدام سلالات التعبير عن الفلورسنت. توضح هذه الورقة كيفية تعريض الديدان الخيطية للمبيدات الحشرية وتقييم تلف الخلايا العصبية.

Abstract

Caenorhabditis elegans هو كائن حي نموذجي قوي يستخدم في العديد من مختبرات الأبحاث لفهم عواقب التعرض للملوثات الكيميائية والمبيدات الحشرية ومجموعة واسعة من المواد السامة. هذه الديدان الخيطية سهلة الاستخدام ويمكن استخدامها لتوليد نتائج بحثية جديدة ، حتى في مختبر البيولوجيا الجامعي. تقوم سلسلة مختبرية متعددة الأسابيع من المشاريع البحثية الأصيلة التي يحركها الطلاب بتدريب الطلاب على مجموعة أدوات من التقنيات والنهج في القياسات السلوكية وبيولوجيا الخلية والفحص المجهري التي يطبقونها بعد ذلك على مشاريعهم. إحدى التقنيات في مجموعة الأدوات هذه هي تحديد النسبة المئوية للخلايا العصبية التي تظهر أضرارا تنكسية عصبية بعد التعرض لمادة كيميائية سامة مثل مبيد حشري. يمكن أن تتعرض الديدان الخيطية C. elegans البالغة من الشباب لتركيزات مختلفة من المبيدات الحشرية المتاحة تجاريا أو أنواع أخرى من المواد السامة لمدة 2-24 ساعة. بعد ذلك ، يمكن للطلاب الجامعيين تصور أنواع فرعية مختلفة من الخلايا العصبية باستخدام سلالات التعبير عن الفلورسنت من C. elegans. لا تتطلب هذه التقنيات برامج متطورة لمعالجة الصور وهي فعالة حتى في التكبيرات المنخفضة ، مما يجعل الحاجة إلى الفحص المجهري البؤري المكلف غير ضرورية. توضح هذه الورقة كيفية علاج الديدان الخيطية بالمبيدات الحشرية وكيفية تصوير الخلايا العصبية وتسجيلها. كما يوفر بروتوكولا مباشرا للفحص المجهري وتحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية. المواد المستخدمة لهذه التقنية غير مكلفة ومتاحة بسهولة في معظم أقسام البيولوجيا الجامعية. يمكن الجمع بين هذه التقنية والتدابير السلوكية مثل الحركة أو التباطؤ القاعدي أو وضع البيض لإجراء سلسلة من التجارب التي يمكن نشرها وإعطاء طلاب البكالوريوس تجربة بحثية حقيقية بتكلفة منخفضة للغاية.

Introduction

Caenorhabditis elegans هو كائن حي نموذجي ممتاز للتدريب على الدورات المختبرية في دورات العلوم البيولوجية لطلاب المستوى التمهيدي والمتوسط. يمكن استخدام هذا الإجراء المختبري كجزء من وحدة متعددة الأسابيع تستكشف الآثار المختلفة للمبيدات الحشرية شائعة الاستخدام على سلوك C. elegans وبيولوجيا الخلية. يمكن للطلاب تعلم كيفية تصميم وتنفيذ مشاريع مستقلة تعلمهم مهارات تحليل البيانات والعرض. تركز هذه الورقة على بروتوكولات تعريض C. elegans لمخاليط المبيدات الحشرية ثم مراقبة وتحليل التأثيرات على مورفولوجيا الخلايا العصبية.

تستخدم مخاليط مبيدات الآفات الكيميائية في الحديقة على نطاق واسع للاستخدام السكني والزراعي ويمكن شراؤها من أي متجر حديقة محلي. هناك قلق متزايد بشأن سلامة هذه المواد الكيميائية للبشر والحياة البرية¹،^2،3. يمكن للطلاب قراءة الأدبيات العلمية واختيار مبيد للآفات للتقييم التجريبي ، وبذلك ، يمكنهم التعرف على البيولوجيا الأساسية والبيولوجيا العصبية ، بالإضافة إلى المهارات المختبرية المهمة مثل التصميم التجريبي والتحليل ، ومهارات المختبر العامة مثل السحب والتخفيفات التسلسلية ، وتشريح المجهر ، والمجهر الفلورسنت ، والتصوير الرقمي ، وإنتاج الأرقام.

يمكن أن تكون البروتوكولات الموصوفة في هذه الورقة قائمة بذاتها في دورة متوسطة المستوى في علم الأحياء أو علم الأعصاب أو أن تكون جزءا من وحدة متعددة الأسابيع يمكن أن تشمل أيضا قياسات للسلوكيات التي تحكمها مجموعات معينة من الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، الموصوف في هذا البروتوكول هو تقييم لمورفولوجيا الخلايا العصبية الكولينية التي تحكم الحركة باستخدام سلالة من الديدان الخيطية التي تعبر عن GFP (LX 929) في الخلايا العصبية الكولينية⁴. يمكن الحصول على هذه السلالات بأسعار منخفضة للغاية من مركز Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). السلالات التي تعبر عن GFP في الخلايا العصبية الدوبامينية (OH 7457) أو الخلايا العصبية الكولينية (LX 929) أو mCherry المعبر عنها في جميع الخلايا العصبية (PVX4) كلها خيارات جيدة. يمكن للطلاب أيضا قياس الحركة والحصول على بيانات لمرافقة تقييم المورفولوجيا. يمكن العثور على وصف كامل لمشروع مجموعة طلابية لعدة أسابيع في Susman⁵.

مشروع مجموعة الطلاب هذا غير مكلف للغاية وسهل الإعداد لمجموعات من أربعة طلاب. وتشمل المواد اللازمة مجهر تشريح ، والوصول إلى المجهر المركب الفلوري الذي يمكن أن يحتوي على كاميرا رقمية مرفقة ، وألواح بتري والوصول إلى أجار نمو الديدان الخيطية ، والبكتيريا المحدودة النمو (سلالة OP50 ، من CGC) ، وموقد بنسن لهب الغاز أو مصباح الكحول ، والأوتوكلاف ، والأسلاك البلاتينية ، ولوازم المختبرات العامة مثل الماصة الدقيقة ، وشرائح المجهر ، أغطية ، وماصات باستور الزجاجية. اعتمادا على المادة السامة الكيميائية التي يتم فحصها من قبل مجموعات الطلاب ، قد تحتاج الخطوات الواردة في البروتوكول إلى أن تحدث تحت غطاء الدخان أو مع القفازات. يستخدم هذا البروتوكول مخاليط كيميائية قابلة للذوبان في الماء (غير متقلبة) ، ويتم اتباع جميع إجراءات المناولة الآمنة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.

Protocol

كان كل استخدام للحيوانات اللافقارية ممتثلا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات واستخدامها في المؤسسة.

1. إعداد لوحات بتري المغلفة بالمبيدات الحشرية

1. تحضير أطباق أجار بتري (قطرها 6 سم تعمل بشكل أفضل) باستخدام الإجراءات القياسية⁶.
   ملاحظة: يمكن صنعها قبل أشهر وتخزينها في الثلاجة حتى الاستخدام. أحضر الأطباق إلى درجة حرارة الغرفة (RT) على سطح الطاولة. في معظم الحالات ، يجب تزويد مجموعات الطلاب بلوحة لكل تخفيف لخليط المبيدات الحشرية ، بما في ذلك التحكم في المياه.
2. قم بإعداد 1 مل من كل تخفيف للمبيد المختار في أنابيب microfuge 1.5 mL الملصقة. للتعامل الآمن ، تأكد من قراءة التعليمات وتوفير القفازات ، أو العمل في غطاء الدخان ، إذا اقترح ذلك.
   ملاحظة: التخفيفات المقترحة للاختبار: 1 مل من مبيد الآفات كامل القوة، 1:10 التخفيف في الماء (100 ميكرولتر من المبيدات، 900 ميكرولتر من الماء المقطر)، 1:100 التخفيف (10 ميكرولتر من المبيدات، 990 ميكرولتر من الماء)، 1:1000 التخفيف (10 ميكرولتر من التخفيف 1:10، 990 ميكرولتر من الماء)، إلخ.
3. اصنع موزعا للمحلول عن طريق ثني ماصة باستور الزجاجية بعناية (بحجم 9 مل) في لهب موقد بنسن. استخدم اللهب لإغلاق فتحة الماصة. ثم يقوم الإيثانول بتعقيم الموزع قبل كل انتشار على لوحة بيتري.
4. باستخدام ماصة دقيقة ، ضع 100 ميكرولتر من التخفيف (أو التحكم في الماء) على وسط الآجار وانتشر بلطف عبر السطح باستخدام الموزع المعقم. أعد تعقيم الموزع قبل كل استخدام.
5. ضع أطباق بتري المغطاة جانبا ، واترك المحلول ينقع في السطح حتى "يجف".
   ملاحظة: اعتمادا على مستويات المبيدات الحشرية والرطوبة في المختبر، قد يستغرق ذلك بعض الوقت. قد يحتاج الطلاب إلى إعداد لوحاتهم في اليوم السابق لفترة التعرض.
6. بالنسبة لفترات التعرض التي تزيد عن 12 ساعة ، أضف 50 ميكرولتر من ثقافة الإشريكية القولونية بين عشية وضحاها إلى الألواح قبل إضافة الديدان الخيطية. بالنسبة للتجارب الحادة (12 ساعة أو أقل) ، ليست هناك حاجة إلى وجود E. coli على اللوحات.

2. إضافة الديدان الخيطية إلى الألواح المغلفة بالمبيدات الحشرية

ملاحظة: سيحتاج الطلاب إلى الحصول على طبق من الديدان الخيطية البالغة (ثقافات 5 أيام هي الأفضل) من سلالة الفلورسنت LX929 ، والتي تتوفر من مركز Caenorhabditis elegans Genetics Center. هناك إجراءان ممكنان لذلك. إذا كان لدى الطلاب خبرة سابقة في العمل مع الديدان الخيطية (على سبيل المثال، إذا كان هذا الإجراء جزءا من تمرين متعدد الأسابيع وتعلموا بالفعل كيفية اختيار الديدان الخيطية باستخدام اختيار الدودة)، فاستخدم الخطوة 2.1. إذا لم يكن الأمر كذلك، فاستخدم الخطوة 2.2.

1. اختيار الديدان الخيطية مع اختيار دودة. قم بتصميم دودة من قطعة 1 في سلك البلاتين الذي يتم إذابته إلى ماصة باستور باستخدام لهب موقد بنسن. التقط فقاعة صغيرة من الإشريكية القولونية اللزجة على القطعة ثم التقط الديدان الخيطية البالغة باستخدام الفقاعة اللزجة. للحصول على حجم عينة لائق ، اختر 10 ديدان خيطية لكل لوحة معالجة.
   ملاحظة: يمكن للطلاب الذين ليس لديهم خبرة كبيرة اتباع الخطوات 2.2-2.3.
2. استخدم ماصة دقيقة لوضع 1 مل من الماء المعقم على صفيحة الديدان الخيطية. حرك الماء حولها لرفع الديدان الخيطية ، ثم أزل السائل مع الديدان الخيطية إلى أنبوب microfuge سعة 1.5 مل.
3. دع الديدان الخيطية تستقر عن طريق الجاذبية لمدة 10 دقائق تقريبا ، ثم قم بإزالة ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من الماء بعناية وتخلص منها. أعد تعليق الديدان الخيطية ، وباستخدام طرف ماصة أصفر مقطوع ، قم بإزالة 50-100 ميكرولتر من الديدان العالقة إلى كل لوحة معالجة. تأكد من أن كل لوحة تحتوي على 10 ديدان بالغة على الأقل.
4. قم بتعيين مؤقت ، أو لاحظ الوقت ، وقم بفضح الديدان الخيطية في RT للفترة الزمنية المختارة. خلال وقت التعرض المختار ، قم بإعداد شرائح المجهر للحوامل الرطبة. يجب أن تصنع الشرائح في نفس يوم الفحص المجهري.
   ملاحظة: ستكون مجموعات الطلاب قد اختارت وقت تعرضها أثناء التخطيط لدراستها المستقلة.

3. إعداد شرائح المجهر للحوامل الرطبة

ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات من 3.1 إلى 3.3 بواسطة كل مجموعة طلاب. قم بإعداد ثلاث شرائح لكل منها.

1. قم بإعداد شريحتين عن طريق وضع قطعة من شريط التسمية على جانب واحد فقط من الشريحة (الشكل 1، اللوحة اليسرى). يستخدم الشريط لإنشاء السماكة الصحيحة للأغاروز لتشكيل وسادة ذات سمك موحد. ثم ضع شريحة نظيفة وغير مستخدمة بينهما على سطح الطاولة ، كما هو موضح في الشكل.
2. استخدم جهاز ماصة دقيقة لوضع قطرة 10 ميكرولتر من الأغاروز المذاب (3٪ في ddH₂O ، يتم تسخينها باستخدام سخان كتلة جافة 65 درجة مئوية) في وسط الشريحة الموجودة في المنتصف.
3. قم بتسطيح القطرة عن طريق وضع شريحة نظيفة أخرى في الأعلى ، عمودية على الشريحة مع الإسقاط ، كما هو موضح في الشكل (الشكل 1 ، اللوحة اليمنى). تسطيح عن طريق تطبيق الضغط ، وبالتالي فإن قطرة الأغاروز تشكل سمك شريط وضع العلامات.
4. سوف يتصلب الأغاروز في غضون حوالي 1 دقيقة. ثم قم بتطبيق ضغط ثابت لفصل الشريحتين. سوف تلتصق دائرة أجار بإحدى الشرائح. ضع هذه الشريحة ، جانب أجار لأعلى ، على سطح الطاولة ، واتركها لتجف لمدة 1-2 دقيقة قبل الاستخدام.

4. تركيب الديدان الخيطية الحية على شرائح المجهر

1. لإضافة الديدان الخيطية إلى الشريحة المحضرة باستخدام وسادة الأغاروز ، أضف قطرة ماء سعة 5 ميكرولتر تحتوي على 1 مليون أزيد صوديوم (NaN₃) إلى وسادة الأجار. هذا الحل يخدر الديدان ويشل حركتها.
   تنبيه: يمكن أن يسبب محلول مخزون أزيد الصوديوم المرض إذا تم تناوله.
2. ثم انقل الديدان الخيطية (10 على الأقل لكل شريحة علاج) إلى القطرة باستخدام اختيار الدودة. قم بتعقيم القطف قبل وبعد استخدامه لنقل الديدان الخيطية.
3. استخدم الملقط لإضافة غطاء عن طريق وضعه بزاوية وخفضه ببطء. امنع الغطاء من الانزلاق أو الانخفاض بسرعة كبيرة باستخدام قلم رصاص أو مسبار معدني.
4. ضع الحامل الرطب المحضر على مجهر الفلورسنت لمراقبة الديدان ، أولا تحت 10x التكبير وتباين الطور ، ثم تحت التكبير 40x مع تباين الطور والإضاءة الفلورية.

5. المجهر الفلورسنت

ملاحظة: يجب على مجموعات الطلاب عمل تركيب رطب لعدة ديدان من كل نوع على شرائح مجهرية منفصلة ، والتي يجب عليهم تسميتها بشكل مناسب. التعليمات التالية هي نصائح عامة حول استخدام المجهر المركب الفلوري القياسي الذي يمكن أن يحتوي على إعداد ثلاثي الأوعية المرفق وكاميرا رقمية ونظام كمبيوتر. يظهر الإعداد المستخدم لهذه المخطوطة في الشكل 2. يجب أن يكون الطلاب على دراية بإعدادات المجهر ، بما في ذلك الأهداف ، وأنواع مرشحات الضوء ، والقدرة على التبديل بين الضوء الساطع والضوء الفلوري ، وكيفية إرسال الإشارة الضوئية إلى الكاميرا الرقمية ، وما إلى ذلك.

1. ضع حاملا رطبا معدا في كل مرة على مرحلة المجهر وقم بتثبيته في مكانه باستخدام مقاطع مرحلة المجهر.
2. ابدأ في عرض الحوامل الرطبة من خلال العرض الأول بأقل هدف تكبير، والذي عادة ما يكون 10x، واستخدم تباين المجال أو الطور الساطع لتصور الديدان الخيطية والتركيز عليها.
3. بمجرد وجود الديدان الخيطية في مجال الرؤية ، ركز عليها باستخدام مقبض التركيز البؤري الدقيق على المجهر. قم بتبديل الإضاءة إلى التألق عن طريق تدوير القرص. ثم قم بتوجيه الضوء إلى الكاميرا لالتقاط الصور الرقمية. اضبط الإضاءة باستخدام برنامج التصوير بحيث تكون الخلايا العصبية مضاءة بشكل ساطع ولكن ليست مشبعة.
4. في مرحلة ما، احصل على صورة منفصلة لمسطرة بنفس تكبير صور الخلية لتوفير مقياس تكبير لشكلها. ضع قسما قصيرا من مسطرة شفافة، أو شريحة ميكرومتر، على مرحلة المجهر، وركز عليها باستخدام مقبض التركيز البؤري الدقيق، واحصل على صورة باستخدام برنامج التصوير.
5. احصل على صور إضافية (من 10 ديدان خيطية منفصلة على الأقل) بتكبيرات أعلى، إن أمكن. من المرجح أن يؤدي الضوء الشديد إلى تبييض المنطقة التي يتم تصويره منها ، لذا راقب التصوير بعناية ولا تسمح للضوء بالبقاء على نفس المنطقة من الشريحة لفترات طويلة من الزمن. تأكد من تسمية الصور المكتسبة لتتبع الديدان الخيطية والمنطقة ، وكذلك العلاج والتكبير.
6. قم بعمل مجلد على الكمبيوتر وانقل الصور إلى المجلد لاستخدامها في التحليل وإعداد الشكل.

6. مقياس تقييم السلامة المورفولوجية

ملاحظة: من الخصائص الخلوية الرئيسية للتلف العصبي التنكسي في الخلايا العصبية تغيير مورفولوجيا السوما. هناك ثلاثة مورفولوجيات يمكن مشاهدتها وحسابها بسهولة.

1. عد الخلايا العصبية ذات العمليات الفلورية السلسة والمنتظمة وأجسام الخلايا غير المستديرة كالمعتاد، كما هو موضح في الشكل 3.
2. غالبا ما تصبح السوما مستديرة ومتورمة مقارنة بالخلايا العصبية الشابة السليمة. عد الخلايا العصبية التي تبدو هكذا على أنها "مستديرة".
3. يمكن أن تظهر الخلايا العصبية ذات العمليات العصبية الطويلة الخفقان ، حيث توجد بوصمة مستديرة أو حتى فجوات في العمليات. عد الخلايا العصبية التي تظهر هذه الميزات على أنها "مبللة".

7. تحليل البيانات وإعداد الأرقام

1. إذا تم حساب النسبة المئوية الصحية (بدون تقريب ، لا تبييض) والنسبة المئوية للضعف (التقريب و / أو التبييض) لما لا يقل عن عشرة ديدان خيطية لكل علاج (الشكل 3) ، فقم بإجراء تحليل إحصائي باستخدام البرامج الإحصائية المتاحة.
2. عد جميع الخلايا العصبية التي تم وضع علامة عليها بشكل فلوري ، مع الاحتفاظ بحصيلة لتلك التي تظهر مورفولوجيا طبيعية ، أو مورفولوجيا النفخ ، أو مورفولوجيا التقريب ، ثم احسب النسبة المئوية لكل مورفولوجيا من إجمالي العدد لكل ديدان خيطية تم تحليلها.
3. لإعداد الأشكال ، قم باستيراد الصور إلى برنامج مناسب مثل Powerpoint ثم أضف تسميات وشريط مقياس استنادا إلى المسطرة أو صورة الميكرومتر التي تم الحصول عليها.

النتائج

توفر الأساليب والبروتوكولات الموضحة في هذه الورقة مهارات مختبرية مهمة لطلاب المرحلة الجامعية المتوسطة في علم الأحياء أو علم الأعصاب. يمكن للطلاب اكتساب خبرة مهمة في تطوير مشروع مستقل وإجراء تجربة من تصميمهم الخاص التي يمكن أن توفر نتائج جديدة. يوضح الشكل 3 النتيجة المثلى ...

Discussion

تعمل البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة بنجاح بمفردها أو كجزء من مشروع مجموعة طلابية مستقلة لعدة أسابيع. كما أن البروتوكولات قابلة للتجارب الاستكشافية المستقلة لمدة أسبوع واحد. سلالات الديدان الخيطية رخيصة وسهلة الصيانة في مختبر البحوث. يمكن للطلاب بسهولة تعلم كيفية اختيار الديدان با...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250