Examen de l’effet des pesticides sur les neurones de Caenorhabditis elegans

Résumé

Les nématodes Caenorhabditis elegans jeunes adultes sont exposés à différentes concentrations de pesticides commerciaux ou d’autres toxiques pendant 2 à 24 h. Ensuite, différents neurones peuvent être visualisés à l’aide de souches exprimant la fluorescence. Cet article montre comment exposer les nématodes aux pesticides et évaluer les dommages aux neurones.

Résumé

Caenorhabditis elegans est un puissant organisme modèle utilisé dans de nombreux laboratoires de recherche pour comprendre les conséquences de l’exposition aux polluants chimiques, aux pesticides et à une grande variété de substances toxiques. Ces nématodes sont faciles à utiliser et peuvent être utilisés pour générer de nouveaux résultats de recherche, même dans le laboratoire de biologie de premier cycle. Une série de laboratoires de plusieurs semaines de projets de recherche authentiques dirigés par des étudiants forme les étudiants à une boîte à outils de techniques et d’approches en mesures comportementales, en biologie cellulaire et en microscopie qu’ils appliquent ensuite à leurs projets. Une technique de cette boîte à outils consiste à quantifier le pourcentage de neurones présentant des dommages neurodégénératifs à la suite d’une exposition à un toxique chimique comme un pesticide. Les nématodes C. elegans jeunes adultes peuvent être exposés à différentes concentrations de pesticides disponibles dans le commerce ou d’autres types de toxiques pendant 2 à 24 h. Ensuite, les étudiants de premier cycle peuvent visualiser différents sous-types de neurones en utilisant des souches de C. elegans exprimant la fluorescence. Ces techniques ne nécessitent pas de logiciel de traitement d’image sophistiqué et sont efficaces même à faible grossissement, ce qui rend inutile le besoin d’une microscopie confocale coûteuse. Cet article montre comment traiter les nématodes avec des pesticides et comment imager et marquer les neurones. Il fournit également un protocole simple pour la microscopie et l’analyse de la morphologie des neurones. Les matériaux utilisés pour cette technique sont peu coûteux et facilement disponibles dans la plupart des départements de biologie de premier cycle. Cette technique peut être combinée avec des mesures comportementales telles que la locomotion, le ralentissement basal ou la ponte pour mener une série d’expériences potentiellement publiables et donner aux étudiants de premier cycle une expérience de recherche authentique à un coût très faible.

Introduction

Caenorhabditis elegans est un excellent organisme modèle pour la formation en laboratoire dans les cours de sciences biologiques pour les étudiants de niveau d’introduction et intermédiaire. Cette procédure de laboratoire peut être utilisée dans le cadre d’un module de plusieurs semaines qui explore divers effets des pesticides couramment utilisés sur le comportement de C. elegans et la biologie cellulaire. Les étudiants peuvent apprendre à concevoir et à réaliser des projets indépendants qui leur enseignent des compétences en analyse de données et en présentation. Cet article se concentre sur les protocoles d’exposition de C. elegans à des mélanges de pesticides, puis sur l’observation et l’analyse des effets sur la morphologie des neurones.

Les mélanges de pesticides chimiques pour pelouse sont largement utilisés à des fins résidentielles et agricoles et peuvent être achetés dans n’importe quel magasin de jardinage local. On s’inquiète de plus en plus de la sécurité de ces produits chimiques pour les humains et la faune ^1,2,3. Les étudiants peuvent lire la littérature scientifique et choisir un pesticide pour l’évaluation expérimentale et, ce faisant, peuvent en apprendre davantage sur la biologie de base et la neurobiologie, ainsi que sur d’importantes compétences de laboratoire telles que la conception et l’analyse expérimentales, et des compétences générales en laboratoire telles que le pipetage et les dilutions en série, la microscopie disséquante, la microscopie fluorescente, la photographie numérique et la production de figures.

Les protocoles décrits dans cet article peuvent être autonomes dans un cours de niveau intermédiaire en biologie ou en neurosciences ou faire partie d’un module de plusieurs semaines qui pourrait également inclure des mesures de comportements régis par des groupes particuliers de neurones. Par exemple, décrit dans ce protocole est une évaluation de la morphologie des neurones cholinergiques qui régissent la locomotion à l’aide d’une souche de nématode qui exprime la GFP (LX 929) dans les neurones cholinergiques⁴. Ces souches peuvent être obtenues à des prix très bas auprès du Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Les souches exprimant la GFP dans les neurones dopaminergiques (OH 7457), les neurones cholinergiques (LX 929) ou mCherry exprimées dans tous les neurones (PVX4) sont toutes de bons choix. Les élèves ont également pu mesurer la locomotion et obtenir des données pour accompagner l’évaluation de la morphologie. Une description complète d’un projet de groupe d’étudiants de plusieurs semaines peut être trouvée dans Susman⁵.

Ce projet de groupe d’étudiants est assez peu coûteux et facile à mettre en place pour des groupes de quatre étudiants. Les matériaux nécessaires comprennent un microscope à dissection, l’accès à un microscope composé à fluorescence pouvant avoir un appareil photo numérique attaché, des plaques de Petri et l’accès à une gélose de croissance des nématodes, des bactéries à croissance limitée (souche OP50, de la CGC), un brûleur Bunsen à flamme gazeuse ou une lampe à alcool, un autoclave, un fil de platine et des fournitures de laboratoire générales comme des micropipetters, des lames de microscope, couvercles et pipettes Pasteur en verre. Selon le toxique chimique examiné par les groupes d’étudiants, les étapes du protocole peuvent devoir se dérouler sous une hotte ou avec des gants. Ce protocole utilise des mélanges chimiques solubles dans l’eau (non volatils) et toutes les procédures de manipulation sécuritaire recommandées par le fabricant sont suivies.

Protocole

Toute utilisation d’animaux invertébrés était conforme aux directives de l’établissement en matière de soins et d’utilisation des animaux.

1. Préparation de plaques de Petri recouvertes de pesticides

1. Préparez des boîtes de Petri d’agar (6 cm de diamètre fonctionnent le mieux) en utilisant des procédures standard⁶.
   REMARQUE: Ceux-ci peuvent être préparés des mois à l’avance et conservés au réfrigérateur jusqu’à utilisation. Amener les plaques à température ambiante (RT) sur la paillasse. Dans la plupart des cas, les groupes d’étudiants devraient recevoir une plaque pour chaque dilution du mélange de pesticides, y compris un contrôle de l’eau.
2. Préparer 1 mL de chaque dilution du pesticide choisi dans des tubes de microfuge étiquetés de 1,5 mL. Pour une manipulation en toute sécurité, assurez-vous de lire les instructions et de fournir des gants, ou de travailler dans une hotte aspirante, si cela est suggéré.
   NOTE: Dilutions suggérées pour l’essai: 1 mL de pesticide à pleine puissance, dilution de 1:10 dans l’eau (100 μL de pesticide, 900 μL d’eau distillée), dilution de 1:100 (10 μL de pesticide, 990 μL d’eau), dilution de 1:1000 (dilution de 10 μL de la dilution 1:10, 990 μL d’eau), etc.
3. Fabriquez un épandeur de solution en pliant soigneusement une pipette Pasteur en verre (taille de 9 ml) dans une flamme de brûleur Bunsen. Utilisez la flamme pour fermer l’ouverture de la pipette. Ensuite, stérilisez l’épandeur à l’éthanol avant chaque épandage sur la plaque de Pétri.
4. À l’aide d’un micropipetter, placez 100 μL de la dilution (ou du contrôle de l’eau) sur le centre de la gélose et étalez doucement sur la surface avec l’épandeur stérilisé. Stérilisez à nouveau l’épandeur avant chaque utilisation.
5. Mettez de côté les boîtes de Petri couvertes et laissez la solution tremper dans la surface jusqu’à ce qu’elle soit « sèche ».
   REMARQUE: Selon le pesticide et les niveaux d’humidité dans le laboratoire, cela peut prendre un certain temps. Les élèves devront peut-être préparer leurs assiettes la veille de la période d’exposition.
6. Pour les périodes d’exposition supérieures à 12 h, ajouter 50 μL d’une culture nocturne d’Escherichia coli aux plaques avant d’ajouter les nématodes. Pour les expériences aiguës (12 h ou moins), il n’est pas nécessaire d’avoir E. coli sur les plaques.

2. Ajout de nématodes sur des plaques enduites de pesticides

REMARQUE: Les étudiants devront avoir une plaque de nématodes adultes (les cultures de 5 jours sont les meilleures) de la souche fluorescente LX929, qui est disponible auprès du Centre de génétique Caenorhabditis elegans . Il y a deux procédures possibles pour cela. Si les élèves ont déjà travaillé avec des nématodes (par exemple, si cette procédure fait partie d’un exercice de plusieurs semaines et qu’ils ont déjà appris à cueillir des nématodes avec un pic à vers), utilisez l’étape 2.1. Si ce n’est pas le cas, utilisez l’étape 2.2.

1. Cueillez les nématodes avec un pic à vers. Façonnez un pichet de ver à partir d’un morceau de fil de platine de 1 po qui est fondu à une pipette Pasteur à l’aide d’une flamme de brûleur Bunsen. Ramassez une petite tache d’E. coli collante sur le pic, puis ramassez les nématodes adultes à l’aide de la tache collante. Pour une taille d’échantillon décente, choisissez 10 nématodes pour chaque plaque de traitement.
   REMARQUE: Les étudiants sans beaucoup d’expérience peuvent suivre les étapes 2.2-2.3.
2. Utilisez une micropipette pour placer 1 mL d’eau stérile sur la plaque des nématodes. Agitez l’eau pour soulever les nématodes, puis retirez le liquide avec les nématodes dans un tube de microfuge de 1,5 mL.
3. Laissez les nématodes se déposer par gravité pendant environ 10 min, puis retirez soigneusement au moins 500 μL de l’eau et jetez-les. Remettre en suspension les nématodes et, à l’aide d’une pointe de pipette jaune coupée, retirer 50 à 100 μL de vers en suspension dans chaque plaque de traitement. Assurez-vous que chaque assiette contient au moins 10 vers adultes.
4. Réglez une minuterie ou notez l’heure et exposez les nématodes à RT pendant la période choisie. Pendant le temps d’exposition choisi, préparez les lames de microscope pour les supports humides. Les lames doivent être faites le même jour que la microscopie.
   REMARQUE: Les groupes d’étudiants auront choisi leur moment d’exposition lors de la planification de leur étude indépendante.

3. Préparation des lames de microscope pour les supports humides

REMARQUE: Les étapes 3.1 à 3.3 peuvent être effectuées par chaque groupe d’étudiants. Préparez trois diapositives chacune.

1. Préparez deux diapositives en plaçant un morceau de ruban adhésif sur un seul côté de la diapositive (Figure 1, panneau de gauche). Le ruban est utilisé pour créer l’épaisseur correcte pour que l’agarose forme un tampon d’épaisseur uniforme. Placez ensuite une glissière propre et inutilisée entre eux sur la paillasse, comme illustré dans la figure.
2. Utilisez un micropipetter pour placer une goutte de 10 μL d’agarose fondue (3 % en ddH₂O, chauffée à l’aide d’un bloc chauffant à 65 °C) sur le centre de la glissière qui se trouve au milieu.
3. Aplatissez la goutte en plaçant une autre diapositive propre sur le dessus, perpendiculairement à la diapositive avec la goutte, comme illustré dans la figure (Figure 1, panneau de droite). Aplatissez en appliquant une pression, de sorte que la goutte d’agarose forme l’épaisseur du ruban d’étiquetage.
4. L’agarose se solidifiera en environ 1 min. Ensuite, appliquez une pression constante pour séparer les deux glissières. Le cercle de gélose adhérera à l’une des glissières. Posez cette glissière, côté agar vers le haut, sur la paillasse, et laissez-la sécher pendant 1-2 min avant de l’utiliser.

4. Montage de nématodes vivants sur des lames de microscope

1. Pour ajouter des nématodes à la lame préparée avec le tampon d’agarose, ajoutez une goutte d’eau de 5 μL contenant 1 M d’azoture de sodium (NaN₃) au tampon de gélose. Cette solution anesthésie les vers et les immobilise.
   ATTENTION: La solution mère d’azoture de sodium peut causer des maladies si elle est ingérée.
2. Transférez ensuite les nématodes (au moins 10 par lame de traitement) à la gouttelette à l’aide d’un pic à ver. Stérilisez le pic avant et après l’avoir utilisé pour transférer les nématodes.
3. Utilisez des pinces pour ajouter un couvercle en le plaçant à un angle et en l’abaissant lentement. Empêchez le couvercle de glisser ou de s’abaisser trop rapidement à l’aide d’un crayon ou d’une sonde métallique.
4. Placez la monture humide préparée sur un microscope fluorescent pour observer les vers, d’abord sous un grossissement et un contraste de phase de 10x, puis sous un grossissement de 40x avec contraste de phase et éclairage fluorescent.

5. Microscopie fluorescente

REMARQUE: Les groupes d’étudiants doivent fabriquer une monture humide de plusieurs vers de chaque type sur des lames de microscope distinctes, qu’ils doivent étiqueter de manière appropriée. Les instructions qui suivent sont des conseils généraux sur l’utilisation d’un microscope composé de fluorescence standard qui peut avoir une configuration trinoculaire attachée, un appareil photo numérique et un système informatique. La configuration utilisée pour ce manuscrit est illustrée à la figure 2. Les étudiants doivent être familiers avec les paramètres du microscope, y compris les objectifs, les types de filtres de lumière, la capacité de basculer entre le champ lumineux et la lumière de fluorescence, comment envoyer le signal lumineux à l’appareil photo numérique, etc.

1. Placez une monture humide préparée à la fois sur la scène du microscope et fixez-la en place à l’aide des clips de scène du microscope.
2. Commencez à visualiser les supports humides en regardant d’abord avec l’objectif de grossissement le plus bas, qui est généralement de 10x, et utilisez un champ lumineux ou un contraste de phase pour visualiser et se concentrer sur les nématodes.
3. Une fois qu’un nématode est situé dans le champ de vision, concentrez-vous dessus à l’aide du bouton de mise au point fine du microscope. Basculez l’éclairage sur la fluorescence en tournant le cadran. Ensuite, dirigez la lumière vers l’appareil photo pour capturer les images numériques. Ajustez l’éclairage à l’aide du logiciel d’imagerie afin que les neurones soient brillamment éclairés mais pas sursaturés.
4. À un moment donné, obtenez une image séparée d’une règle au même grossissement que les images de cellule pour fournir une échelle de grossissement pour leur figure. Placez une courte section d’une règle transparente, ou une lame micrométrique, sur l’étage du microscope, concentrez-vous dessus à l’aide du bouton de mise au point fine et obtenez une image à l’aide du logiciel d’imagerie.
5. Obtenez des images supplémentaires (d’au moins 10 nématodes distincts) à des grossissements plus élevés, si possible. La lumière intense blanchira probablement la zone à partir de laquelle elle est photographiée, alors surveillez attentivement l’imagerie et ne permettez pas à la lumière de rester sur la même zone de la diapositive pendant de longues périodes de temps. Assurez-vous de nommer les images acquises pour garder une trace du nématode et de la région, ainsi que du traitement et du grossissement.
6. Créez un dossier sur l’ordinateur et déplacez les images dans le dossier pour les utiliser dans l’analyse et la préparation des figures.

6. Échelle d’évaluation de l’intégrité morphologique

REMARQUE: Une caractéristique cytologique clé des dommages neurodégénératifs dans les neurones est un changement de la morphologie du soma. Il existe trois morphologies qui peuvent facilement être visualisées et comptées.

1. Comptez les neurones avec des processus fluorescents lisses et uniformes et des corps cellulaires non ronds comme d’habitude, comme le montre la figure 3.
2. Souvent, le soma devient arrondi et enflé par rapport aux neurones jeunes et en bonne santé. Comptez les neurones qui ressemblent à ceci comme « arrondis ».
3. Les neurones avec de longs processus neuronaux peuvent présenter des saignements, où il y a des ponctuations arrondies ou même des lacunes dans les processus. Comptez les neurones qui présentent ces caractéristiques comme « blebbed ».

7. Analyse des données et préparation des figures

1. Si le pourcentage en bonne santé (pas d’arrondi, pas de blebbing) et le pourcentage altéré (arrondi et/ou blebbing) pour au moins dix nématodes pour chaque traitement ont été comptés (Figure 3), effectuez une analyse statistique à l’aide du logiciel statistique disponible.
2. Comptez tous les neurones qui sont marqués par fluorescence, en gardant un décompte de ceux qui présentent une morphologie normale, une morphologie de blebbing ou une morphologie arrondie, puis calculez le pourcentage de chaque morphologie par rapport au nombre total de chaque nématode analysé.
3. Pour préparer les figures, importez les images dans un logiciel approprié comme Powerpoint, puis ajoutez des étiquettes et une barre d’échelle en fonction de la règle ou de l’image micrométrique acquise.

Résultats

Les méthodes et les protocoles décrits dans cet article fournissent des compétences de laboratoire importantes pour les étudiants de premier cycle de niveau intermédiaire en biologie ou en neurosciences. Les étudiants peuvent acquérir une expérience importante dans le développement d’un projet indépendant et la réalisation d’une expérience de leur propre conception qui pourrait fournir de nouveaux résultats. La figure 3 montre un résultat optimal d’un projet étudiant qui...

Discussion

Les protocoles décrits dans ce manuscrit fonctionnent avec succès seuls ou dans le cadre d’un projet de groupe d’étudiants indépendant de plusieurs semaines. Les protocoles se prêtent également à des expériences exploratoires autonomes d’une semaine. Les souches de nématodes sont bon marché et faciles à entretenir dans le laboratoire de recherche. Les élèves peuvent facilement apprendre à cueillir les vers avec un pic à vers ou à les déplacer en rinçant les plaques avec de l’eau et en leur perme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250