Untersuchung der Wirkung von Pestiziden auf Caenorhabditis elegans Neuronen

Zusammenfassung

Junge erwachsene Caenorhabditis elegans Nematoden sind 2-24 h lang unterschiedlichen Konzentrationen kommerzieller Pestizide oder anderer Giftstoffe ausgesetzt. Dann können verschiedene Neuronen mit fluoreszierenden exprimierenden Stämmen sichtbar gemacht werden. Dieses Papier zeigt, wie man Nematoden Pestiziden aussetzt und Neuronenschäden bewertet.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiger Modellorganismus, der in vielen Forschungslabors verwendet wird, um die Folgen der Exposition gegenüber chemischen Schadstoffen, Pestiziden und einer Vielzahl von toxischen Substanzen zu verstehen. Diese Nematoden sind einfach zu bearbeiten und können verwendet werden, um neue Forschungsergebnisse zu generieren, sogar im Bachelor-Biologielabor. Eine mehrwöchige Laborreihe authentischer, studentischer Forschungsprojekte schult die Studierenden in einem Toolkit von Techniken und Ansätzen in Verhaltensmessungen, Zellbiologie und Mikroskopie, die sie dann auf ihre Projekte anwenden. Eine Technik in diesem Toolkit ist die Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die neurodegenerative Schäden aufweisen, nachdem sie einem chemischen Giftstoff wie einem Pestizid ausgesetzt waren. Junge erwachsene C. elegans-Nematoden können 2-24 h lang unterschiedlichen Konzentrationen kommerziell erhältlicher Pestizide oder anderer Arten von Giftstoffen ausgesetzt sein . Dann können Studenten verschiedene Neuronensubtypen mit fluoreszierenden exprimierenden Stämmen von C. elegans visualisieren. Diese Techniken erfordern keine ausgeklügelte Bildverarbeitungssoftware und sind selbst bei geringen Vergrößerungen wirksam, so dass die Notwendigkeit einer teuren konfokalen Mikroskopie überflüssig wird. Dieses Papier zeigt, wie man die Nematoden mit Pestiziden behandelt und wie man die Neuronen abbildet und bewertet. Es bietet auch ein einfaches Protokoll für die Mikroskopie und Analyse der Neuronenmorphologie. Die für diese Technik verwendeten Materialien sind kostengünstig und in den meisten Biologieabteilungen des Grundstudiums leicht verfügbar. Diese Technik kann mit Verhaltensmaßnahmen wie Fortbewegung, basaler Verlangsamung oder Eiablage kombiniert werden, um eine potenziell veröffentlichungsfähige Reihe von Experimenten durchzuführen und Studenten eine authentische Forschungserfahrung zu sehr niedrigen Kosten zu bieten.

Einleitung

Caenorhabditis elegans ist ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Laborausbildung in biologisch-naturwissenschaftlichen Kursen für Einsteiger und Mittelstufen. Dieses Laborverfahren kann als Teil eines mehrwöchigen Moduls verwendet werden, das verschiedene Auswirkungen häufig verwendeter Pestizide auf das Verhalten von C. elegans und die Zellbiologie untersucht. Die Studierenden können lernen, unabhängige Projekte zu entwerfen und durchzuführen, die ihnen Datenanalyse- und Präsentationsfähigkeiten vermitteln. Dieses Papier konzentriert sich auf die Protokolle zur Exposition von C. elegans gegenüber Pestizidmischungen und dann zur Beobachtung und Analyse der Auswirkungen auf die Neuronenmorphologie.

Rasenchemische Pestizidmischungen werden häufig für den privaten und landwirtschaftlichen Gebrauch verwendet und können in jedem örtlichen Gartengeschäft erworben werden. Es gibt zunehmende Besorgnis über die Sicherheit dieser Chemikalien für Mensch und Tier ^1,2,3. Die Studierenden können die wissenschaftliche Literatur lesen und ein Pestizid für die experimentelle Bewertung auswählen und dabei grundlegende Biologie und Neurobiologie sowie wichtige Laborfähigkeiten wie experimentelles Design und Analyse und allgemeine Laborfähigkeiten wie Pipettieren und serielle Verdünnungen, Seziermikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, digitale Fotografie und Figurenproduktion erlernen.

Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle können in einem Mittelstufenkurs in Biologie oder Neurowissenschaften allein stehen oder Teil eines mehrwöchigen Moduls sein, das auch Messungen von Verhaltensweisen umfassen kann, die von bestimmten Gruppen von Neuronen gesteuert werden. In diesem Protokoll wird beispielsweise eine Beurteilung der Morphologie cholinerger Neuronen beschrieben, die die Fortbewegung unter Verwendung eines Nematodenstamms steuern, der GFP (LX 929) in cholinergen Neuronen⁴ exprimiert. Diese Stämme können zu sehr niedrigen Preisen vom Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/) bezogen werden. Stämme, die GFP in dopaminergen Neuronen (OH 7457), cholinerge Neuronen (LX 929) oder mCherry, die in allen Neuronen exprimiert werden (PVX4), exprimieren, sind alle eine gute Wahl. Die Schüler konnten auch die Fortbewegung messen und Daten erhalten, um die Beurteilung der Morphologie zu begleiten. Eine vollständige Beschreibung eines mehrwöchigen Studentengruppenprojekts finden Sie in Susman⁵.

Dieses Studentengruppenprojekt ist recht kostengünstig und für Gruppen von vier Studenten einfach einzurichten. Zu den benötigten Materialien gehören ein Seziermikroskop, der Zugang zu einem Fluoreszenzverbindungsmikroskop, das eine angeschlossene Digitalkamera haben kann, Petriplatten und Zugang zu Nematodenwachstumsagar, wachstumsbegrenzte Bakterien (Stamm OP50, aus dem CGC), ein Gasflammen-Bunsenbrenner oder eine Alkohollampe, ein Autoklav, Platindraht und allgemeines Labormaterial wie Mikropipetter, Objektträger, Deckgläser und Pasteur-Pipetten aus Glas. Abhängig von dem chemischen Giftstoff, der von den Studentengruppen untersucht wird, müssen die Schritte im Protokoll möglicherweise unter einem Abzug oder mit Handschuhen erfolgen. Dieses Protokoll verwendet chemische Gemische, die wasserlöslich (nicht flüchtig) sind, und alle vom Hersteller empfohlenen sicheren Handhabungsverfahren werden befolgt.

Protokoll

Die gesamte Verwendung von wirbellosen Tieren erfolgte in Übereinstimmung mit den Tierpflege- und Verwendungsrichtlinien der Einrichtung.

1. Herstellung von pestizidbeschichteten Petriplatten

1. Bereiten Sie Agar-Petrischalen (6 cm Durchmesser funktionieren am besten) mit Standardverfahren⁶ zu.
   HINWEIS: Diese können Monate im Voraus hergestellt und bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt werden. Bringen Sie die Platten auf Raumtemperatur (RT) auf dem Tisch. In den meisten Fällen sollten die Studentengruppen für jede Verdünnung der Pestizidmischung mit einer Platte versehen werden, einschließlich einer Wasserkontrolle.
2. Bereiten Sie 1 ml jeder Verdünnung des gewählten Pestizids in markierten 1,5 ml Mikrofugenröhrchen vor. Für eine sichere Handhabung lesen Sie unbedingt die Anweisungen und stellen Sie Handschuhe zur Verfügung oder arbeiten Sie in einem Abzug, falls vorgeschlagen.
   HINWEIS: Empfohlene Verdünnungen zum Testen: 1 ml Pestizid in voller Stärke, 1:10 Verdünnung in Wasser (100 μL Pestizid, 900 μL destilliertes Wasser), 1:100 Verdünnung (10 μL Pestizid, 990 μL Wasser), 1:1000 Verdünnung (10 μL der 1:10 Verdünnung, 990 μL Wasser) usw.
3. Machen Sie einen Lösungstreuer, indem Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas (9 ml) vorsichtig in einer Bunsenbrennerflamme biegen. Verwenden Sie die Flamme, um die Öffnung der Pipette zu schließen. Dann sterilisieren Sie den Streuer vor jeder Ausbreitung auf der Petriplatte mit Ethanol.
4. Mit einem Mikropipetter 100 μL der Verdünnung (oder Wasserkontrolle) auf die Mitte des Agars legen und mit dem sterilisierten Streuer vorsichtig über die Oberfläche verteilen. Sterilisieren Sie den Streuer vor jedem Gebrauch erneut.
5. Legen Sie die abgedeckten Petrischalen beiseite und lassen Sie die Lösung in die Oberfläche einweichen, bis sie "trocken" ist.
   HINWEIS: Abhängig von den Pestizid- und Feuchtigkeitswerten im Labor kann dies einige Zeit dauern. Die Schüler müssen ihre Teller möglicherweise am Tag vor der Expositionszeit vorbereiten.
6. Bei Expositionszeiträumen von mehr als 12 h sind 50 μL einer Nachtkultur von Escherichia coli auf die Platten zu geben, bevor die Nematoden zugegeben werden. Für akute Experimente (12 h oder weniger) ist es nicht erforderlich, E. coli auf den Platten zu haben.

2. Hinzufügen von Nematoden zu pestizidbeschichteten Platten

HINWEIS: Die Schüler benötigen eine Platte mit erwachsenen Nematoden (5-Tage-Kulturen sind am besten) des fluoreszierenden Stammes LX929, der im Caenorhabditis elegans Genetics Center erhältlich ist. Dafür gibt es zwei mögliche Verfahren. Wenn die Schüler bereits Erfahrung mit Nematoden haben (z. B. wenn dieses Verfahren Teil einer mehrwöchigen Übung ist und sie bereits gelernt haben, Nematoden mit einer Wurmpickung zu pflücken), verwenden Sie Schritt 2.1. Wenn dies nicht der Fall ist, führen Sie Schritt 2.2 aus.

1. Pflücken Sie Nematoden mit einem Wurmpick. Gestalten Sie eine Wurmpflücke aus einem 1-Zoll-Stück Platindraht, der mit einer Bunsenbrennerflamme zu einer Pasteur-Pipette geschmolzen wird. Nehmen Sie einen kleinen Klecks klebriger E. coli auf den Pick und nehmen Sie dann erwachsene Nematoden mit dem klebrigen Klecks auf. Für eine anständige Probengröße wählen Sie 10 Nematoden für jede Behandlungsplatte.
   HINWEIS: Schüler ohne viel Erfahrung können die Schritte 2.2-2.3 ausführen.
2. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 1 ml steriles Wasser auf die Platte der Nematoden zu geben. Schwenken Sie das Wasser herum, um die Nematoden anzuheben, und entfernen Sie dann die Flüssigkeit mit den Nematoden zu einem 1,5 ml Mikrofugenröhrchen.
3. Lassen Sie die Nematoden durch Schwerkraft für etwa 10 min absetzen, dann entfernen Sie vorsichtig mindestens 500 μL des Wassers und entsorgen Sie. Suspendieren Sie die Nematoden und entfernen Sie mit einer abgeschnittenen gelben Pipettenspitze 50-100 μL Schwebwürmer auf jede Behandlungsplatte. Stellen Sie sicher, dass jede Platte mindestens 10 erwachsene Würmer hat.
4. Stellen Sie einen Timer ein oder notieren Sie sich die Uhrzeit und machen Sie die Nematoden bei RT für den ausgewählten Zeitraum verfügbar. Bereiten Sie während der gewählten Belichtungszeit Objektträger für nasse Halterungen vor. Die Objektträger sollten am selben Tag wie die Mikroskopie gemacht werden.
   HINWEIS: Studentengruppen haben ihre Expositionszeit während der Planung für ihr unabhängiges Studium gewählt.

3. Vorbereitung von Objektträgern für nasse Halterungen

HINWEIS: Die Schritte 3.1-3.3 können von jeder Schülergruppe ausgeführt werden. Bereiten Sie jeweils drei Folien vor.

1. Bereiten Sie zwei Folien vor, indem Sie ein Stück Etikettenband nur auf einer Seite der Folie anbringen (Abbildung 1, linker Bereich). Das Band wird verwendet, um die richtige Dicke für die Agarose zu erzeugen, um ein Pad von gleichmäßiger Dicke zu bilden. Positionieren Sie dann eine saubere, unbenutzte Folie zwischen ihnen auf der Tischplatte, wie in der Abbildung dargestellt.
2. Verwenden Sie einen Mikropipetter, um einen 10 μL Tropfen geschmolzener Agarose (3% in ddH₂O, erhitzt mit einer 65 °C Trockenblockheizung) auf die Mitte des Objektträgers in der Mitte zu legen, der sich in der Mitte befindet.
3. Glätten Sie den Tropfen, indem Sie eine weitere saubere Folie senkrecht zu der Folie mit dem Tropfen oben platzieren, wie in der Abbildung dargestellt (Abbildung 1, rechtes Feld). Durch Druck abflachen, so dass der Agarosetropfen die Dicke des Beschriftungsbandes bildet.
4. Die Agarose verfestigt sich innerhalb von ca. 1 min. Üben Sie dann gleichmäßigen Druck aus, um die beiden Folien zu trennen. Der Agarkreis haftet an einer der Folien. Legen Sie diese Folie mit der Agarseite nach oben auf die Tischplatte und lassen Sie sie vor dem Gebrauch 1-2 Minuten trocknen.

4. Lebende Nematoden auf Objektträgern montieren

1. Um dem vorbereiteten Objektträger mit dem Agarosepad Nematoden hinzuzufügen, fügen Sie dem Agarpad einen 5-μL-Tropfen Wasser mit 1 M Natriumazid (_NaN3) hinzu. Diese Lösung betäubt die Würmer und immobilisiert sie.
   VORSICHT: Natriumazid-Stammlösung kann bei Einnahme Krankheiten verursachen.
2. Übertragen Sie dann Nematoden (mindestens 10 pro Behandlungsobjektträger) mit einem Wurmpickel auf das Tröpfchen. Sterilisieren Sie den Pick vor und nach der Verwendung zum Transfer von Nematoden.
3. Verwenden Sie eine Pinzette, um ein Deckglas hinzuzufügen, indem Sie es in einem Winkel platzieren und langsam absenken. Verhindern Sie, dass der Deckglas zu schnell verrutscht oder absenkt, indem Sie einen Bleistift oder eine Metallsonde verwenden.
4. Legen Sie die vorbereitete Nasshalterung auf ein fluoreszierendes Mikroskop, um die Würmer zu beobachten, zuerst unter 10-facher Vergrößerung und Phasenkontrast, dann unter 40-facher Vergrößerung mit Phasenkontrast und fluoreszierender Beleuchtung.

5. Fluoreszenzmikroskopie

HINWEIS: Studentengruppen sollten eine nasse Halterung von mehreren Würmern jedes Typs auf separaten Objektträgern machen, die sie entsprechend beschriften sollten. Die folgenden Anweisungen sind allgemeine Tipps zur Verwendung eines Standard-Fluoreszenz-Verbindungsmikroskops, das über ein angeschlossenes Trinokular-Setup, eine Digitalkamera und ein Computersystem verfügen kann. Der für dieses Manuskript verwendete Aufbau ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Schüler sollten mit den Einstellungen des Mikroskops vertraut sein, einschließlich der Objektive, der Arten von Lichtfiltern, der Fähigkeit, zwischen hellem Feld und Fluoreszenzlicht zu wechseln, wie das Lichtsignal an die Digitalkamera gesendet wird usw.

1. Platzieren Sie jeweils eine vorbereitete Nasshalterung auf dem Mikroskoptisch und befestigen Sie sie mit den Mikroskop-Tischclips.
2. Beginnen Sie mit der Betrachtung der nassen Montierungen, indem Sie zuerst mit dem niedrigsten Vergrößerungsobjektiv betrachten, das normalerweise 10x ist, und verwenden Sie hellen Feld- oder Phasenkontrast, um die Nematoden zu visualisieren und zu fokussieren.
3. Sobald sich ein Nematode im Sichtfeld befindet, fokussieren Sie ihn mit dem feinen Fokusknopf am Mikroskop. Schalten Sie die Beleuchtung auf die Fluoreszenz, indem Sie das Zifferblatt drehen. Richten Sie dann das Licht auf die Kamera, um die digitalen Bilder aufzunehmen. Stellen Sie die Beleuchtung mit der Bildgebungssoftware so ein, dass die Neuronen hell beleuchtet, aber nicht übersättigt sind.
4. Erhalten Sie irgendwann ein separates Bild eines Lineals mit der gleichen Vergrößerung wie die Zellbilder, um eine Vergrößerungsskala für ihre Figur bereitzustellen. Legen Sie einen kurzen Ausschnitt eines transparenten Lineals oder eines Mikrometer-Objektträgers auf den Mikroskoptisch, fokussieren Sie ihn mit dem feinen Fokusknopf und erhalten Sie mit der Bildgebungssoftware ein Bild.
5. Erhalten Sie zusätzliche Bilder (von mindestens 10 separaten Nematoden) bei höheren Vergrößerungen, wenn möglich. Das intensive Licht wird wahrscheinlich den Bereich bleichen, von dem aus es abgebildet wird, also überwachen Sie die Bildgebung sorgfältig und lassen Sie das Licht nicht für längere Zeit auf dem gleichen Bereich des Objektträgers verbleiben. Achten Sie darauf, die aufgenommenen Bilder zu benennen, um den Fadenwurm und die Region sowie die Behandlung und Vergrößerung im Auge zu behalten.
6. Erstellen Sie einen Ordner auf dem Computer und verschieben Sie die Bilder in den Ordner, um sie in der Analyse und Figurenvorbereitung zu verwenden.

6. Bewertungsskala für morphologische Integrität

HINWEIS: Ein wichtiges zytlogisches Merkmal neurodegenerativer Schäden in Neuronen ist eine Veränderung der Somamorphologie. Es gibt drei Morphologien, die leicht betrachtet und gezählt werden können.

1. Zählen Sie die Neuronen mit glatten, gleichmäßig fluoreszierenden Prozessen und nicht runden Zellkörpern wie gewohnt, wie in Abbildung 3 gezeigt.
2. Oft wird das Soma im Vergleich zu gesunden, jungen Neuronen abgerundet und geschwollen. Zählen Sie die Neuronen, die so aussehen, als "gerundet".
3. Neuronen mit langen neuronalen Prozessen können Blubbern zeigen, wo es abgerundete Puncta oder sogar Lücken in den Prozessen gibt. Zählen Sie die Neuronen, die diese Merkmale als "geblasen" anzeigen.

7. Datenanalyse und Figurenaufbereitung

1. Wenn der Prozentsatz gesund (keine Rundung, kein Blebbing) und der Prozentsatz der Beeinträchtigten (Rundung und/oder Blebing) für mindestens zehn Nematoden für jede Behandlung gezählt wurden (Abbildung 3), führen Sie eine statistische Analyse mit verfügbarer statistischer Software durch.
2. Zählen Sie alle Neuronen, die fluoreszierend markiert sind, führen Sie eine Zählung derjenigen, die eine normale Morphologie, eine blebbende Morphologie oder eine Rundungsmorphologie aufweisen, und berechnen Sie dann den Prozentsatz jeder Morphologie aus der Gesamtzahl für jeden analysierten Nematoden.
3. Um Zahlen vorzubereiten, importieren Sie die Bilder in eine geeignete Software wie Powerpoint und fügen Sie dann Beschriftungen und eine Maßstabsleiste basierend auf dem aufgenommenen Lineal oder Mikrometerbild hinzu.

Ergebnisse

Die in diesem Papier beschriebenen Methoden und Protokolle bieten wichtige Laborfähigkeiten für Studenten der Mittelstufe in Biologie oder Neurowissenschaften. Die Studierenden können wichtige Erfahrungen bei der Entwicklung eines unabhängigen Projekts und der Durchführung eines Experiments ihres eigenen Designs sammeln, das zu neuartigen Ergebnissen führen könnte. Abbildung 3 zeigt ein optimales Ergebnis eines Studentenprojekts, das schließlich Teil einer veröffentlichten Arbeit

Diskussion

Die in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle arbeiten erfolgreich allein oder im Rahmen eines mehrwöchigen unabhängigen Studentengruppenprojekts. Die Protokolle sind auch für eigenständige, einwöchige Erkundungserfahrungen zugänglich. Die Nematodenstämme sind günstig und im Forschungslabor pflegeleicht. Die Schüler können leicht lernen, wie man Würmer mit einem Wurmpick pflückt oder wie man sie bewegt, indem man Platten mit Wasser spült und ihnen erlaubt, sich durch Schwerkraft abzusetzen. Die Experimen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250