Caenorhabditis elegans Neurons에 대한 살충제의 영향 조사

요약

젊은 성인 Caenorhabditis elegans 선충류는 2-24 시간 동안 상업적 살충제 또는 기타 독성 물질의 농도에 노출됩니다. 이어서, 상이한 뉴런은 형광-발현 균주를 사용하여 가시화될 수 있다. 이 논문은 선충류를 살충제에 노출시키고 뉴런 손상을 평가하는 방법을 보여줍니다.

초록

Caenorhabditis elegans 는 화학 오염 물질, 살충제 및 다양한 독성 물질에 대한 노출의 결과를 이해하기 위해 많은 연구 실험실에서 사용되는 강력한 모델 유기체입니다. 이 선충류는 작업하기 쉽고 학부 생물학 실험실에서도 새로운 연구 결과를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 정통적이고 학생 중심의 연구 프로젝트로 구성된 여러 주간의 실험실 시리즈는 행동 측정, 세포 생물학 및 현미경 검사에 대한 기술 및 접근 방식의 툴킷을 학생들에게 교육하여 프로젝트에 적용합니다. 그 툴킷의 한 가지 기술은 살충제와 같은 화학 독성 물질에 노출 된 후 신경 퇴행성 손상을 나타내는 뉴런의 비율을 정량화하는 것입니다. 젊은 성인 C. elegans 선충류는 2-24 시간 동안 상업적으로 이용 가능한 살충제 또는 다른 유형의 독성 물질의 다른 농도에 노출 될 수 있습니다. 그런 다음 학부생은 C. elegans의 형광 발현 균주를 사용하여 다양한 뉴런 아형을 시각화 할 수 있습니다. 이러한 기술은 정교한 이미지 처리 소프트웨어가 필요하지 않으며 낮은 배율에서도 효과적이므로 값 비싼 공초점 현미경이 필요하지 않습니다. 이 논문은 선충류를 살충제로 치료하는 방법과 뉴런을 이미지화하고 점수를 매기는 방법을 보여줍니다. 또한 뉴런 형태학의 현미경 검사 및 분석을위한 간단한 프로토콜을 제공합니다. 이 기술에 사용 된 자료는 저렴하고 대부분의 학부 생물학 부서에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 기술은 운동, 기저 감속 또는 알을 낳는 것과 같은 행동 측정과 결합하여 잠재적으로 출판 가능한 일련의 실험을 수행하고 학부생에게 매우 저렴한 비용으로 진정한 연구 경험을 제공 할 수 있습니다.

서문

Caenorhabditis elegans 는 입문 및 중급 학생을위한 생물 과학 과정의 실험실 과정 교육을위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 이 실험실 절차는 C. elegans 행동 및 세포 생물학에 일반적으로 사용되는 살충제의 다양한 효과를 탐구하는 여러 주 모듈의 일부로 사용할 수 있습니다. 학생들은 데이터 분석 및 프리젠 테이션 기술을 가르치는 독립적 인 프로젝트를 설계하고 수행하는 방법을 배울 수 있습니다. 이 논문은 C. elegans 를 살충제 혼합물에 노출 시킨 다음 뉴런 형태학에 미치는 영향을 관찰하고 분석하는 프로토콜에 중점을 둡니다.

잔디 화학 살충제 혼합물은 주거 및 농업 용도로 널리 사용되며 모든 지역 정원 상점에서 구입할 수 있습니다. 인간과 야생 동물에 대한 이러한 화학 물질의 안전성에 대한 우려가 증가하고 있습니다 ^1,2,3. 학생들은 과학 문헌을 읽고 실험 평가를위한 살충제를 선택할 수 있으며, 그렇게함으로써 기본 생물학 및 신경 생물학뿐만 아니라 실험 설계 및 분석과 같은 중요한 실험실 기술, 피펫팅 및 직렬 희석, 해부 현미경, 형광 현미경, 디지털 사진 및 그림 생산과 같은 일반적인 실험실 기술에 대해 배울 수 있습니다.

이 논문에 설명 된 프로토콜은 생물학 또는 신경 과학의 중간 수준 과정에서 단독으로 서있을 수 있거나 특정 뉴런 그룹에 의해 관리되는 행동의 측정을 포함 할 수있는 여러 주 모듈의 일부가 될 수 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜에 기재된 것은 콜린성 뉴런⁴에서 GFP(LX 929)를 발현하는 선충류의 균주를 사용하여 운동운동을 지배하는 콜린성 뉴런의 형태학의 평가이다. 이들 균주 는 Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/)로부터 매우 저렴한 가격으로 얻을 수 있다. 도파민성 뉴런(OH 7457), 콜린성 뉴런(LX 929) 또는 모든 뉴런(PVX4)에서 발현되는 mCherry에서 GFP를 발현하는 균주는 모두 좋은 선택이다. 학생들은 또한 움직임을 측정하고 형태학 평가에 수반되는 데이터를 얻을 수 있습니다. 여러 주간의 학생 그룹 프로젝트에 대한 자세한 설명은 Susman⁵에서 찾을 수 있습니다.

이 학생 그룹 프로젝트는 매우 저렴하고 네 명의 학생 그룹을 위해 쉽게 설정할 수 있습니다. 필요한 재료에는 해부 현미경, 부착 된 디지털 카메라를 가질 수있는 형광 화합물 현미경에 대한 액세스, 페트리 플레이트 및 선충류 성장 한천에 대한 액세스, 성장 제한 박테리아 (CGC의 균주 OP50), 가스 화염 분젠 버너 또는 알코올 램프, 오토클레이브, 백금 와이어 및 마이크로 피펫터, 현미경 슬라이드와 같은 일반 실험실 용품, 커버 슬립과 유리 파스퇴르 피펫. 학생 그룹에 의해 검사되는 화학 독성 물질에 따라, 프로토콜의 단계는 흄 후드 또는 장갑으로 발생해야 할 수도 있습니다. 이 프로토콜은 수용성 (휘발성이 아님) 화학 혼합물을 사용하며 제조업체가 권장하는 모든 안전 처리 절차를 따릅니다.

프로토콜

무척추 동물의 모든 사용은 기관의 동물 관리 및 사용 지침을 준수했습니다.

1. 살충제 코팅 페트리 플레이트의 제조

1. 표준 절차⁶을 사용하여 한천 페트리 접시 (직경 6cm 가장 잘 작동)를 준비하십시오.
   참고 : 몇 달 전에 미리 만들 수 있으며 사용할 때까지 냉장고에 보관할 수 있습니다. 플레이트를 벤치 탑의 실온 (RT)으로 가져 오십시오. 대부분의 경우, 학생 그룹에는 물 방제를 포함하여 살충제 혼합물의 각 희석을위한 플레이트가 제공되어야합니다.
2. 라벨이 붙은 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에서 선택된 살충제의 각 희석액 1 mL를 준비한다. 안전한 취급을 위해서는 지침을 읽고 장갑을 착용하거나 권장 사항이있는 경우 흄 후드에서 작업하십시오.
   참고: 시험할 권장 희석액: 전강도 살충제 1mL, 물에 1:10 희석(살충제 100μL, 증류수 900μL), 1:100 희석(살충제 10μL, 물 990μL), 1:1000 희석(1:10 희석액 10μL, 물 990μL) 등
3. Bunsen 버너 불꽃에 유리 파스퇴르 피펫 (9ml 크기)을 조심스럽게 구부려 용액 스프레더를 만드십시오. 화염을 사용하여 피펫의 개구부를 닫습니다. 그런 다음 에탄올-스프레더를 페트리 플레이트 상에 각각 퍼지기 전에 멸균한다.
4. 마이크로피펫터를 사용하여, 희석액 100 μL(또는 물 조절기)를 한천의 중앙에 놓고 멸균된 스프레더로 표면을 가로질러 부드럽게 퍼뜨린다. 각 사용 전에 스프레더를 다시 살균하십시오.
5. 덮인 페트리 접시를 제쳐두고 용액이 "건조"될 때까지 표면에 담그십시오.
   참고 : 실험실의 살충제 및 습도 수준에 따라 다소 시간이 걸릴 수 있습니다. 학생들은 노출 기간 전날 접시를 준비해야 할 수도 있습니다.
6. 12 시간보다 긴 노출 기간 동안, 선충류를 첨가하기 전에 Escherichia 콜라이의 하룻밤 배양물 50 μL를 플레이트에 첨가하십시오. 급성 실험 (12 시간 이하)의 경우 플레이트에 대장균 을 가질 필요가 없습니다.

2. 살충제 코팅 판에 선충류 추가

참고 : 학생들은 Caenorhabditis elegans Genetics Center에서 구할 수있는 형광 균주 LX929의 성인 선충류 (5 일 배양이 가장 좋습니다)가 있어야합니다. 이를 위한 두 가지 가능한 절차가 있습니다. 학생들이 선충류로 일한 경험이 있다면 (예를 들어,이 절차가 여러 주간의 운동의 일부이고 웜 픽으로 선충류를 선택하는 방법을 이미 배운 경우) 2.1 단계를 사용하십시오. 그렇지 않은 경우 2.2단계를 사용합니다.

1. 웜 픽으로 선충류를 선택하십시오. Bunsen 버너 불꽃을 사용하여 파스퇴르 피펫에 녹은 백금 와이어 1 조각에서 웜 픽을 패션하십시오. 끈적 끈적한 대장균 의 작은 얼룩을 집어 들고 끈적 끈적한 얼룩을 사용하여 성인 선충류를 집어 들으십시오. 알맞은 샘플 크기를 얻으려면 각 치료 플레이트에 대해 10 개의 선충류를 선택하십시오.
   참고 : 많은 경험이없는 학생들은 2.2-2.3 단계를 수행 할 수 있습니다.
2. 마이크로 피펫을 사용하여 1 mL의 멸균수를 선충류 접시에 넣으십시오. 선충류를 들어 올리기 위해 물을 뿌린 다음 선충류가있는 액체를 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브로 제거하십시오.
3. 선충류가 중력에 의해 약 10 분 동안 침전되도록한 다음 적어도 500 μL의 물을 조심스럽게 제거하고 버리십시오. 선충류를 재현탁시키고, 잘린 황색 피펫 팁을 사용하여, 각 처리 플레이트에 50-100 μL의 부유 웜을 제거한다. 각 접시에 적어도 10 마리의 성인 웜이 있는지 확인하십시오.
4. 타이머를 설정하거나 시간을 기록하고 선택한 기간 동안 RT에서 선충류를 노출시킵니다. 선택한 노출 시간 동안 젖은 마운트용 현미경 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드는 현미경 검사와 같은 날에 만들어야합니다.
   참고 : 학생 그룹은 독립적 인 연구를 계획하는 동안 노출 시간을 선택했습니다.

3. 젖은 마운트를위한 현미경 슬라이드 준비

참고: 3.1-3.3단계는 각 학생 그룹에서 수행할 수 있습니다. 각각 세 개의 슬라이드를 준비합니다.

1. 슬라이드의 한쪽에만 레이블 테이프 조각을 배치하여 두 개의 슬라이드를 준비합니다(그림 1, 왼쪽 패널). 테이프는 균일 한 두께의 패드를 형성하기 위해 아가로스에 대한 올바른 두께를 만드는 데 사용됩니다. 그런 다음 그림과 같이 깨끗하고 사용하지 않은 슬라이드를 벤치 탑의 사이에 놓습니다.
2. 마이크로피펫터를 사용하여 용융된 아가로오스 10 μL 방울 (_ddH2O중 3%, 65°C 드라이 블록 히터를 사용하여 가열)을 중간에 있는 슬라이드의 중심 상에 놓는다.
3. 그림과 같이 드롭이 있는 슬라이드에 수직인 다른 깨끗한 슬라이드를 위쪽에 배치하여 드롭을 평평하게 만듭니다(그림 1, 오른쪽 패널). 압력을 가하여 평평하게하면 아가로스 방울이 라벨링 테이프의 두께를 형성합니다.
4. 아가로스는 약 1 분 이내에 응고됩니다. 그런 다음 일정한 압력을 가하여 두 슬라이드를 분리합니다. 한천 원은 슬라이드 중 하나에 부착됩니다. 이 슬라이드를 벤치 탑에서 한천 옆으로 올려 놓고 사용하기 전에 1-2 분 동안 말리십시오.

4. 현미경 슬라이드에 살아있는 선충류 장착

1. 아가로스 패드로 제조된 슬라이드에 선충류를 첨가하려면, 1 M 소듐 아지드(_NaN3)를 함유하는 5 μL 방울의 물을 한천 패드에 첨가한다. 이 용액은 웜을 마취시키고 고정시킵니다.
   주의: 나트륨 아지드 원액은 섭취하면 질병을 일으킬 수 있습니다.
2. 그런 다음 웜 픽을 사용하여 선충류 (치료 슬라이드 당 최소 10 개)를 물방울로 옮깁니다. 선충류를 옮기기 위해 사용하기 전후에 픽을 살균하십시오.
3. 포셉을 사용하여 커버슬립을 비스듬히 놓고 천천히 낮추어 커버슬립을 추가합니다. 연필이나 금속 프로브를 사용하여 커버슬립이 너무 빨리 미끄러지거나 낮아지지 않도록 합니다.
4. 준비된 습식 마운트를 형광 현미경 상에 놓고 웜을 관찰하기 위해 먼저 10x 배율 및 위상 대비 하에서, 그 다음 위상 대비 및 형광 조명으로 40x 배율 하에서 웜을 관찰하십시오.

5. 형광 현미경 검사

참고 : 학생 그룹은 별도의 현미경 슬라이드에 각 유형의 여러 웜을 습식 마운트해야하며, 적절하게 라벨을 붙여야합니다. 다음 지침은 부착 된 삼각 조준체 설정, 디지털 카메라 및 컴퓨터 시스템을 가질 수있는 표준 형광 화합물 현미경의 사용에 대한 일반적인 팁입니다. 이 원고에 사용된 설정은 그림 2에서 볼 수 있습니다. 학생들은 목표, 조명 필터 유형, 밝은 필드와 형광 빛 사이를 전환 할 수있는 능력, 디지털 카메라로 빛 신호를 보내는 방법 등을 포함한 현미경 설정에 대해 잘 알고 있어야합니다.

1. 준비된 습식 마운트를 현미경 스테이지에 한 번에 하나씩 놓고 현미경 스테이지 클립을 사용하여 제자리에 고정시킵니다.
2. 젖은 마운트를 먼저 가장 낮은 배율 목표(일반적으로 10x)로 보고 밝은 필드 또는 위상 대비를 사용하여 선충류를 시각화하고 초점을 맞춥니다.
3. 선충류가 시야에 위치하면 현미경의 미세 초점 노브를 사용하여 선충류에 집중하십시오. 다이얼을 돌려 조명을 형광으로 전환합니다. 그런 다음 조명을 카메라로 보내 디지털 이미지를 캡처합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 조명을 조정하여 뉴런이 밝게 비추지만 과포화되지 않도록하십시오.
4. 어떤 시점에서, 세포 이미지와 동일한 배율로 통치자의 별개의 이미지를 획득하여 그들의 형상에 대한 배율 스케일을 제공한다. 투명 눈금자 또는 마이크로미터 슬라이드의 짧은 부분을 현미경 스테이지에 놓고 미세 초점 노브를 사용하여 초점을 맞추고 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 얻습니다.
5. 가능한 경우 더 높은 배율로 (적어도 10 개의 분리 된 선충류로부터) 추가 이미지를 얻으십시오. 강렬한 빛은 이미지가 찍히는 영역을 표백할 가능성이 높으므로 이미징을 주의 깊게 모니터링하고 빛이 슬라이드의 동일한 영역에 장시간 남아 있지 않도록 합니다. 선충류와 부위뿐만 아니라 치료 및 확대를 추적하기 위해 획득 한 이미지의 이름을 지정해야합니다.
6. 컴퓨터에 폴더를 만들고 이미지를 폴더로 이동하여 분석 및 그림 준비에 사용하십시오.

6. 형태학적 무결성 평가 척도

참고 : 뉴런의 신경 퇴행성 손상의 주요 세포 학적 특징은 소마 형태학의 변화입니다. 쉽게 보고 계산할 수 있는 세 가지 형태가 있습니다.

1. 그림 3과 같이 매끄럽고 균일하게 형광 과정과 둥글지 않은 세포체로 뉴런을 정상적으로 계산하십시오.
2. 종종 소마는 건강하고 젊은 뉴런에 비해 둥글고 부어 오른듯 보입니다. 이렇게 보이는 뉴런을 "둥글게"계산하십시오.
3. 긴 신경 과정을 가진 뉴런은 둥근 누점 또는 심지어 과정에 틈이있는 곳에서 출혈을 나타낼 수 있습니다. 이러한 특징을 보여주는 뉴런을 "블 링"으로 계산하십시오.

7. 데이터 분석 및 그림 준비

1. 각 치료에 대해 적어도 열 개의 선충류에 대한 건강한 백분율(반올림 없음, 출혈 없음)과 손상된 비율(반올림 및/또는 출혈)이 계수된 경우(그림 3), 사용 가능한 통계 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
2. 형광 태그가 지정된 모든 뉴런을 세고, 정상 형태학, 블빙 형태학 또는 반올림 형태를 나타내는 뉴런의 집계를 유지한 다음, 분석된 각 선충류에 대한 총 개수 중에서 각 형태학의 백분율을 계산합니다.
3. 그림을 준비하려면 Powerpoint와 같은 적절한 소프트웨어로 이미지를 가져온 다음 획득한 눈금자 또는 마이크로미터 이미지를 기반으로 레이블과 배율 표시줄을 추가합니다.

결과

이 논문에 설명 된 방법과 프로토콜은 생물학 또는 신경 과학 분야의 중급 학부생에게 중요한 실험실 기술을 제공합니다. 학생들은 독립적 인 프로젝트를 개발하고 새로운 결과를 제공 할 수있는 자신의 디자인 실험을 수행하는 데 중요한 경험을 쌓을 수 있습니다. 그림 3은 결국 출판된 논문³의 일부가 된 학생 프로젝트의 최적 결과를 보여줍니다. 대부분?...

토론

이 원고에 설명 된 프로토콜은 단독으로 또는 여러 주간의 독립적 인 학생 그룹 프로젝트의 일환으로 성공적으로 작동합니다. 이 프로토콜은 또한 독립형, 일주일 간의 탐험 경험에 적용 할 수 있습니다. 선충류 균주는 저렴하고 연구 실험실에서 유지하기가 쉽습니다. 학생들은 웜 픽으로 웜을 선택하는 방법이나 물로 판을 플러시하고 중력에 의해 정착 할 수있게하여 웜을 움직이는 방법을 쉽게 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250