Pestisitlerin Caenorhabditis elegans Nöronları Üzerindeki Etkisinin İncelenmesi

Özet

Genç yetişkin Caenorhabditis elegans nematodları, 2-24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda ticari pestisitlere veya diğer toksik maddelere maruz kalır. Daha sonra, floresan eksprese eden suşlar kullanılarak farklı nöronlar görselleştirilebilir. Bu makale, nematodların pestisitlere nasıl maruz bırakılacağını ve nöron hasarının nasıl değerlendirileceğini göstermektedir.

Özet

Caenorhabditis elegans , kimyasal kirleticilere, böcek ilaçlarına ve çok çeşitli toksik maddelere maruz kalmanın sonuçlarını anlamak için birçok araştırma laboratuvarında kullanılan güçlü bir model organizmadır. Bu nematodlarla çalışmak kolaydır ve lisans biyoloji laboratuvarında bile yeni araştırma bulguları üretmek için kullanılabilir. Çok haftalık bir laboratuvar otantik, öğrenci odaklı araştırma projeleri serisi, öğrencileri davranışsal ölçümler, hücre biyolojisi ve mikroskopide daha sonra projelerine uygulayacakları bir teknik ve yaklaşım araç setinde eğitir. Bu araç setindeki bir teknik, pestisit gibi kimyasal bir toksik maddeye maruz kaldıktan sonra nörodejeneratif hasar gösteren nöronların yüzdesini ölçmektir. Genç yetişkin C. elegans nematodları, 2-24 saat boyunca ticari olarak temin edilebilen pestisitlerin veya diğer toksik maddelerin farklı konsantrasyonlarına maruz kalabilir. Daha sonra, lisans öğrencileri C. elegans'ın floresan eksprese eden suşlarını kullanarak farklı nöron alt tiplerini görselleştirebilirler. Bu teknikler sofistike görüntü işleme yazılımı gerektirmez ve düşük büyütmelerde bile etkilidir, bu da pahalı konfokal mikroskopiye olan ihtiyacı gereksiz kılar. Bu makale, nematodların pestisitlerle nasıl tedavi edileceğini ve nöronların nasıl görüntüleneceğini ve puanlanacağını göstermektedir. Ayrıca mikroskopi ve nöron morfolojisinin analizi için basit bir protokol sağlar. Bu teknik için kullanılan malzemeler ucuzdur ve çoğu lisans biyoloji bölümünde kolayca bulunabilir. Bu teknik, potansiyel olarak yayınlanabilir bir dizi deney yapmak ve lisans öğrencilerine çok düşük bir maliyetle otantik bir araştırma deneyimi sunmak için hareket, bazal yavaşlama veya yumurtlama gibi davranışsal önlemlerle birleştirilebilir.

Giriş

Caenorhabditis elegans , giriş ve orta düzey öğrenciler için biyolojik bilim derslerinde laboratuvar dersi eğitimi için mükemmel bir model organizmadır. Bu laboratuvar prosedürü, yaygın olarak kullanılan pestisitlerin C. elegans davranışı ve hücre biyolojisi üzerindeki çeşitli etkilerini araştıran çok haftalık bir modülün parçası olarak kullanılabilir. Öğrenciler, kendilerine veri analizi ve sunum becerilerini öğreten bağımsız projelerin nasıl tasarlanacağını ve yürütüleceğini öğrenebilirler. Bu yazıda, C. elegans'ın pestisit karışımlarına maruz bırakılması ve daha sonra nöron morfolojisi üzerindeki etkilerin gözlemlenmesi ve analiz edilmesi için protokoller üzerinde durulmaktadır.

Çim kimyasal pestisit karışımları konut ve tarımsal kullanım için yaygın olarak kullanılmaktadır ve herhangi bir yerel bahçe mağazasından satın alınabilir. Bu kimyasalların insanlar ve vahşi yaşam için güvenliği konusunda artan endişeler var ^1,2,3. Öğrenciler bilimsel literatürü okuyabilir ve deneysel değerlendirme için bir pestisit seçebilir ve bunu yaparken temel biyoloji ve nörobiyolojinin yanı sıra deneysel tasarım ve analiz gibi önemli laboratuvar becerileri ve pipetleme ve seri seyreltme, disseksiyon mikroskobu, floresan mikroskopi, dijital fotoğrafçılık ve şekil üretimi gibi genel laboratuvar becerileri hakkında bilgi edinebilirler.

Bu makalede açıklanan protokoller, biyoloji veya sinirbilimde orta düzey bir derste tek başına durabilir veya belirli nöron grupları tarafından yönetilen davranışların ölçümlerini de içerebilen çok haftalık bir modülün parçası olabilir. Örneğin, bu protokolde tanımlanan, kolinerjik nöronlarda GFP'yi (LX 929) eksprese eden bir nematod suşu kullanarak hareketi yöneten kolinerjik nöronların morfolojisinin bir değerlendirmesidir⁴. Bu suşlar Caenorhabditis elegans Genetik Merkezi'nden (https://cgc.umn.edu/) çok düşük fiyatlarla elde edilebilir. Dopaminerjik nöronlarda GFP'yi ifade eden suşlar (OH 7457), kolinerjik nöronlar (LX 929) veya tüm nöronlarda (PVX4) eksprese edilen mCherry iyi seçimlerdir. Öğrenciler ayrıca hareket kabiliyetini ölçebilir ve morfolojinin değerlendirilmesine eşlik edecek veriler elde edebilirler. Çok haftalık bir öğrenci grubu projesinin tam bir açıklaması Susman^5'te bulunabilir.

Bu öğrenci grubu projesi, dört öğrenciden oluşan gruplar için oldukça ucuz ve kurulumu kolaydır. İhtiyaç duyulan malzemeler arasında diseksiyon mikroskobu, ekli bir dijital kameraya sahip olabilen bir floresan bileşik mikroskobuna erişim, Petri plakaları ve nematod büyüme agarına erişim, büyüme sınırlı bakteriler (CGC'den OP50 suşu), bir gaz alevli Bunsen brülörü veya bir alkol lambası, bir otoklav, platin tel ve mikropipetleyiciler, mikroskop slaytları gibi genel laboratuvar malzemeleri, kapaklar ve cam Pasteur pipetler. Öğrenci grupları tarafından incelenen kimyasal toksik maddeye bağlı olarak, protokoldeki adımların bir duman başlığı altında veya eldivenlerle gerçekleşmesi gerekebilir. Bu protokol, suda çözünür (uçucu olmayan) kimyasal karışımlar kullanır ve üretici tarafından önerilen tüm güvenli taşıma prosedürleri izlenir.

Protokol

Omurgasız hayvanların tüm kullanımı, kurumun hayvan bakımı ve kullanım kılavuzlarına uygundu.

1. Pestisit kaplı Petri plakalarının hazırlanması

1. Standart prosedürleri kullanarak agar Petri tabakları hazırlayın (6 cm çapında en iyi şekilde çalışır)⁶.
   NOT: Bunlar aylar öncesinden yapılabilir ve kullanıma kadar buzdolabında saklanabilir. Plakaları tezgah üstünde oda sıcaklığına (RT) getirin. Çoğu durumda, öğrenci gruplarına su kontrolü de dahil olmak üzere pestisit karışımının her seyreltilmesi için bir plaka sağlanmalıdır.
2. Seçilen pestisitin her seyrelticisinin 1 mL'sini etiketli 1,5 mL mikrofüj tüplerinde hazırlayın. Güvenli kullanım için, talimatları okuduğunuzdan ve eldiven sağladığınızdan emin olun veya öneriliyorsa bir duman başlığında çalışın.
   NOT: Test edilmesi önerilen seyreltmeler: 1 mL tam mukavemetli pestisit, suda 1:10 seyreltme (100 μL pestisit, 900 μL damıtılmış su), 1:100 seyreltme (10 μL pestisit, 990 μL su), 1:1000 seyreltme (1:10 seyreltmenin 10 μL'si, 990 μL su), vb.
3. Bir cam Pasteur pipeti (9 ml boyutunda) bir Bunsen brülör alevinde dikkatlice bükerek bir çözelti yayıcı yapın. Pipetin açıklığını kapatmak için alevi kullanın. Daha sonra Petri plakasına her yayılmadan önce yayıcıyı etanol ile sterilize edin.
4. Bir mikropipetleyici kullanarak, seyreltmenin (veya su kontrolünün) 100 μL'sini agarın merkezine yerleştirin ve sterilize edilmiş serpme makinesi ile yüzeye yavaşça yayın. Her kullanımdan önce yayıcıyı yeniden sterilize edin.
5. Kaplanmış Petri tabaklarını bir kenara koyun ve çözeltinin "kuruya" kadar yüzeye batırılmasına izin verin.
   NOT: Laboratuvardaki pestisit ve nem seviyelerine bağlı olarak, bu işlem biraz zaman alabilir. Öğrencilerin tabaklarını maruz kalma süresinden bir gün önce hazırlamaları gerekebilir.
6. 12 saatten daha uzun maruz kalma süreleri için, nematodları eklemeden önce plakalara 50 μL bir gece Escherichia coli kültürü ekleyin. Akut deneyler için (12 saat veya daha az), plakalarda E. coli olmasına gerek yoktur.

2. Pestisit kaplı plakalara nematodların eklenmesi

NOT: Öğrencilerin, Caenorhabditis elegans Genetik Merkezi'nden temin edilebilen floresan suşu LX929'un bir tabak yetişkin nematodlarına (5 günlük kültürler en iyisidir) sahip olmaları gerekecektir. Bunun için iki olası prosedür vardır. Öğrenciler nematodlarla çalışma konusunda daha önce deneyime sahiplerse (örneğin, bu prosedür çok haftalık bir egzersizin parçasıysa ve bir solucan toplama ile nematodların nasıl seçileceğini zaten öğrenmişlerse), Adım 2.1'i kullanın. Yoksa, Adım 2.2'yi kullanın.

1. Bir solucan toplama ile nematodları seçin. Bir Bunsen brülör alevi kullanılarak bir Pasteur pipete eritilen 1 inçlik platin tel parçasından bir solucan seçimi yapın. Toplama üzerine küçük bir yapışkan E. coli bloğu alın ve ardından yapışkan lekeyi kullanarak yetişkin nematodları toplayın. İyi bir numune büyüklüğü için, her tedavi plakası için 10 nematod seçin.
   NOT: Çok fazla deneyimi olmayan öğrenciler Adım 2.2-2.3'ü takip edebilirler.
2. Nematodların plakasına 1 mL steril su yerleştirmek için bir mikropipet kullanın. Nematodları kaldırmak için suyu etrafta dolaştırın, ardından nematodlarla sıvıyı 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne çıkarın.
3. Nematodların yaklaşık 10 dakika boyunca yerçekimi ile çökelmesine izin verin, ardından suyun en az 500 μL'sini dikkatlice çıkarın ve atın. Nematodları yeniden askıya alın ve kesilmiş sarı pipet ucu kullanarak, her bir tedavi plakasına 50-100 μL asılı solucanları çıkarın. Her plakanın en az 10 yetişkin solucanı olduğundan emin olun.
4. Bir zamanlayıcı ayarlayın veya saati not edin ve seçilen zaman dilimi için nematodları RT'de ortaya çıkarın. Seçilen pozlama süresi boyunca, ıslak montajlar için mikroskop slaytları hazırlayın. Slaytlar mikroskopi ile aynı gün yapılmalıdır.
   NOT: Öğrenci grupları, bağımsız çalışmaları için planlama sırasında maruz kalma zamanlarını seçmiş olacaklardır.

3. Islak montajlar için mikroskop slaytlarının hazırlanması

NOT: Adım 3.1-3.3 her öğrenci grubu tarafından gerçekleştirilebilir. Her biri üç slayt hazırlayın.

1. Slaytın yalnızca bir tarafına bir etiket bandı parçası yerleştirerek iki slayt hazırlayın (Şekil 1, sol panel). Bant, agarozun düzgün kalınlıkta bir ped oluşturması için doğru kalınlığı oluşturmak için kullanılır. Ardından, şekilde gösterildiği gibi, tezgahın üzerinde aralarına temiz, kullanılmayan bir slayt yerleştirin.
2. Ortadaki kızağın ortasına 10 μL'lik bir damla erimiş agaroz (ddH₂O'da% 3, 65 °C kuru blok ısıtıcı kullanılarak ısıtılır) yerleştirmek için bir mikropipetter kullanın.
3. Şekilde, şekilde gösterildiği gibi, damla ile slayda dik olarak üste başka bir temiz slayt yerleştirerek damlayı düzleştirin (Şekil 1, sağ panel). Basınç uygulayarak düzleştirin, böylece agaroz damlası etiketleme bandının kalınlığını oluşturur.
4. Agaroz yaklaşık 1 dakika içinde katılaşacaktır. Ardından, iki slaytı ayırmak için sabit basınç uygulayın. Agar çemberi slaytlardan birine yapışacaktır. Bu kaydırağı, agar tarafı yukarıya, tezgahın üzerinde dinlendirin ve kullanmadan önce 1-2 dakika kurumasını bekleyin.

4. Canlı nematodların mikroskop slaytlarına montajı

1. Agaroz pedi ile hazırlanan slayda nematodlar eklemek için, agar pedine 1 M sodyum azid (NaN₃) içeren 5 μL'lik bir su damlası ekleyin. Bu çözelti solucanları uyuşturur ve onları hareketsiz hale getirir.
   DİKKAT: Sodyum azid stok çözeltisi yutulursa hastalığa neden olabilir.
2. Daha sonra nematodları (tedavi slaytı başına en az 10) bir solucan toplama kullanarak damlacığa aktarın. Nematodları transfer etmek için kullanmadan önce ve sonra toplamayı sterilize edin.
3. Forseps kullanarak bir kapak kaymasını bir açıyla yerleştirip yavaşça alçaltarak ekleyin. Bir kalem veya metal prob kullanarak kapak kaymasının çok hızlı kaymasını veya düşmesini önleyin.
4. Solucanları gözlemlemek için hazırlanan ıslak montajı bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin, önce 10x büyütme ve faz kontrastı altında, daha sonra faz kontrastı ve floresan aydınlatma ile 40x büyütme altında.

5. Floresan mikroskopi

NOT: Öğrenci grupları, uygun şekilde etiketlemeleri gereken ayrı mikroskop slaytları üzerinde her türden birkaç solucandan oluşan ıslak bir montaj yapmalıdır. Aşağıdaki talimatlar, ekli bir trinoküler kuruluma, dijital kameraya ve bilgisayar sistemine sahip olabilen standart bir floresan bileşik mikroskobun kullanımı hakkında genel ipuçlarıdır. Bu makale için kullanılan kurgu Şekil 2'de görülmektedir. Öğrenciler, hedefler, ışık filtrelerinin türleri, parlak alan ve floresan ışık arasında geçiş yapma yeteneği, ışık sinyalinin dijital kameraya nasıl gönderileceği gibi mikroskop ayarlarına aşina olmalıdır.

1. Mikroskop sahnesine her seferinde hazırlanmış bir ıslak montaj yerleştirin ve mikroskop sahne klipslerini kullanarak yerine sabitleyin.
2. Islak yuvaları görüntülemeye ilk önce tipik olarak 10x olan en düşük büyütme hedefiyle görüntüleyerek başlayın ve nematodları görselleştirmek ve bunlara odaklanmak için parlak alan veya faz kontrastı kullanın.
3. Bir nematod görüş alanına yerleştirildikten sonra, mikroskop üzerindeki ince odak düğmesini kullanarak ona odaklanın. Kadranı çevirerek aydınlatmayı floresana geçirin. Ardından dijital görüntüleri yakalamak için ışığı kameraya yönlendirin. Görüntüleme yazılımını kullanarak aydınlatmayı, nöronların parlak bir şekilde aydınlatılması ancak aşırı doymamış olması için ayarlayın.
4. Bir noktada, şekilleri için bir büyütme ölçeği sağlamak üzere hücre görüntüleriyle aynı büyütmede bir cetvelin ayrı bir görüntüsünü elde edin. Mikroskop sahnesine şeffaf bir cetvelin veya mikrometre slaytının kısa bir bölümünü yerleştirin, ince odak düğmesini kullanarak üzerine odaklanın ve görüntüleme yazılımını kullanarak bir görüntü elde edin.
5. Mümkünse daha yüksek büyütmelerde ek görüntüler (en az 10 ayrı nematoddan) elde edin. Yoğun ışık muhtemelen görüntülendiği alanı ağartacaktır, bu nedenle görüntülemeyi dikkatlice izleyin ve ışığın slaytın aynı alanında uzun süre kalmasına izin vermeyin. Nematodun ve bölgenin yanı sıra tedaviyi ve büyütmeyi takip etmek için elde edilen görüntüleri adlandırdığınızdan emin olun.
6. Bilgisayarda bir klasör oluşturun ve görüntüleri analiz ve şekil hazırlamada kullanılmak üzere klasöre taşıyın.

6. Morfolojik bütünlük değerlendirme ölçeği

NOT: Nöronlardaki nörodejeneratif hasarın önemli bir sitolojik özelliği, soma morfolojisindeki bir değişikliktir. Kolayca görülebilen ve sayılabilen üç morfoloji vardır.

1. Şekil 3'te gösterildiği gibi, pürüzsüz, düzgün floresan süreçlere ve yuvarlak olmayan hücre gövdelerine sahip nöronları normal olarak sayın.
2. Genellikle soma, sağlıklı, genç nöronlarla karşılaştırıldığında yuvarlanır ve şişmiş görünür. Buna benzeyen nöronları "yuvarlak" olarak sayın.
3. Uzun nöral süreçlere sahip nöronlar, yuvarlak puncta veya hatta süreçlerde boşlukların olduğu yerlerde ağlama sergileyebilir. Bu özellikleri gösteren nöronları "kanadı" olarak sayın.

7. Veri analizi ve şekil hazırlama

1. Her tedavi için en az on nematod için sağlıklı (yuvarlama yok, ağartma yok) ve bozulmuş yüzde (yuvarlama ve / veya ağartma) sayıldıysa (Şekil 3), mevcut istatistiksel yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın.
2. Floresan olarak etiketlenmiş tüm nöronları sayın, normal morfoloji, ağartma morfolojisi veya yuvarlama morfolojisi sergileyenlerin bir çetelesini tutun ve ardından analiz edilen her nematod için toplam sayımdan her morfolojinin yüzdesini hesaplayın.
3. Rakamları hazırlamak için, görüntüleri Powerpoint gibi uygun bir yazılıma aktarın ve ardından alınan cetvel veya mikrometre görüntüsüne dayalı etiketler ve bir ölçek çubuğu ekleyin.

Sonuçlar

Bu makalede açıklanan yöntem ve protokoller, biyoloji veya sinirbilim alanındaki orta düzey lisans öğrencileri için önemli laboratuvar becerileri sağlamaktadır. Öğrenciler bağımsız bir proje geliştirme ve yeni sonuçlar sağlayabilecek kendi tasarımlarının bir deneyini yapma konusunda önemli deneyimler kazanabilirler. Şekil 3, sonunda yayınlanmış bir makalenin parçası haline gelen bir öğrenci projesinin optimal bir sonucunu göstermektedir³

Tartışmalar

Bu makalede açıklanan protokoller tek başına veya çok haftalık bağımsız öğrenci grubu projesinin bir parçası olarak başarılı bir şekilde çalışmaktadır. Protokoller ayrıca bağımsız, bir haftalık keşif deneyimlerine de uygundur. Nematod suşları araştırma laboratuvarında ucuz ve bakımı kolaydır. Öğrenciler, solucan toplama ile solucanların nasıl toplanacağını veya plakaları suyla yıkayarak ve yerçekimi ile yerleşmelerine izin vererek onları nasıl hareket ettireceklerini kolayc...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250