Examinando el efecto de los pesticidas en las neuronas caenorhabditis elegans

Resumen

Los nematodos Caenorhabditis elegans adultos jóvenes están expuestos a diferentes concentraciones de pesticidas comerciales u otros tóxicos durante 2-24 h. Luego, se pueden visualizar diferentes neuronas utilizando cepas que expresan fluorescentes. Este artículo demuestra cómo exponer los nematodos a los pesticidas y evaluar el daño neuronal.

Resumen

Caenorhabditis elegans es un poderoso organismo modelo utilizado en muchos laboratorios de investigación para comprender las consecuencias de la exposición a contaminantes químicos, pesticidas y una amplia variedad de sustancias tóxicas. Estos nematodos son fáciles de trabajar y se pueden utilizar para generar nuevos hallazgos de investigación, incluso en el laboratorio de biología de pregrado. Una serie de laboratorios de varias semanas de proyectos de investigación auténticos e impulsados por los estudiantes capacita a los estudiantes en un conjunto de técnicas y enfoques en mediciones de comportamiento, biología celular y microscopía que luego aplican a sus proyectos. Una técnica en ese conjunto de herramientas es cuantificar el porcentaje de neuronas que exhiben daño neurodegenerativo después de la exposición a un tóxico químico como un pesticida. Los nematodos de C. elegans adultos jóvenes pueden estar expuestos a diferentes concentraciones de pesticidas u otros tipos de tóxicos disponibles comercialmente durante 2-24 h. Luego, los estudiantes de pregrado pueden visualizar diferentes subtipos de neuronas utilizando cepas de C. elegans que expresan fluorescentes. Estas técnicas no requieren un sofisticado software de procesamiento de imágenes y son efectivas incluso a bajos aumentos, lo que hace innecesaria la necesidad de una costosa microscopía confocal. Este artículo demuestra cómo tratar los nematodos con pesticidas y cómo obtener imágenes y puntuar las neuronas. También proporciona un protocolo sencillo para la microscopía y el análisis de la morfología neuronal. Los materiales utilizados para esta técnica son baratos y fácilmente disponibles en la mayoría de los departamentos de biología de pregrado. Esta técnica se puede combinar con medidas de comportamiento como la locomoción, la desaceleración basal o la puesta de huevos para llevar a cabo una serie de experimentos potencialmente publicables y brindar a los estudiantes de pregrado una experiencia de investigación auténtica a un costo muy bajo.

Introducción

Caenorhabditis elegans es un excelente organismo modelo para la formación de cursos de laboratorio en cursos de ciencias biológicas para estudiantes de nivel introductorio e intermedio. Este procedimiento de laboratorio se puede utilizar como parte de un módulo de varias semanas que explora varios efectos de los pesticidas de uso común en el comportamiento de C. elegans y la biología celular. Los estudiantes pueden aprender a diseñar y llevar a cabo proyectos independientes que les enseñen habilidades de análisis de datos y presentación. Este artículo se centra en los protocolos para exponer A. elegans a mezclas de pesticidas y luego observar y analizar los efectos sobre la morfología neuronal.

Las mezclas de pesticidas químicos para césped son ampliamente utilizadas para uso residencial y agrícola y se pueden comprar en cualquier tienda de jardinería local. Existe una creciente preocupación por la seguridad de estos productos químicos para los seres humanos y la vida silvestre ^1,2,3. Los estudiantes pueden leer la literatura científica y seleccionar un pesticida para la evaluación experimental y, al hacerlo, pueden aprender sobre biología básica y neurobiología, así como importantes habilidades de laboratorio como diseño y análisis experimental, y habilidades generales de laboratorio como pipeteo y diluciones en serie, microscopía de disección, microscopía fluorescente, fotografía digital y producción de figuras.

Los protocolos descritos en este artículo pueden ser independientes en un curso de nivel intermedio en biología o neurociencia o ser parte de un módulo de varias semanas que también podría incluir mediciones de comportamientos gobernados por grupos particulares de neuronas. Por ejemplo, se describe en este protocolo una evaluación de la morfología de las neuronas colinérgicas que gobiernan la locomoción utilizando una cepa de nematodo que expresa GFP (LX 929) en las neuronas colinérgicas⁴. Estas cepas se pueden obtener a precios muy bajos en el Centro de Genética Caenorhabditis elegans (https://cgc.umn.edu/). Las cepas que expresan GFP en neuronas dopaminérgicas (OH 7457), neuronas colinérgicas (LX 929) o mCherry expresadas en todas las neuronas (PVX4) son buenas opciones. Los estudiantes también podrían medir la locomoción y obtener datos para acompañar la evaluación de la morfología. Una descripción completa de un proyecto de grupo de estudiantes de varias semanas se puede encontrar en Susman⁵.

Este proyecto de grupo de estudiantes es bastante económico y fácil de configurar para grupos de cuatro estudiantes. Los materiales necesarios incluyen un microscopio de disección, acceso a un microscopio compuesto de fluorescencia que puede tener una cámara digital adjunta, placas de Petri y acceso a agar de crecimiento de nematodos, bacterias de crecimiento limitado (cepa OP50, del CGC), un quemador Bunsen de llama de gas o una lámpara de alcohol, un autoclave, alambre de platino y suministros generales de laboratorio como micropipetas, portaobjetos de microscopio, fundas, y pipetas Pasteur de vidrio. Dependiendo del tóxico químico que estén examinando los grupos de estudiantes, los pasos en el protocolo pueden necesitar ocurrir bajo una campana de humos o con guantes. Este protocolo utiliza mezclas químicas que son solubles en agua (no volátiles), y se siguen todos los procedimientos de manejo seguro recomendados por el fabricante.

Protocolo

Todo uso de animales invertebrados cumplió con las pautas de cuidado y uso de animales de la institución.

1. Preparación de placas de Petri recubiertas de plaguicidas

1. Prepare placas de Petri de agar (las placas de Petri de 6 cm de diámetro funcionan mejor) utilizando procedimientos estándar⁶.
   NOTA: Estos se pueden hacer con meses de anticipación y almacenarse en el refrigerador hasta su uso. Lleve las placas a temperatura ambiente (RT) en la mesa de trabajo. En la mayoría de los casos, a los grupos de estudiantes se les debe proporcionar un plato para cada dilución de la mezcla de pesticidas, incluido un control de agua.
2. Preparar 1 ml de cada dilución del plaguicida elegido en tubos de microfuge de 1,5 ml etiquetados. Para un manejo seguro, asegúrese de leer las instrucciones y proporcionar guantes, o trabaje en una campana de humos, si se sugiere.
   NOTA: Diluciones sugeridas para probar: 1 ml de plaguicida de fuerza completa, dilución de 1:10 en agua (100 μL de plaguicida, 900 μL de agua destilada), dilución de 1:100 (10 μL de plaguicida, 990 μL de agua), dilución de 1:1000 (10 μL de la dilución de 1:10, 990 μL de agua), etc.
3. Haga un esparcidor de solución doblando cuidadosamente una pipeta Pasteur de vidrio (tamaño de 9 ml) en una llama de quemador Bunsen. Use la llama para cerrar la abertura de la pipeta. Luego, esterilice el esparcidor con etanol antes de cada propagación en la placa de Petri.
4. Usando un micropipetador, coloque 100 μL de la dilución (o control de agua) en el centro del agar y extiéndalo suavemente por la superficie con el esparcidor esterilizado. Vuelva a esterilizar el esparcidor antes de cada uso.
5. Deje a un lado las placas de Petri cubiertas y deje que la solución se empape en la superficie hasta que se "seque".
   NOTA: Dependiendo de los niveles de pesticidas y humedad en el laboratorio, esto puede llevar algún tiempo. Es posible que los estudiantes deban preparar sus platos el día antes del período de exposición.
6. Para períodos de exposición superiores a 12 h, añadir 50 μL de un cultivo nocturno de Escherichia coli a las placas antes de añadir los nematodos. Para experimentos agudos (12 h o menos), no hay necesidad de tener E. coli en las placas.

2. Adición de nematodos a placas recubiertas de pesticidas

NOTA: Los estudiantes deberán tener una placa de nematodos adultos (los cultivos de 5 días son los mejores) de la cepa fluorescente LX929, que está disponible en el Centro de Genética Caenorhabditis elegans . Hay dos procedimientos posibles para esto. Si los estudiantes han tenido experiencia previa trabajando con nematodos (por ejemplo, si este procedimiento es parte de un ejercicio de varias semanas y ya han aprendido a recoger nematodos con un pico de gusano), use el Paso 2.1. Si no lo han hecho, utilice el paso 2.2.

1. Elija nematodos con un pico de gusano. Diseñe una selección de gusano de un trozo de alambre de platino de 1 pulgada que se funde en una pipeta Pasteur usando una llama de quemador Bunsen. Tome una pequeña mancha de E. coli pegajosa en la púa y luego recoja los nematodos adultos usando la mancha pegajosa. Para un tamaño de muestra decente, elija 10 nematodos para cada placa de tratamiento.
   NOTA: Los estudiantes sin mucha experiencia pueden seguir los pasos 2.2-2.3.
2. Use una micropipeta para colocar 1 ml de agua estéril en la placa de nematodos. Agite el agua para levantar los nematodos, luego retire el líquido con los nematodos a un tubo de microfuge de 1.5 ml.
3. Deje que los nematodos se asienten por gravedad durante aproximadamente 10 minutos, luego retire cuidadosamente al menos 500 μL del agua y deseche. Resuspender los nematodos y, usando una punta de pipeta amarilla cortada, eliminar 50-100 μL de gusanos suspendidos a cada placa de tratamiento. Asegúrese de que cada placa tenga al menos 10 gusanos adultos.
4. Establezca un temporizador, o anote la hora, y exponga los nematodos en RT para el período de tiempo elegido. Durante el tiempo de exposición elegido, prepare portaobjetos de microscopio para montajes húmedos. Las diapositivas deben hacerse el mismo día que la microscopía.
   NOTA: Los grupos de estudiantes habrán elegido su tiempo de exposición durante la planificación de su estudio independiente.

3. Preparación de portaobjetos de microscopio para montajes húmedos

NOTA: Los pasos 3.1-3.3 pueden ser realizados por cada grupo de estudiantes. Prepare tres diapositivas cada una.

1. Prepare dos diapositivas colocando un trozo de cinta adhesiva en un solo lado de la diapositiva (Figura 1, panel izquierdo). La cinta se utiliza para crear el grosor correcto para que la agarosa forme una almohadilla de espesor uniforme. Luego coloque una diapositiva limpia y sin usar entre ellos en la mesa de trabajo, como se ilustra en la figura.
2. Use un micropipetador para colocar una gota de 10 μL de agarosa derretida (3% en ddH₂O, calentada con un calentador de bloque seco de 65 ° C) en el centro de la diapositiva que se encuentra en el medio.
3. Aplanar la gota colocando otra diapositiva limpia en la parte superior, perpendicular a la diapositiva con la caída, como se muestra en la figura (Figura 1, panel derecho). Aplanar aplicando presión, de modo que la gota de agarosa forme el grosor de la cinta de etiquetado.
4. La agarosa se solidificará en aproximadamente 1 minuto. Luego, aplique una presión constante para separar las dos diapositivas. El círculo de agar se adherirá a una de las diapositivas. Apoye este tobogán, agar de lado hacia arriba, en la mesa de trabajo, y deje que se seque durante 1-2 minutos antes de usarlo.

4. Montaje de nematodos vivos en portaobjetos de microscopio

1. Para agregar nematodos al portaobjetos preparado con la almohadilla de agarosa, agregue una gota de agua de 5 μL que contenga 1 M de azida de sodio (NaN₃) a la almohadilla de agar. Esta solución anestesia a los gusanos y los inmoviliza.
   PRECAUCIÓN: La solución madre de azida de sodio puede causar enfermedades si se ingiere.
2. Luego transfiera los nematodos (al menos 10 por diapositiva de tratamiento) a la gota usando una pastilla de gusano. Esterilizar el pico antes y después de usarlo para transferir nematodos.
3. Use fórceps para agregar un deslizamiento colocándolo en ángulo y bajándolo lentamente. Evite que el cubrehojas se deslice o baje demasiado rápido usando un lápiz o una sonda de metal.
4. Coloque el soporte húmedo preparado en un microscopio fluorescente para observar los gusanos, primero con un aumento de 10x y contraste de fase, luego con un aumento de 40x con contraste de fase e iluminación fluorescente.

5. Microscopía fluorescente

NOTA: Los grupos de estudiantes deben hacer un montaje húmedo de varios gusanos de cada tipo en portaobjetos de microscopio separados, que deben etiquetar adecuadamente. Las instrucciones que siguen son consejos generales sobre el uso de un microscopio compuesto de fluorescencia estándar que puede tener una configuración trinocular adjunta, una cámara digital y un sistema informático. La configuración utilizada para este manuscrito se ve en la Figura 2. Los estudiantes deben estar familiarizados con la configuración del microscopio, incluidos los objetivos, los tipos de filtros de luz, la capacidad de cambiar entre el campo brillante y la luz de fluorescencia, cómo enviar la señal de luz a la cámara digital, etc.

1. Coloque un soporte húmedo preparado a la vez en el escenario del microscopio y asegúrelo en su lugar usando los clips del escenario del microscopio.
2. Comience a ver los soportes húmedos viendo primero con el objetivo de aumento más bajo, que generalmente es de 10x, y use un campo brillante o contraste de fase para visualizar y enfocar los nematodos.
3. Una vez que un nematodo se encuentra en el campo de visión, concéntrese en él usando la perilla de enfoque fino en el microscopio. Cambie la iluminación a la fluorescencia girando el dial. Luego dirija la luz a la cámara para capturar las imágenes digitales. Ajuste la iluminación utilizando el software de imágenes para que las neuronas estén brillantemente iluminadas pero no sobresaturadas.
4. En algún momento, obtenga una imagen separada de una regla con el mismo aumento que las imágenes de celda para proporcionar una escala de aumento para su figura. Coloque una sección corta de una regla transparente, o un portaobjetos de micrómetro, concéntrese en ella usando la perilla de enfoque fino y obtenga una imagen utilizando el software de imágenes.
5. Obtenga imágenes adicionales (de al menos 10 nematodos separados) a aumentos más altos, si es posible. La luz intensa probablemente blanqueará el área desde la que se está tomando la imagen, así que controle cuidadosamente las imágenes y no permita que la luz permanezca en la misma área de la diapositiva durante largos períodos de tiempo. Asegúrese de nombrar las imágenes adquiridas para realizar un seguimiento del nematodo y la región, así como el tratamiento y la ampliación.
6. Haga una carpeta en la computadora y mueva las imágenes a la carpeta para usarlas en el análisis y la preparación de figuras.

6. Escala de evaluación de la integridad morfológica

NOTA: Una característica citológica clave del daño neurodegenerativo en las neuronas es un cambio en la morfología del soma. Hay tres morfologías que se pueden ver y contar fácilmente.

1. Cuente las neuronas con procesos suaves y uniformemente fluorescentes y cuerpos celulares no redondos como normales, como se muestra en la Figura 3.
2. A menudo, el soma se vuelve redondeado e hinchado en comparación con las neuronas jóvenes y sanas. Cuente las neuronas que se ven así como "redondeadas".
3. Las neuronas con procesos neuronales largos pueden exhibir sangrado, donde hay puntos redondeados o incluso huecos en los procesos. Cuente las neuronas que muestran estas características como "sangrantes".

7. Análisis de datos y preparación de figuras

1. Si se cuenta el porcentaje sano (sin redondeo, sin sangrado) y el porcentaje de alteración (redondeo y/o sangrado) para al menos diez nematodos para cada tratamiento (Figura 3), realice el análisis estadístico utilizando el software estadístico disponible.
2. Cuente todas las neuronas que están marcadas fluorescentemente, manteniendo un recuento de las que exhiben morfología normal, morfología de sangrado o morfología de redondeo, y luego calcule el porcentaje de cada morfología del recuento total para cada nematodo analizado.
3. Para preparar figuras, importe las imágenes a un software apropiado como Powerpoint y luego agregue etiquetas y una barra de escala basada en la imagen de regla o micrómetro adquirida.

Resultados

Los métodos y protocolos descritos en este documento proporcionan importantes habilidades de laboratorio para estudiantes de pregrado de nivel intermedio en biología o neurociencia. Los estudiantes pueden adquirir una experiencia importante en el desarrollo de un proyecto independiente y la realización de un experimento de su propio diseño que podría proporcionar resultados novedosos. La Figura 3 muestra un resultado óptimo de un proyecto estudiantil que eventualmente se convirtió en ...

Discusión

Los protocolos descritos en este manuscrito funcionan con éxito solos o como parte de un proyecto de grupo de estudiantes independiente de varias semanas. Los protocolos también son susceptibles de experiencias exploratorias independientes de una semana. Las cepas de nematodos son baratas y fáciles de mantener en el laboratorio de investigación. Los estudiantes pueden aprender fácilmente cómo recoger gusanos con un pico de gusano o cómo moverlos enjuagando las placas con agua y permitiéndoles asentarse por graved...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250