בחינת ההשפעה של חומרי הדברה על נוירונים Caenorhabditis elegans

Summary

בוגרים צעירים Caenorhabditis elegans נמטודות נחשפים לריכוזים שונים של חומרי הדברה מסחריים או חומרים רעילים אחרים במשך 2-24 שעות. לאחר מכן, ניתן לדמיין נוירונים שונים באמצעות זנים המבטאים פלואורסצנטיות. מאמר זה מדגים כיצד לחשוף נמטודות לחומרי הדברה ולהעריך את הנזק לתאי העצב.

Abstract

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל רב עוצמה המשמש במעבדות מחקר רבות כדי להבין את ההשלכות של חשיפה למזהמים כימיים, חומרי הדברה ומגוון רחב של חומרים רעילים. קל לעבוד עם נמטודות אלה וניתן להשתמש בהן כדי ליצור ממצאי מחקר חדשניים, אפילו במעבדה לביולוגיה לתואר ראשון. סדרה מעבדתית בת מספר שבועות של פרויקטי מחקר אותנטיים, מונחי סטודנטים, מכשירה את התלמידים בארגז כלים של טכניקות וגישות במדידות התנהגותיות, ביולוגיה של התא ומיקרוסקופיה שהם מיישמים לאחר מכן בפרויקטים שלהם. טכניקה אחת בארגז הכלים הזה היא כימות אחוז הנוירונים שמפגינים נזק נוירודגנרטיבי בעקבות חשיפה לחומר רעיל כימי כמו חומר הדברה. נמטודות C. elegans בוגרות צעירות יכולות להיחשף לריכוזים שונים של חומרי הדברה זמינים מסחרית או סוגים אחרים של חומרים רעילים למשך 2-24 שעות. לאחר מכן, סטודנטים לתואר ראשון יכולים לדמיין תתי-סוגים שונים של תאי עצב באמצעות זנים המבטאים פלואורסצנטים של C. elegans. טכניקות אלה אינן דורשות תוכנות עיבוד תמונה מתוחכמות והן יעילות אפילו בהגדלות נמוכות, מה שהופך את הצורך במיקרוסקופיה קונפוקלית יקרה למיותר. מאמר זה מדגים כיצד לטפל בנמטודות באמצעות חומרי הדברה וכיצד לדמות ולדרג את הנוירונים. הוא גם מספק פרוטוקול פשוט למיקרוסקופיה ולניתוח של מורפולוגיה של נוירונים. החומרים המשמשים לטכניקה זו הם זולים וזמינים בקלות ברוב המחלקות לביולוגיה לתואר ראשון. ניתן לשלב טכניקה זו עם מדדים התנהגותיים כמו תנועה, האטה בסיסית או הטלת ביצים כדי לערוך סדרת ניסויים שעשויה להיות ניתנת לפרסום ולהעניק לסטודנטים לתואר ראשון חווית מחקר אותנטית בעלות נמוכה מאוד.

Introduction

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל מצוין להכשרת קורסי מעבדה בקורסי מדעי הביולוגיה לתלמידי מבוא ובדרג ביניים. הליך מעבדה זה יכול לשמש כחלק ממודול רב-שבועי החוקר השפעות שונות של חומרי הדברה נפוצים על התנהגות C. elegans וביולוגיה של התא. התלמידים יכולים ללמוד כיצד לעצב ולבצע פרויקטים עצמאיים המלמדים אותם ניתוח נתונים ומיומנויות הצגה. מאמר זה מתמקד בפרוטוקולים לחשיפת C. elegans לתערובות חומרי הדברה ולאחר מכן התבוננות וניתוח ההשפעות על המורפולוגיה של נוירונים.

תערובות הדברה כימיות דשא נמצאות בשימוש נרחב למגורים ולחקלאות וניתן לרכוש אותן בכל חנות גינה מקומית. קיים חשש גובר לגבי בטיחותם של כימיקלים אלה עבור בני אדם וחיות בר ^1,2,3. התלמידים יכולים לקרוא את הספרות המדעית ולבחור חומר הדברה להערכה ניסויית, ובכך ללמוד על ביולוגיה בסיסית ונוירוביולוגיה, כמו גם על מיומנויות מעבדה חשובות כמו תכנון וניתוח ניסויים, ומיומנויות מעבדה כלליות כמו צנרת ודילולים סדרתיים, מיקרוסקופיה ניתוחית, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, צילום דיגיטלי וייצור דמויות.

הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה יכולים לעמוד בפני עצמם בקורס ברמה בינונית בביולוגיה או במדעי המוח או להיות חלק ממודול רב-שבועי שיכול לכלול גם מדידות של התנהגויות הנשלטות על ידי קבוצות מסוימות של נוירונים. לדוגמה, המתואר בפרוטוקול זה הוא הערכה של המורפולוגיה של נוירונים כולינרגיים השולטים בתנועה באמצעות זן של נמטודה המבטאת GFP (LX 929) בתאי עצב כולינרגיים⁴. זנים אלה ניתן להשיג במחירים נמוכים מאוד ממרכז הגנטיקה של Caenorhabditis elegans (https://cgc.umn.edu/). זנים המבטאים GFP בתאי עצב דופמינרגיים (OH 7457), נוירונים כולינרגיים (LX 929) או mCherry המתבטאים בכל תאי העצב (PVX4) הם כולם בחירות טובות. התלמידים יכלו גם למדוד תנועה ולקבל נתונים שילוו את הערכת המורפולוגיה. תיאור מלא של פרויקט קבוצת סטודנטים רב-שבועית ניתן למצוא בסוסמן⁵.

פרויקט זה של קבוצת סטודנטים הוא די זול וקל להתקנה לקבוצות של ארבעה תלמידים. החומרים הדרושים כוללים מיקרוסקופ מנתח, גישה למיקרוסקופ תרכובת פלואורסצנטית שיכולה להכיל מצלמה דיגיטלית מחוברת, לוחות פטרי וגישה לאגר גדילת נמטודות, חיידקים מוגבלי גדילה (זן OP50, מה- CGC), מבער בונזן להבת גז או מנורת אלכוהול, אוטוקלאב, חוט פלטינה, ואספקת מעבדה כללית כמו מיקרופיפטרים, מגלשות מיקרוסקופ, כיסויים, ופיפטות פסטר זכוכית. בהתאם לרעלן הכימי שנבדק על ידי קבוצות התלמידים, ייתכן שהשלבים בפרוטוקול יצטרכו להתרחש מתחת למכסה אדים או עם כפפות. פרוטוקול זה משתמש בתערובות כימיות מסיסות במים (לא נדיפות), וכל נהלי הטיפול הבטוח המומלצים על ידי היצרן מתבצעים.

Protocol

כל השימוש בבעלי חיים חסרי חוליות היה בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים והשימוש בהם של המוסד.

1. הכנת צלחות פטרי מצופים בחומרי הדברה

1. מכינים צלחות אגר פטרי (עבודה בקוטר 6 ס"מ בצורה הטובה ביותר) באמצעות נהלים סטנדרטיים⁶.
   הערה: ניתן להכין אותם חודשים מראש ולאחסן אותם במקרר עד לשימוש. הביאו צלחות לטמפרטורת החדר (RT) על הספסל. ברוב המקרים, יש לספק לקבוצות התלמידים צלחת לכל דילול של תערובת חומרי ההדברה, כולל בקרת מים.
2. הכינו 1 מ"ל מכל דילול של חומר ההדברה שנבחר בצינורות מיקרו-פוגה מסומנים של 1.5 מ"ל. לטיפול בטוח, הקפד לקרוא את ההוראות ולספק כפפות, או לעבוד במכסה אדים, אם הוצע.
   הערה: דילולים מוצעים לבדיקה: 1 מ"ל של חומר הדברה בחוזק מלא, דילול 1:10 במים (100 μL של חומר הדברה, 900 μL של מים מזוקקים), 1:100 דילול (10 μL של חומר הדברה, 990 μL של מים), 1:1000 דילול (10 μL של דילול 1:10, 990 μL של מים) וכו '.
3. הכינו מפזר תמיסה על ידי כיפוף קפדני של פיפטת פסטר זכוכית (בגודל 9 מ"ל) בלהבת מבער בונזן. השתמש בלהבה כדי לסגור את פתח הפיפטה. לאחר מכן אתנול-מעקרים את המפיץ לפני כל התפשטות על צלחת פטרי.
4. באמצעות מיקרו-פיפטר, מניחים 100 μL של הדילול (או בקרת המים) על מרכז האגר ומתפשטים בעדינות על פני השטח עם המפזר המעוקר. לעקר מחדש את המפזר לפני כל שימוש.
5. הניחו בצד את כלי הפטרי המכוסים, ותנו לתמיסה להיספג על פני השטח עד ל"ייבוש".
   הערה: בהתאם לרמות ההדברה והלחות במעבדה, הדבר עשוי להימשך זמן מה. ייתכן שהתלמידים יצטרכו להכין את הצלחות שלהם יום לפני תקופת החשיפה.
6. עבור תקופות חשיפה שאורכן עולה על 12 שעות, הוסיפו 50 μL של תרבית לילה של Escherichia coli ללוחות לפני הוספת הנמטודות. עבור ניסויים חריפים (12 שעות או פחות), אין צורך שיהיה E. coli על הלוחות.

2. הוספת נמטודות לצלחות מצופות חומרי הדברה

הערה: התלמידים יצטרכו להיות בעלי צלחת של נמטודות בוגרות (תרביות של 5 ימים הן הטובות ביותר) של הזן הפלואורסצנטי LX929, הזמין ממרכז הגנטיקה Caenorhabditis elegans . ישנם שני הליכים אפשריים לכך. אם לתלמידים היה ניסיון קודם בעבודה עם נמטודות (לדוגמה, אם הליך זה הוא חלק מתרגיל רב-שבועי והם כבר למדו כיצד לקטוף נמטודות עם קטיף תולעים), השתמש בשלב 2.1. אם הם לא עשו זאת, השתמש בשלב 2.2.

1. בחר נמטודות עם פיק תולעים. מעצבים את בחירת התולעת מחוט פלטינה 1 ב-1 מתוך פיסת פלטינה שנמסה לפיפטה של פסטר באמצעות להבת מבער בונזן. הרימו כתם קטן של E. coli דביק על הפיק ואז הרימו נמטודות בוגרות באמצעות הכתם הדביק. לגודל מדגם סביר, בחרו 10 נמטודות לכל צלחת טיפול.
   הערה: תלמידים ללא ניסיון רב יכולים לעקוב אחר שלבים 2.2-2.3.
2. השתמש במיקרופיפט כדי להניח 1 מ"ל של מים סטריליים על צלחת הנמטודות. סובבו את המים כדי להרים את הנמטודות, ואז הסירו את הנוזל עם הנמטודות לצינור מיקרופוג' של 1.5 מ"ל.
3. תן לנמטודות להתיישב בכוח הכבידה במשך כ -10 דקות, ואז בזהירות להסיר לפחות 500 μL של המים ולהשליך. החייא את הנמטודות, ובאמצעות קצה פיפטה צהוב חתוך, הסר 50-100 μL של תולעים תלויות לכל צלחת טיפול. ודאו שבכל צלחת יש לפחות 10 תולעים בוגרות.
4. הגדר טיימר, או שים לב לשעה, וחשוף את הנמטודות ב- RT עבור פרק הזמן שנבחר. במהלך זמן החשיפה שנבחר, הכינו מגלשות מיקרוסקופ לתושבות רטובות. השקופיות צריכות להיעשות באותו יום כמו המיקרוסקופיה.
   הערה: קבוצות סטודנטים יבחרו את זמן החשיפה שלהם במהלך התכנון ללימודים העצמאיים שלהם.

3. הכנת שקופיות מיקרוסקופיות לתושבות רטובות

הערה: שלבים 3.1-3.3 יכולים להתבצע על ידי כל קבוצת תלמידים. הכן שלוש שקופיות כל אחת.

1. הכינו שתי שקופיות על-ידי הצבת פיסת נייר דבק רק בצד אחד של השקופית (איור 1, לוח שמאלי). הסרט משמש ליצירת העובי הנכון עבור האגרוז כדי ליצור כרית בעובי אחיד. לאחר מכן מקם שקופית נקייה ולא מנוצלת ביניהם על ראש הספסל, כפי שמודגם באיור.
2. השתמש במיקרופיפטר כדי להניח טיפה של 10 μL של אגרוז מומס (3% ב- ddH₂O, מחומם באמצעות מחמם בלוק יבש של 65 °C) על מרכז המגלשה שנמצאת באמצע.
3. שטחו את הטיפה על-ידי הצבת שקופית נקייה נוספת למעלה, בניצב לשקופית עם הטיפה, כפי שמוצג באיור (איור 1, לוח ימני). משטחים על ידי הפעלת לחץ, כך שהטיפה האגרוזית יוצרת את עובי סרט התיוג.
4. האגרוס יתמצק תוך כדקה אחת. לאחר מכן, הפעילו לחץ קבוע כדי להפריד בין שתי השקופיות. מעגל האגר ידבק באחת השקופיות. הנח את המגלשה הזו, אגר בצד למעלה, על הספסל, ואפשר לה להתייבש במשך 1-2 דקות לפני השימוש.

4. הרכבת נמטודות חיות על גבי שקופיות מיקרוסקופיות

1. כדי להוסיף נמטודות למגלשה המוכנה עם כרית האגרוז, הוסיפו טיפת מים של 5 μL המכילה 1 M נתרן אזיד (NaN₃) למשטח האגר. פתרון זה מרדים את התולעים ומשתק אותן.
   אזהרה: תמיסת מלאי נתרן אזיד עלולה לגרום למחלה אם היא נבלעת.
2. לאחר מכן העבירו נמטודות (לפחות 10 לכל שקופית טיפול) לטיפות באמצעות פיק תולעים. לעקר את הפיק לפני ואחרי השימוש בו להעברת נמטודות.
3. השתמש במלקחיים כדי להוסיף כיסוי על ידי הצבתו בזווית והורדתו באיטיות. מנעו מהכיסוי להחליק או להנמיך מהר מדי על ידי שימוש בעיפרון או בבדיקת מתכת.
4. הניחו את התושבת הרטובה המוכנה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות בתולעים, תחילה תחת הגדלה וניגודיות פאזה של פי 10, ולאחר מכן תחת הגדלה של פי 40 עם ניגודיות פאזה ותאורה פלואורסצנטית.

5. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

הערה: קבוצות תלמידים צריכות להכין תושבת רטובה של מספר תולעים מכל סוג על שקופיות מיקרוסקופ נפרדות, שאותן הן צריכות לסמן כראוי. ההוראות הבאות הן טיפים כלליים לגבי השימוש במיקרוסקופ תרכובת פלואורסצנטית סטנדרטי שיכול להיות בעל מערך תלת-עיני מחובר, מצלמה דיגיטלית ומערכת מחשב. ההגדרה ששימשה לכתב יד זה מופיעה באיור 2. התלמידים צריכים להכיר את ההגדרות של המיקרוסקופ, כולל המטרות, סוגי מסנני האור, היכולת לעבור בין שדה בהיר לאור פלואורסצנטי, כיצד לשלוח את אות האור למצלמה הדיגיטלית וכו '.

1. הניחו תושבת רטובה אחת מוכנה בכל פעם על במת המיקרוסקופ והצמידו אותה למקומה באמצעות קליפסים של שלב המיקרוסקופ.
2. התחל לצפות בתושבות הרטובות על ידי צפייה ראשונה עם מטרת ההגדלה הנמוכה ביותר, שהיא בדרך כלל פי 10, והשתמש בשדה בהיר או בניגוד פאזה כדי להמחיש ולהתמקד בנמטודות.
3. ברגע שנמטודה ממוקמת בשדה הראייה, התמקדו בה באמצעות ידית המיקוד העדינה במיקרוסקופ. העבר את התאורה לפלואורסצנציה על-ידי סיבוב החוגה. לאחר מכן הפנה את האור למצלמה כדי לצלם את התמונות הדיגיטליות. התאם את התאורה באמצעות תוכנת ההדמיה כך שתאי העצב יהיו מוארים בבהירות אך לא רוויים יתר על המידה.
4. בשלב מסוים, קבל תמונה נפרדת של סרגל באותה הגדלה כמו תמונות התא כדי לספק סולם הגדלה עבור הדמות שלהם. הניחו מקטע קצר של סרגל שקוף, או שקופית מיקרומטר, על במת המיקרוסקופ, התמקדו בו באמצעות ידית המיקוד העדינה וקבלו תמונה באמצעות תוכנת ההדמיה.
5. קבל תמונות נוספות (מלפחות 10 נמטודות נפרדות) בהגדלה גבוהה יותר, במידת האפשר. סביר להניח שהאור העז ילבין את האזור שממנו הוא מצולם, ולכן עקוב בקפידה אחר ההדמיה ולא יאפשר לאור להישאר באותו אזור של המגלשה לפרקי זמן ארוכים. הקפד לתת שם לתמונות שנרכשו כדי לעקוב אחר הנמטודה והאזור, כמו גם הטיפול וההגדלה.
6. צור תיקיה במחשב והעבר את התמונות לתיקיה לשימוש בניתוח ובהכנת דמות.

6. סולם הערכת יושרה מורפולוגית

הערה: מאפיין ציטולוגי מרכזי של נזק נוירודגנרטיבי בתאי עצב הוא שינוי במורפולוגיה של סומה. ישנן שלוש מורפולוגיות שניתן לצפות בהן בקלות ולספור אותן.

1. ספרו את תאי העצב עם תהליכים פלואורסצנטיים חלקים ואחידים וגופי תאים לא עגולים כרגיל, כפי שמוצג באיור 3.
2. לעתים קרובות הסומה הופכת מעוגלת ונפוחה למראה בהשוואה לנוירונים צעירים ובריאים. ספרו את הנוירונים שנראים כך כ"מעוגלים".
3. נוירונים עם תהליכים עצביים ארוכים יכולים להפגין blebbing, שבו יש puncta מעוגל או אפילו פערים בתהליכים. ספרו את הנוירונים שמראים את התכונות האלה כ"מפוצצים".

7. ניתוח נתונים והכנת דמות

1. אם נספרו האחוזים הבריאים (ללא עיגול, ללא בליבה) ואחוז הפגיעה (עיגול ו/או בליטה) עבור לפחות עשר נמטודות לכל טיפול (איור 3), בצעו ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה סטטיסטית זמינה.
2. ספרו את כל תאי העצב המתויגים באופן פלואורסצנטי, תוך שמירה על רשימה של אלה המציגים מורפולוגיה נורמלית, מורפולוגיה מפוצצת או מורפולוגיה מעוגלת, ולאחר מכן חישבו את האחוז של כל מורפולוגיה מתוך הספירה הכוללת של כל נמטודה שנותחה.
3. כדי להכין איורים, ייבא את התמונות לתוכנה מתאימה כמו Powerpoint ולאחר מכן הוסף תוויות וסרגל קנה מידה המבוסס על תמונת הסרגל או המיקרומטר שנרכשו.

תוצאות

השיטות והפרוטוקולים המתוארים במאמר זה מספקים מיומנויות מעבדה חשובות לסטודנטים לתואר ראשון ברמה בינונית בביולוגיה או במדעי המוח. התלמידים יכולים לצבור ניסיון חשוב בפיתוח פרויקט עצמאי ועריכת ניסוי של העיצוב שלהם שיכול לספק תוצאות חדשות. איור 3 מראה תוצאה אופטימלית של פרוי...

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה פועלים בהצלחה לבדה או כחלק מפרויקט של קבוצת סטודנטים עצמאית רב-שבועית. הפרוטוקולים נוחים גם לחוויות חקירה עצמאיות של שבוע אחד. זני הנמטודות זולים וקלים לתחזוקה במעבדת המחקר. התלמידים יכולים ללמוד בקלות כיצד לקטוף תולעים עם קטיף תולעים או כיצד להזיז אותן על...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250