إعداد أنسجة عضلة القلب البشرية للزراعة على المدى الطويل

Jules Hamers; Payel Sen; Daphne Merkus; Thomas Seidel; Kun Lu; Andreas Dendorfer

doi:10.3791/63964

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نقدم بروتوكولا لزراعة أنسجة عضلة القلب البطينية البشرية خارج الجسم الحي. يسمح بإجراء تحليل مفصل لقوة الانكماش والحركيات ، بالإضافة إلى تطبيق الحمل المسبق واللاحق لمحاكاة البيئة الفسيولوجية في الجسم الحي عن كثب.

Abstract

شهدت زراعة الخلايا العضلية القلبية عددا كبيرا من التطورات ، بدءا من زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) إلى المواد العضوية المشتقة من iPSC. في عام 2019 ، تم عرض طريقة خارج الجسم الحي لزراعة شرائح عضلة القلب التي تم الحصول عليها من عينات القلب البشري ، بينما تقترب في حالة الجسم الحي من تقلص عضلة القلب. تنشأ هذه العينات في الغالب من عمليات زرع القلب أو مواضع أجهزة مساعدة البطين الأيسر. باستخدام اهتزاز ونظام زراعة مطور خصيصا ، يتم وضع شرائح بسماكة 300 ميكرومتر بين سلك ثابت وسلك زنبركي ، مما يسمح بزراعة مستقرة وقابلة للتكرار لعدة أسابيع. أثناء الزراعة ، يتم تحفيز الشرائح باستمرار وفقا للإعدادات الفردية. يمكن عرض الانقباضات وتسجيلها في الوقت الفعلي ، ويمكن تطبيق العوامل الدوائية بسهولة. يمكن جدولة بروتوكولات التحفيز المحددة من قبل المستخدم وتنفيذها لتقييم معلمات الانكماش الحيوية مثل تقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعتبة التحفيز ، وعلاقة تردد القوة ، وفترة الحراريات. علاوة على ذلك ، يتيح النظام إعدادا متغيرا قبل وبعد الحمل لزراعة أكثر فسيولوجية.

هنا ، نقدم دليلا خطوة بخطوة حول كيفية توليد زراعة ناجحة على المدى الطويل لشرائح عضلة القلب البطينية اليسرى البشرية ، باستخدام حل زراعة محاكاة حيوية تجاري.

Introduction

في العقد الماضي ، حققت زراعة خلايا عضلة القلب في المختبر تقدما كبيرا ، بدءا من تقنيات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد (3D) إلى استخدام المواد العضوية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المتمايزة في الخلايا العضلية القلبية¹،²^،³. وقد أظهرت زراعة الخلايا خارج الجسم الحي والخلايا الأولية أنها ذات قيمة كبيرة ، خاصة بالنسبة للدراسات الجينية وتطوير الأدوية⁴،⁵^،⁶. استخدام الأنسجة البشرية يحسن القيمة الانتقالية للنتائج. زراعة 3D على المدى الطويل من أنسجة عضلة القلب مع الهندسة سليمة، ومع ذلك، ليست راسخة بشكل جيد. الهندسة السليمة هي ميزة رئيسية لمحاكاة في ظروف الجسم الحي ، حيث أن وظيفة القلب المناسبة ، والتواصل بين الخلايا المختلفة ، وكذلك تفاعلات مصفوفة الخلايا هي شروط أساسية. مرت زراعة أنسجة عضلة القلب بمراحل مختلفة من التطور. كان معدل نجاح واستقرار زراعة أنسجة عضلة القلب خارج الجسم الحي منخفضا جدا في البداية ، لكن الأساليب الحديثة أسفرت عن نتائج واعدة⁷،⁸،⁹^،¹⁰^،¹¹.

من بين هؤلاء ، كان فيشر وآخرون أول من أثبت أن الجدوى والأداء الانقباضي لأنسجة عضلة القلب البشرية يمكن الحفاظ عليها في زراعة الخلايا خارج الجسم الحي لعدة أسابيع⁷. استندت تقنيتهم إلى شرائح الأنسجة الرقيقة المقطوعة من عضلة القلب البشرية المزروعة ، والتي تم تركيبها في غرف زراعة مطورة حديثا توفر ظروفا ميكانيكية حيوية محددة وتحفيزا كهربائيا مستمرا. تشبه طريقة الزراعة هذه إلى حد كبير وظيفة أنسجة عضلة القلب في الجسم الحي ، وقد تم استنساخها من قبل العديد من مجموعات البحث المستقلة²،^12،13^،¹⁴^،¹⁵. والأهم من ذلك، أن الغرف التي استخدمها فيشر وآخرون مكنت أيضا من التسجيل المستمر للقوى المتقدمة لمدة تصل إلى 4 أشهر، وبالتالي فتحت فرصا غير مسبوقة للبحوث الفسيولوجية والدوائية على عضلة القلب البشرية 7 السليمة^.

تم تطوير تقنيات مماثلة بشكل مستقل من قبل مجموعات أخرى وتطبيقها على عضلة القلب البشرية والفئران والخنازير والأرانب⁷،¹⁰^،¹¹. طور بيتوليس وآخرون لاحقا طريقة أكثر فسيولوجية ، والتي تعيد إنتاج العلاقة الطبيعية بين القوة والطول خلال دورة الانكماش ، ولكنها أقل ملاءمة للتحليل عالي الإنتاجية¹⁶. على هذا النحو ، يمكن اعتبار النهج العام للزراعة المحاكاة الحيوية خطوة أخرى في الحد من التجارب على الحيوانات وصقلها واستبدالها (3R).

ومع ذلك، فإن استغلال هذه الإمكانات يتطلب إجراءات موحدة، وتحليلات عالية المحتوى، ومستوى إنتاجية مرتفعا. نحن نقدم تقنية تجمع بين التقطيع الآلي لعضلة القلب البشرية الحية مع الصيانة في المختبر في نظام زراعة المحاكاة الحيوية الذي أصبح متاحا تجاريا (انظر جدول المواد). مع النهج المقترح ، فإن عدد الشرائح الفردية التي يمكن إنشاؤها من عينة عضلة القلب عبر الجدارية واحد محدود فقط بوقت المعالجة. غالبا ما تنتج عينة ذات حجم وجودة كافيين (3 سم × 3 سم) 20-40 شريحة أنسجة يتم قطعها بسهولة باستخدام اهتزاز آلي. يمكن وضع هذه الشرائح في غرف الزراعة التابعة للنظام. تسمح الغرف بالتحفيز الكهربائي ، الذي يمكن تعديل معلماته (أي مدة النبض ، والقطبية ، والمعدل ، والتيار) ، بالإضافة إلى ضبط الحمل المسبق واللاحق ، باستخدام أسلاك زنبركية داخل الغرف. يتم تسجيل تقلص كل شريحة من حركة مغناطيس صغير متصل بسلك زنبركي ويتم عرضه كرسم بياني قابل للتفسير. يمكن تسجيل البيانات في جميع الأوقات وتحليلها باستخدام البرامج المتاحة مجانا. بصرف النظر عن وتيرة خط الأساس الثابتة ، يمكن تنفيذ البروتوكولات المجدولة لتقييم فترة المقاومة للحرارة وظيفيا ، وعتبة التحفيز ، وتقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعلاقة تردد القوة.

هذه الزراعة المحاكاة الحيوية طويلة الأجل لشرائح عضلة القلب المتعددة من قلب فردي تمهد الطريق للبحوث المستقبلية خارج الجسم الحي في كل من الأنسجة البشرية والحيوانية ، وتسهل فحص الآثار الدوائية العلاجية والسامة للقلب في طب القلب والأوعية الدموية. وقد تم تطبيقه بالفعل على مختلف الأساليب التجريبية²،¹²،¹³^،¹⁵. هنا ، نقدم وصفا مفصلا خطوة بخطوة لإعداد الأنسجة البشرية ونقدم حلولا لمشاكل الزراعة التي تواجهها بشكل متكرر.

Protocol

تمت الموافقة على جمع الأنسجة للتجارب الموصوفة هنا من قبل مجالس المراجعة المؤسسية بجامعة ميونيخ وجامعة الرور بوخوم. أجريت الدراسات وفقا لإعلان هلسنكي التوجيهي. أعطى المرضى موافقتهم الخطية المستنيرة قبل جمع الأنسجة.

1. اكتساب الأنسجة

الحصول على الأنسجة البشرية من المرضى الذين يخضعون لزراعة القلب أو جراحة القلب.
قبل شراء الأنسجة ، قم بإعداد 2 لتر من محلول الشلل القلبي (يشار إليه أيضا باسم المخزن المؤقت للتقطيع (الجدول 1)).
بعد الحصول على خزعة البطين الأيسر (LV) بحجم 4 سم × 4 سم ، ضع الأنسجة على الفور (في غضون 5 دقائق بعد الاستئصال) في كوب بلاستيكي معقم للاستخدام مرة واحدة قابل للإغلاق يحتوي على حوالي 70 مل من المخزن المؤقت للتقطيع البارد (4 درجات مئوية). يحفظ عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يسمح مخزن التقطيع العازل المستخدم في هذا البروتوكول بالتخزين البارد (4 درجات مئوية) للأنسجة لمدة تصل إلى 36 ساعة. وهذا يسمح بالنقل البارد للأنسجة من العيادات غير القريبة من المختبر. ومع ذلك ، أثبتت أوقات النقل ≤ 24 ساعة أنها مثالية.

2. تحضير الأغاروز والاهتزاز

تأكد من إعداد غرف زراعة كافية وتعقيمها (الشكل 1A).
1. اغمر الغرف وأقطاب الجرافيت في 1 لتر من محلول الأيزوبروبانول بنسبة 10٪ وحرك بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، انقل الغرف إلى محلول إيزوبروبانول 100٪ لمدة 3 دقائق وأوتوكلاف أقطاب الجرافيت عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. دع الغرف وأقطاب الجرافيت تجف في الهواء تحت غطاء التدفق الرقائقي.
3. قم بإرفاق لوحة دوائر كهربائية بكل غرفة من الغرف وفقا للمواضع المتاحة على الروك . ضع قطبين كهربائيين من الجرافيت على لوحة الدوائر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. ضع غطاء طبق بتري 35 مم أعلى الغرفة لمنع التلوث.
قم بإعداد نظام زراعة Myodish (انظر جدول المواد) في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ عن طريق توصيل النظام بجهاز كمبيوتر (الشكل 1B).
تحضير الأغاروز منخفض الذوبان بنسبة 4٪ في مخزن التقطيع المؤقت (بدون الجلوكوز ؛ الجدول 2). يمكن تخزين الأغاروز في 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر.
1. في يوم التجربة ، قم بإذابة حجم مخزون من محلول الأغاروز باستخدام حمام مائي محدد عند 80 درجة مئوية. اعتمادا على الكمية ، يستغرق الذوبان حوالي 30 دقيقة.
2. عندما يكون الأغاروز سائلا ، اسحب 8 مل من الأغاروز السائل في حقنة 10 مل ، مع 2 مل إضافية من الهواء. أغلق المحقنة بغطاء معقم وضعها رأسا على عقب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، لمنع الأغاروز من التصلب ، ولموازنة درجة حرارته لمنع تلف ارتفاع الحرارة للعينة.
إذا كان موجودا، فقم بتشغيل جهاز تبريد المياه الخاص بالاهتزاز قبل 30 دقيقة على الأقل من تقطيع الأنسجة للسماح بسعة تبريد كافية. اضبط درجة حرارة دوران الماء على 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يحتوي كل من درج القطع ولوحة التبريد المستخدمة هنا على دوران مياه مدمج. يوصى بشدة بهذا للتبريد وتقليل مخاطر التلوث. ومع ذلك ، من الممكن أيضا استخدام الثلج كتقنية تبريد. أيضا ، لا يحتاج جهاز تبريد المياه إلى توصيله بصينية القطع و / أو لوحة التبريد الخاصة بالاهتزاز في هذه المرحلة من البروتوكول.
نظف صينية التقطيع الاهتزازية ولوحة العينات عن طريق تنظيف جميع الأسطح باستخدام الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق على الأقل.
ملاحظة: اعتمادا على نظام الاهتزاز المستخدم، قد يختلف إعداد الاهتزاز. ارجع إلى دليل الاهتزاز الموجود في المختبر للحصول على معلومات حول طرق الإعداد ومعايرة الشفرات.
املأ درج القطع بنسبة تصل إلى 90٪ -95٪ باستخدام مخزن التقطيع المؤقت. في الإعداد المستخدم حاليا ، يتوافق هذا مع حوالي 400 مل. قم بتوصيل أنابيب جهاز تبريد المياه بالصمامات الموجودة على صينية القطع ولوحة التبريد في الاهتزاز.
قم بتطهير جميع الأدوات اللازمة للتحضير عن طريق غمرها في محلول أيزوبروبانول 100٪ لمدة 5 ثوان. قم بإزالة الأدوات من محلول الأيزوبروبانول وجففها في الهواء تحت غطاء التدفق الرقائقي.

3. تقليم وتضمين العينات

انقل عينة الأنسجة إلى طبق بتري 100 مم مملوء بمخزن مؤقت للتقطيع البارد. احتفظ بالطبق على طبق تبريد عند 4 درجات مئوية (متصل بالمبرد أو يوضع على الجليد).
إزالة ترابيكول الشغاف عن طريق عقد الشغاف مع ملاقط واستخدام مقص لقطع ما يقرب من 3 ملم من أنسجة الشغاف. بنفس الطريقة ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية الزائدة تحت epicardium إذا كانت موجودة.
ثبت عينة الأنسجة المقطوعة ، جانب الشغاف لأعلى ، على رقعة مطاطية 2 سم × 2 سم باستخدام أربع إبر 0.9 مم × 70 مم 20 جم مثبتة في وضع مربع (0.9 سم × 0.9 سم ؛ الشكل 1 جيم، د). تأكد من أن الحافة القطرية لكل طرف إبرة تشير إلى الداخل. هذا يعزز التثبيت ويمنع تلف عضلة القلب.
تنبيه: يجب أن يكون اتجاه المربع المذكور أعلاه متعامدا مع اتجاه الألياف العضلية السائد المتوقع.
قطع جميع الأنسجة الزائدة خارج مربع الإبرة الأربعة باستخدام مشرط. إذا سمح حجم العينة الأصلية ، استخدم عينتين من أنسجة عضلة القلب أثناء هذا التحضير من نفس العينة الخام.
باستخدام الملقط، ضع العينة المشذبة على قطعة معقمة من الأنسجة لإزالة أي مخزن مؤقت للتقطيع الزائد المتبقي على العينة. لمنع جفاف العينة، لا تحتفظ بالعينة على الأنسجة لمدة تزيد عن 10 ثوان.
ضع العينة (العينات) في طبق بتري 35 مم ، بحيث تقطع الشفرة عموديا على محاذاة الخلايا العضلية القلبية ويتجه العضلة إلى الأسفل. إذا كان المستحضر يتضمن عينتين، فتأكد من توسيط العينات وعدم لمس بعضها البعض.
خذ حقنة الأغاروز من الحمام المائي واغمر العينة (العينات) في الأغاروز. (الشكل 2 ألف). اترك الأغاروز يتصلب لمدة 5 دقائق على طبق تبريد. يجب أن تبقى العينة (العينات) على اتصال مع طبق بتري ، مما يضمن أن تكون طائرة القطع موازية لاتجاه ألياف عضلة القلب السائد.
تنبيه: لا تفرغ المحقنة بالكامل، لمنع فقاعات الهواء. انتبه إلى كمية الأغاروز التي تترك في المحقنة أثناء غمر العينات. في حالة وجود فقاعات هواء في الطبق مع العينات ، اسحب فقاعات الهواء بعناية إلى المحقنة.

4. وضع العينات على صينية القطع

قم بإزالة الأغاروز الصلب الذي يحتوي على العينة (العينات) من طبق بتري 35 مم باستخدام ملعقة أو أداة مماثلة ، عن طريق ربطه بين العينة وجانب طبق بتري. قطع بعض الأغاروز باستخدام مشرط مع الحفاظ على العينات مغطاة.
تنبيه: لا تقم بإزالة الكثير من الأغارو. يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن 5 مم من الأغاروز على الجانبين الطويل والقصير في طائرة X / Z.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 4.2-4.4 في تتابع سريع (أي بحد أقصى 5 ثوان). احصل على جميع الأدوات المطلوبة في متناول اليد قبل البدء. لا يمكن تغيير موضع العينة بعد وضعها. حاول الحد من تعرض الغراء للهواء والرطوبة. سيؤدي التلامس مع الهواء أو السوائل إلى تصلب الغراء ، مما يجعله غير قابل للاستخدام.
باستخدام ماصة ، ضع ووزع 60 ميكرولتر من الغراء داخل وحول وسط منصة القطع.
ضع الجانب الفوقي من العينة الموجودة في الأغاروز فوق المنطقة الملصقة باستخدام ملاقط. لا تقم بتغيير الموضع. يجب أن يكون الجانب الشغافي من العينة مرئيا في الأغارو. دع الغراء يتصلب لمدة 1 دقيقة. اضغط برفق على الأغاروز الذي يحتوي على العينة من الأعلى باستخدام أداة حادة (على سبيل المثال، ملاقط) مع منع قطع الأغاروز أو إتلافه.
ضع منصة العينة في موضعها المحدد في درج القطع الخاص بالاهتزاز ، المليء بمخزن مؤقت للتقطيع.

5. بدء الاهتزاز

اضبط سعة الاهتزاز على 1 مم وسرعة القطع الأولية على 0.07 مم/ثانية. اضبط سمك الشريحة على 300 ميكرومتر لقطع الشرائح.
طالما أن الشفرة تقطع الأغاروز فقط ، فقم بزيادة سرعة القطع إلى أقصى حد لها ، والتي تبلغ في هذه الحالة 1.50 مم / ثانية. بمجرد أن يبدأ الاهتزاز في قطع الأنسجة ، قلل السرعة إلى 0.07 مم / ثانية على الفور.
ملاحظة: إذا لم يتم تقطيع الأنسجة بسلاسة، على سبيل المثال إذا كانت هناك مناطق ليفية كبيرة في العينة، فقد يساعد ذلك على زيادة سعة القطع حتى 1.5 مم وتقليل سرعة القطع إلى 0.04 مم/ثانية.

6. إعداد المتوسطة والحاضنة أثناء إجراء التقطيع

املأ كل غرفة زراعة ب 2.4 مل من وسط الزراعة الكامل (الجدول 3).
ضع غرف الزراعة المملوءة بالوسط على نظام الزراعة في الحاضنة المحددة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO 2 ، و 21٪ O₂ ، ورطوبة 80٪. قم بموازنة الوسط لمدة 20 دقيقة على الأقل.
قم بتوصيل نظام الزراعة بجهاز كمبيوتر وابدأ تشغيل البرنامج المقابل.
اضبط سرعة الروك على 60 دورة في الدقيقة واضبط مسبقا معلمات التحفيز (نبضات التحفيز والتردد). بالنسبة لشرائح القلب البشرية ، اضبط التحفيز القياسي على نبضات ثنائية الطور مع تيار 50 مللي أمبير ، يتكون كل منها من تيار موجب 3 مللي ثانية ، وتوقف مؤقت 1 مللي ثانية ونبضة 3 مللي ثانية من التيار المقلوب ، بمعدل سرعة 30 نبضة في الدقيقة (BPM).
ملاحظة: في الأنسجة المحفوظة جيدا ، تبلغ عتبة التحفيز النموذجية حوالي 15 مللي أمبير. لضمان التحفيز الموثوق به ولحساب أي زيادة محتملة في عتبة التحفيز ، يوصى بتعيين التيار إلى قيمة تتجاوز عتبة التحفيز بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف.
تحقق من مؤشرات القطب الكهربائي للبرنامج للتحقق من أن أقطاب غرف الزراعة تعمل بشكل صحيح.
ملاحظة: يلزم اتخاذ إجراء كلما تحول مؤشر القناة في برنامج الزراعة إلى اللون الأحمر. في هذه الحالة ، لا تكون شحنات النبض ثنائي القطب متوازنة.

7. تحضير الشرائح

ملاحظة: عادة ما تكون شرائح الشغاف الأولية غير مناسبة لزراعة الأنسجة ويجب التخلص منها بسبب التشكل غير المتساوي. بعد أول خمس إلى 10 شرائح ، يتحسن نسيج الشريحة ومورفولوجيا. الشريحة المثالية هي 1 سم × 1 سم على الأقل ، ولا تحتوي على بقع ليفية أو محدودة فقط ، وليست مجزأة ، ولها محاذاة ألياف متجانسة (الشكل 2B ، D). غالبا ما يكون التليف الخلالي ، الموجود بين ألياف الخلايا العضلية ، موجودا في فشل عضلة القلب البشرية. والمثير للدهشة أن هذا ليس مؤشرا سلبيا على نجاح الزراعة.

صب كمية كافية من عازل التقطيع البارد في غطاء طبق بتري بطول 5 سم لضمان عدم جفاف الشرائح. ضع الشرائح في غطاء طبق بتري الذي يحتوي على مخزن التقطيع البارد.
افصل الأغاروز عن الأنسجة باستخدام ملاقط. منع لمس الأنسجة. تعامل مع الأنسجة بعناية لأن أي ضرر يلحق بالأنسجة سيقلل من معدل نجاح الزراعة.
تحديد اتجاه ألياف عضلة القلب عن طريق الفحص الدقيق ضد مصدر الضوء. هذا أمر مهم عند ربط المثلثات البلاستيكية بالأنسجة في الخطوة 7.6.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 7.4 و7.5 في تتابع سريع، في غضون 5 ثوان.
قم بإرفاق مثلثين بلاستيكيين بعينة باستخدام الغراء من أجل تثبيت الأنسجة داخل غرف الزراعة.
1. ضع 1 ميكرولتر من الغراء على غطاء طبق بتري معقم. استخدم ملاقط مدمن مخدرات لالتقاط أحد المثلثات البلاستيكية المعقمة. اغمس الحافة الأمامية للمثلث بسرعة في الغراء والصق المثلث على العينة ، عموديا على محاذاة الخلايا العضلية القلبية. كرر ذلك للمثلث الآخر.
قم بقص الأنسجة التي تتجاوز عرض المثلث باستخدام مشرط (الشكل 2C). ضع الشريحة مع المثلثين المثبتين مرة أخرى في مخزن التقطيع المؤقت الخاص بدرج القطع.
ملاحظة: كرر الخطوات من 7.2 إلى 7.5 حتى يتم إعداد شرائح كافية لملء غرف الزراعة. نوصي بإعداد بعض الشرائح الإضافية للسماح باستبدال الشرائح بتقلص ضعيف.

8. تركيب الشرائح

ملاحظة: يتم تحديد الحمل اللاحق من خلال صلابة سلك الزنبرك في غرف الزراعة. تتوفر ثلاثة أنواع مختلفة ، بناء على سمك سلك الزنبرك.

خذ غرفة زراعة متوسطة الملء من الحاضنة. حدد إحدى الشرائح المعدة وأدخلها في الحجرة عن طريق توصيل مثلث واحد بكل دبوس.
اضبط المسافة بين دبابيس التركيب وفقا لحجم العينة. تأكد من غمر العينة في الوسط. ضع الغرفة مرة أخرى في المقبس المخصص لها لنظام الزراعة في الحاضنة.
تحذير: لا تفرط في تمدد الأنسجة ولا تفرط في ثني سلك النوابض!
اضبط توتر التحميل المسبق بعد وضع الطبق على الهزاز.
1. قلل الحمل المسبق عن طريق تدوير برغي الضبط عكس اتجاه عقارب الساعة. قم بذلك حتى لا يتغير الخط الأساسي للرسم البياني المقابل على شاشة الكمبيوتر بعد الآن.
2. قم بزيادة التحميل المسبق بعناية (أي زيادة التوتر) عن طريق تدوير برغي الضبط في اتجاه عقارب الساعة. بالنسبة للغرف ذات الصلابة الأعلى ، استمر حتى زاد خط الأساس المقابل في الرسم البياني بمقدار 1000-1200 وحدة ، وهو ما يتوافق مع 1 mN من التحميل المسبق.
  ملاحظة: يعتمد التعديل الدقيق على ثابت الزنبرك الفردي لغرفة الزراعة، والذي يمكن تحديده عن طريق المعايرة قبل التجربة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يسمح برنامج التسجيل بالنظر في معايرة الغرفة الفردية بحيث يتم عرض القوى بشكل موحد في μN. يوصى بتطبيق التحفيز الكهربائي من بداية الزراعة. على هذا النحو ، من الممكن أن تبدأ الشريحة في التعاقد أثناء ضبط التحميل المسبق. في هذه الحالة ، ركز على خط الأساس الانبساطي لتقييم الحمل المسبق.

9. تغيير الوسط

تحضير وسط الزراعة وفقا للوصفة في الجدول 3. قبل وقت قصير من استخدام الوسط ، أضف 50 ميكرولتر من β-mercaptoethanol (50 mM) إلى أنبوب 50 mL. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
مرة واحدة كل 2 أيام ، تبادل جزئيا وسط الزراعة. تحديث الوسط كل 2 أيام ، إذا كان من المرغوب فيه زراعة شرائح عضلة القلب على المدى الطويل.
قم بتسخين الوسط الطازج مسبقا في حمام مائي أو حاضنة الهواء الساخن على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة. قم بإزالة غرفة زراعة من الحاضنة وضعها تحت غطاء تدفق صفائحي.
تحذير: من الضروري الحفاظ على الغرفة ، وكذلك الوسط ، دافئا عند 37 درجة مئوية (> 35 درجة مئوية) لمنع التقلصات المفرطة بسبب انخفاض درجة الحرارة. قد يكون الضرر الأقل وضوحا موجودا كزيادة في التوتر الانبساطي في غضون ساعات قليلة بعد التبادل المتوسط. قد يبدو أن هذا يتعافى ، لكن الإجهاد المتكرر قد يؤدي إلى تراكم التدهور.
قم بإزالة الوسط من غرفة الزراعة ، مع ترك حوالي 0.8 مل في الغرفة. أضف 1.6 مل من الوسط الطازج إلى نفس الغرفة. يجب أن يكون الحجم الإجمالي للوسط حوالي 2.4 مل لكل غرفة.
ضع غطاء الغرفة مرة أخرى وضع غرفة الزراعة مرة أخرى في موضعها الخاص.

النتائج

تم عرض تقلص شرائح عضلة القلب على شاشة الكمبيوتر بعد إدخال غرفة الزراعة في الموصل المقابل لها (الشكل 3). بدأ تقلص شرائح عضلة القلب البشرية فور التحفيز. تقلصت الشرائح لمدة 5-10 دقائق. كان هذا مرئيا كزيادة في القوى الانبساطية ، الناجمة عن تقلص منشط لكسور الأنسجة التالفة. تم إرجاع ...

Discussion

في الماضي ، حققت أبحاث القلب والأوعية الدموية تقدما كبيرا في زراعة الخلايا العضلية القلبية. ومع ذلك ، فإن زراعة 3D من الخلايا العضلية القلبية مع الهندسة السليمة ليست راسخة بعد. بالمقارنة مع البروتوكولات السابقة المطبقة على زراعة أنسجة عضلة القلب خارج الجسم الحي ، فإن البروتوكول الذي ?...

Disclosures

JH ، PS ، DM ، و KL ليس لديهم ما يكشفون عنه. AD و TS مساهمان في InVitroSys GmbH ، التي توفر نظام زراعة Myodish.

Acknowledgements

تم تمويل البحث من خلال منح DZHK 81Z0600207 (JH و PS و DM) و 81X2600253 (AD و TS).

يود المؤلفون أن يشكروا كلوديا فاهني ومي بينغ وو وماتياس سيميش على دعمهم في إعداد الإعدادات، وكذلك على الصيانة المنتظمة لزراعة الأنسجة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish bioreactor system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070

References

George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
Esfandyari, D. A. -. O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article