长期培养用人心肌组织的制备

摘要

我们提出了一种人心室心肌组织 离体 培养的方案。它允许对收缩力和动力学进行详细分析，以及应用前负荷和后负荷来更密切地模拟 体内 生理环境。

摘要

心肌细胞培养已经经历了大量的发展，从二维（2D）细胞培养到iPSC衍生的类器官。2019年，展示了一种从人体心脏样本中获得的离 体 培养心肌切片的方法，同时接近心肌收缩的 体内 状态。这些样本主要来自心脏移植或左心室辅助装置放置。使用振动切片机和专门开发的培养系统，在固定线和弹簧线之间放置300μm厚的切片，允许稳定和可重复的培养数周。在栽培过程中，切片根据个体设置不断受到刺激。可以实时显示和记录收缩，并且可以很容易地应用药理学药物。可以安排和执行用户定义的刺激方案，以评估重要的收缩参数，如暂停后增强、刺激阈值、力-频率关系和不应期。此外，该系统可实现可变的前负荷和后负荷设置，以实现更生理的培养。

在这里，我们提出了一个分步指南，介绍如何使用商业仿生培养解决方案成功长期培养人类左心室心肌切片。

引言

在过去的十年中，心肌细胞的体外培养取得了很大的进步，从2D和三维（3D）技术到使用类器官和诱导多能干细胞分化成心肌细胞^1，2，3。离体和原代细胞培养已被证明具有重要价值，特别是对于遗传研究和药物开发^4，5，6。使用人体组织可提高结果的转化价值。然而，具有完整几何形状的心肌组织的长期3D培养尚未得到很好的证实。完整的几何形状是模拟体内条件的关键特征，因为适当的心脏功能，不同细胞之间的通信以及细胞 - 基质相互作用是先决条件。心肌组织培养经历了不同的发展阶段。离体心肌组织培养的成功率和稳定性最初相当低，但最近的方法已经产生了有希望的结果^7，8，^9，10，11。

其中，Fischer等人是第一个证明人心肌组织的活力和收缩性能可以在离体细胞培养中维持数周⁷的人。他们的技术基于从外植的人类心肌中切割的薄组织切片，这些切片被安装在新开发的培养室中，提供明确的生物力学条件和连续的电刺激。这种培养方法与心肌组织的体内功能非常相似，并且已被几个独立的研究小组^{2，12，13，14，15}重现。重要的是，Fischer等人使用的腔室还使已发展的力量连续注册长达4个月，从而为完整人类心肌⁷的生理和药理学研究开辟了前所未有的机会。

其他研究小组独立开发了类似的技术，并应用于人，大鼠，猪和兔心肌^7，10，11。Pitoulis等人随后开发了一种更生理的方法，该方法在收缩周期中再现了正常的力-长度关系，但不太适合于高通量分析¹⁶。因此，仿生培养的一般方法可以被视为动物实验的还原，精炼和替换（3R）的又一步。

然而，利用这种潜力需要标准化的程序、高含量分析和高通量水平。我们提出了一种技术，该技术将活体心肌的自动切片与 体外 维护相结合，在已经商业化的仿生培养系统中（见 材料表）。使用所提出的方法，可以从单个透壁心肌标本中生成的单个切片的数量仅受处理时间的限制。具有足够大小和质量（3 cm x 3 cm）的标本通常产生20-40个组织切片，使用自动振动切片机可以方便地切割。这些切片可以放置在属于系统的培养室中。腔室允许电刺激，其参数可以调制（即脉冲持续时间，极性，速率和电流），以及使用腔室内的弹簧线调整前负和后载荷。每个切片的收缩由附着在弹簧线上的小磁铁的运动记录下来，并显示为可解释的图形。数据可以随时记录，并使用免费提供的软件进行分析。除了恒定的基线起搏外，还可以执行预定的方案，以功能评估其不应期，刺激阈值，暂停后增强和力 - 频率关系。

这种来自个体心脏的多个心肌切片的长期仿生培养为未来人类和动物组织的 离体 研究铺平了道路，并有助于筛查心血管医学中的治疗和心脏毒性药物作用。它已经应用于各种实验方法^{2，12，13，15}。在这里，我们对人体组织的制备进行了详细的分步描述，并为经常遇到的栽培问题提供了解决方案。

研究方案

这里描述的实验的组织收集得到了慕尼黑大学机构和波鸿鲁尔大学的机构审查委员会的批准。研究是根据《赫尔辛基宣言》指南进行的。患者在组织采集前给予书面知情同意。

1. 组织获取

1. 从接受心脏移植或心脏手术的患者身上获取人体组织。
2. 在获取组织之前，准备2L心肌停搏溶液（进一步称为切片缓冲液（表1））。
3. 在获得4cm x 4cm大小的透壁左心室（LV）活检后，立即（切除后5分钟内）将组织置于含有约70mL冷（4°C）切片缓冲液的可封闭塑料一次性无菌烧杯中。保持在4°C。
   注意:该协议中使用的切片缓冲液允许对组织进行冷存储（4°C）长达36小时。这允许从不靠近实验室的诊所冷运输组织。然而，24小时≤运输时间已被证明是最佳的。

2. 准备琼脂糖和振动筛

1. 确保准备足够的培养室并进行灭菌（图1A）。
   1. 将腔室和石墨电极浸没在1L的10%异丙醇溶液中并搅拌过夜。第二天，将腔室转移到100%异丙醇溶液中3分钟，并在120°C下高压灭菌石墨电极10分钟。
   2. 让腔室和石墨电极在层流罩下风干。
   3. 根据摇臂上的可用位置将电路板连接到每个腔室。按照制造商的说明将两个石墨电极放在电路板上。
   4. 将35毫米培养皿盖放在腔室顶部以防止污染。
2. 通过将系统连接到计算机，在37°C和5%CO₂的培养箱中设置Myodish培养系统（参见材料表）（图1B）。
3. 在切片缓冲液中制备4%低熔点琼脂糖（无葡萄糖; 表 2）。琼脂糖可以在4°C下储存6个月。
   1. 在实验当天，使用设置为80°C的水浴熔化储备体积的琼脂糖溶液。 根据数量，熔化大约需要30分钟。
   2. 当琼脂糖为液体时，将8 mL液体琼脂糖吸入10 mL注射器中，再吸入2 mL空气。用无菌帽关闭注射器，并将其倒置在37°C水浴中20分钟，以防止琼脂糖凝固，并平衡其温度以防止样品的热疗损伤。
4. 如果存在，请在组织切片前至少30分钟打开振动切片仪的水冷却装置，以允许足够的冷却能力。将水循环温度设置为4°C。
   注意:这里使用的切割盘和冷却板都包含内置的水循环。强烈建议将其用于冷却并降低污染风险。然而，也可以使用冰作为冷却技术。此外，在实验方案的此时，水冷装置不需要连接到振动筛的切割托盘和/或冷却板。
5. 通过用100%异丙醇冲洗所有表面至少3分钟来清洁振动切片托盘和样品板。
   注意:根据所使用的振动筛系统，振动筛的设置可能会有所不同。有关设置和叶片校准方法的信息，请参阅实验室中的振动传感器手册。
6. 用切片缓冲液填充切割托盘，最高可达90%-95%。在目前使用的设置中，这相当于大约400 mL。将水冷装置的管子连接到振动仪切割盘和冷却板上的阀门上。
7. 通过将制备所需的所有工具浸没在100%异丙醇溶液中5秒来消毒。从异丙醇溶液中取出工具，在层流罩下风干。

3. 修剪和嵌入样本

1. 将组织样品转移到充满冷切片缓冲液的100mm培养皿中。将培养皿保持在4°C的冷却板上（连接到冷却器或放在冰上）。
2. 用镊子握住心内膜，用剪刀切除约3毫米的心内膜组织，切除心内膜小梁。以同样的方式，去除外包下方的过量脂肪组织（如果存在）。
3. 使用四个0.9 mm x 70 mm 20 G针将切开的组织样品（心内膜一面朝上）固定在2 cm x 2 cm橡胶贴片上，这些针固定在正方形位置（0.9 cm x 0.9 cm; 图 1C、D）。确保每个针尖的对角线边缘指向内部。这增强了固定并防止心肌损伤。
   注意:上述正方形的方向应与预期的主要肌纤维方向正交。
4. 用手术刀切掉四针方块外的所有多余组织。如果原始样品的大小允许，则在从同一原始样品制备过程中使用两个心肌组织样品。
5. 使用镊子，将修剪后的样品放在无菌的组织上，以除去样品上残留的任何多余的切片缓冲液。为防止样品干燥，请勿将样品放在纸巾上超过10秒。
6. 将样品置于35mm培养皿中，使得刀片垂直于心肌细胞排列切开并且外包朝下。如果制剂包括两个样品，请确保样品居中并且不要相互接触。
7. 从水浴中取出琼脂糖注射器，将样品浸没在琼脂糖中。（图 2A）。让琼脂糖在冷却板上固化5分钟。样品必须与培养皿保持接触，这将确保切割平面平行于主要的心肌纤维方向。
   注意:不要完全排空注射器，以防止气泡。注意样品浸没期间注射器中残留的琼脂糖的量。在样品皿中出现气泡的情况下，小心地将气泡拉回注射器中。

4. 将样品放在切割托盘上

1. 使用刮刀或类似工具从35mm培养皿中取出含有样品的固化琼脂糖，将其楔入样品和培养皿的侧面之间。使用手术刀切掉一些琼脂糖，同时保持样品覆盖。
   注意:不要去除过多的琼脂糖。在X / Z平面的长边和短边上应该至少留下5毫米琼脂糖。
   注意:步骤 4.2-4.4 需要快速连续执行（即最多 5 秒）。在开始之前，所有必需的工具都触手可及。放置后无法重新定位样品。尽量限制胶水暴露在空气和湿气中。与空气或流体接触会使胶水凝固，使其无法使用。
2. 用移液管将60μL胶水放入切割平台中心及其周围。
3. 使用镊子将琼脂糖中所含样品的外周侧放在粘合区域的顶部。不要重新定位。样本的心内膜侧必须在琼脂糖中可见。让胶水凝固1分钟。用钝器（例如镊子）从顶部轻轻按压含有样品的琼脂糖，同时防止切割或损坏琼脂糖。
4. 将样品平台放在振动切片机切割托盘的指定位置，并填充切片缓冲液。

5. 启动振动筛

1. 将振动幅度设置为 1 mm，将初始切割速度设置为 0.07 mm/s。将切片的厚度设置为300μm以切割切片。
2. 只要刀片只切割琼脂糖，就要将切割速度提高到最大值，在这种情况下为1.50 mm/s。一旦振动切片机开始切割组织，立即将速度降低到0.07 mm / s。
   注意:如果组织切片不光滑，例如，如果样品中有较大的纤维化区域，则可能有助于将切割幅度增加到1.5 mm并将切割速度降低到0.04 mm / s。

6. 切片过程中的培养基和培养箱制备

1. 在每个培养室中填充2.4 mL完全培养基（表3）。
2. 将培养基中装满培养基的培养箱置于培养箱中，培养箱设置为37°C，5%CO₂，21%O₂和湿度为80%。使培养基平衡至少20分钟。
3. 将栽培系统与计算机连接，然后启动相应的软件程序。
4. 将摇臂速度设置为60 rpm，并预设刺激参数（刺激脉冲和频率）。对于人体心脏切片，将标准刺激设置为双相脉冲，电流为50 mA，每个脉冲由3 ms正电流，1 ms暂停和3 ms反向电流脉冲组成，起搏率为每分钟30次（BPM）。
   注意:在保存完好的组织中，典型的刺激阈值约为15 mA。为了确保可靠的刺激并考虑刺激阈值的任何可能增加，建议将电流设置为超过刺激阈值两到三倍的值。
5. 检查软件的电极指示器，以验证培养室的电极是否正常工作。
   注:每当栽培软件中的通道指示器变为红色时，都需要执行操作。在这种情况下，双极性脉冲电荷不平衡。

7. 准备切片

注意:初始心内膜下切片通常不适合组织培养，由于形态不均匀，需要丢弃。在前5到10片后，切片的质地和形态得到改善。理想的切片至少为1 cm x 1 cm，没有或只有有限的纤维化贴片，不破碎，并且具有均匀的纤维对准（图2B，D）。间质纤维化位于肌细胞纤维之间，常出现在衰竭的人心肌中。令人惊讶的是，这并不是修炼成功的负面预测因素。

1. 将适量的冷切片缓冲液倒入5厘米培养皿盖中，以确保切片不会变干。将切片放入含有冷切片缓冲液的培养皿盖中。
2. 使用镊子将琼脂糖与组织分离。防止触摸组织。小心处理组织，因为对组织的任何损坏都会降低培养的成功率。
3. 通过对光源的仔细检查来确定心肌纤维的方向。在步骤7.6中将塑料三角形附着到组织上时，这一点很重要。
   注意:步骤 7.4 和 7.5 需要在 5 秒内快速连续执行。
4. 使用胶水将两个塑料三角形连接到样品上，以便将组织固定在培养室内。
   1. 将1μL胶水放在无菌培养皿盖上。使用钩式镊子捡起其中一个高压灭菌的塑料三角形。快速将三角形的前边缘浸入胶水中，并将三角形粘贴到样品上，垂直于心肌细胞对准。对另一个三角形重复上述步骤。
5. 用手术刀修剪掉超过三角形宽度的组织（图2C）。将带有两个已安装三角形的切片放回切割盘的切片缓冲区中。
   注意:重复步骤7.2至7.5，直到准备足够的切片来填充培养室。我们建议准备一些额外的切片，以替换收缩不良的切片。

8. 安装切片

注意:余载荷由培养室中弹簧钢丝的刚度决定。根据弹簧钢丝的厚度，有三种不同的类型可供选择。

1. 从培养箱中取一个充满培养基的培养室。选择一个准备好的切片，并通过将一个三角形连接到每个引脚将其插入腔室中。
2. 根据样品大小调整安装销之间的距离。确保样品浸没在介质中。将培养箱中的腔室放回培养系统的指定插座中。
   注意:不要过度拉伸组织，也不要过度弯曲弹簧线！
3. 将培养皿放在摇臂上后，设置预紧力。
   1. 通过逆时针旋转调节螺钉来降低预载荷。执行此操作，直到计算机屏幕上相应图形的基线不再更改。
   2. 通过顺时针转动调节螺钉，小心地增加预载荷（即增加张力）。对于刚度最高的腔室，继续操作，直到图中相应的基线增加了1000-1200个单位，对应于1 mN的预载荷。
      注意:确切的调整将取决于培养室的单个弹簧常数，这可以通过在实验前根据制造商的说明进行校准来确定。记录软件允许考虑单个腔室校准，以便力以μN均匀显示。建议从栽培开始就应用电刺激。因此，切片很可能在预紧力调整期间开始收缩。在这种情况下，应关注舒张基线以评估预负荷。

9. 更改介质

1. 根据 表3中的配方制备培养基。在使用培养基前不久，向50μL管中加入50μL β-巯基乙醇（50mM）。储存在4°C。
2. 每2天一次，部分更换培养基。如果需要长期培养心肌切片，每2天刷新一次培养基。
3. 在37°C的水浴或热风培养箱中预热新鲜培养基30-45分钟。从培养箱中取出培养室，并将其置于层流罩下。
   注意:必须将腔室以及介质保持在37°C（>35°C）的温度，以防止由于低温引起的过度挛缩。不太明显的损伤可能表现为中度置换后数小时内舒张张力增加。这似乎可以恢复，但反复的压力可能会导致累积恶化。
4. 从培养室中取出培养基，在培养室内留下约0.8 mL。将1.6 mL新鲜培养基加入同一腔室。培养基的总体积应约为每腔室2.4 mL。
5. 将腔室的盖子放回原处，然后将培养室放回其各自的位置。

结果

将培养室插入其相应的连接器后，心肌切片的收缩显示在计算机屏幕上（图3）。人体心肌切片的收缩在刺激后立即开始。切片超收缩5-10分钟。这可见于舒张力的增加，由受损组织部分的强直挛缩引起。该过程在1-1.5小时内不同程度地恢复。稳定后，人左心室组织切片在刺激时显示出1 mN至3 mN之间的抽搐力变化。收缩期显示为收缩力的强烈增加，随后是舒张，收缩力同样急剧?...

讨论

过去，心血管研究在心肌细胞的培养方面取得了很大进展。然而，具有完整几何形状的心肌细胞的3D培养尚未得到很好的证实。与以前用于心肌组织 离体 培养的方案相比，我们在这里描述的方案更接近 于组织的体内 环境。此外，预载和后负荷的应用允许更仿生的环境。我们能够充分分析和理解组织的收缩数据和收缩参数的连续记录。

使用类似设置的 离体

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish bioreactor system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070