Preparazione del tessuto miocardico umano per la coltivazione a lungo termine

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico ventricolare umano. Consente un'analisi dettagliata della forza di contrazione e della cinetica, nonché l'applicazione di pre- e postcarico per imitare più da vicino l'ambiente fisiologico in vivo .

Abstract

La coltivazione di cardiomiociti ha visto un vasto numero di sviluppi, che vanno dalla coltivazione cellulare bidimensionale (2D) agli organoidi derivati da iPSC. Nel 2019 è stato dimostrato un modo ex vivo per coltivare fette di miocardio ottenute da campioni di cuore umano, mentre si avvicinava alla condizione in vivo di contrazione miocardica. Questi campioni provengono principalmente da trapianti di cuore o posizionamenti di dispositivi di assistenza ventricolare sinistra. Utilizzando un vibratoma e un sistema di coltivazione appositamente sviluppato, fette spesse 300 μm vengono posizionate tra un filo fisso e uno a molla, consentendo una coltivazione stabile e riproducibile per diverse settimane. Durante la coltivazione, le fette vengono continuamente stimolate in base alle singole impostazioni. Le contrazioni possono essere visualizzate e registrate in tempo reale e gli agenti farmacologici possono essere prontamente applicati. I protocolli di stimolazione definiti dall'utente possono essere programmati ed eseguiti per valutare i parametri di contrazione vitali come il potenziamento post-pausa, la soglia di stimolazione, la relazione forza-frequenza e il periodo refrattario. Inoltre, il sistema consente un'impostazione variabile pre e postcarico per una coltivazione più fisiologica.

Qui, presentiamo una guida passo-passo su come generare una coltivazione a lungo termine di successo di fette miocardiche ventricolari sinistre umane, utilizzando una soluzione di coltivazione biomimetica commerciale.

Introduzione

Nell'ultimo decennio, la coltivazione in vitro di cellule miocardiche ha fatto grandi progressi, che vanno dalle tecniche 2D e tridimensionali (3D) all'uso di organoidi e cellule staminali pluripotenti indotte differenziate in miociti cardiaci ^1,2,3. Le coltivazioni ex vivo e primarie di cellule hanno dimostrato di essere di grande valore, soprattutto per gli studi genetici e lo sviluppo di farmaci ^4,5,6. L'uso di tessuti umani migliora il valore traslazionale dei risultati. La coltivazione 3D a lungo termine di tessuti miocardici con geometria intatta, tuttavia, non è ben consolidata. La geometria intatta è una caratteristica chiave per imitare le condizioni in vivo, poiché la corretta funzione cardiaca, la comunicazione tra cellule diverse e le interazioni cellula-matrice sono prerequisiti. La coltivazione del tessuto miocardico ha attraversato varie fasi di sviluppo. Il tasso di successo e la stabilità della coltivazione di tessuti miocardici ex vivo erano inizialmente piuttosto bassi, ma gli approcci recenti hanno prodotto risultati promettenti 7,8,9,10,11.

Tra questi, Fischer et al. sono stati i primi a dimostrare che la vitalità e le prestazioni contrattili del tessuto miocardico umano possono essere mantenute nella coltivazione cellulare ex vivo per molte settimane⁷. La loro tecnica si basava su sottili fette di tessuto tagliate dal miocardio umano espiantato, che erano montate in camere di coltivazione di nuova concezione che fornivano condizioni biomeccaniche definite e stimolazione elettrica continua. Questo metodo di coltivazione assomiglia molto alla funzione in vivo del tessuto miocardico ed è stato riprodotto da diversi gruppi di ricerca indipendenti 2,12,13,14,15. È importante sottolineare che le camere utilizzate da Fischer et al. hanno anche permesso la registrazione continua delle forze sviluppate per un massimo di 4 mesi, aprendo così opportunità senza precedenti per la ricerca fisiologica e farmacologica sul miocardio umano intatto⁷.

Tecniche simili sono state sviluppate indipendentemente da altri gruppi e applicate al miocardio umano, di ratto, suino e di coniglio ^7,10,11. Pitoulis et al. hanno successivamente sviluppato un metodo più fisiologico, che riproduce la normale relazione forza-lunghezza durante un ciclo di contrazione, ma è meno adatto per l'analisi ad alto rendimento¹⁶. In quanto tale, l'approccio generale della coltivazione biomimetica può essere considerato come un ulteriore passo verso la riduzione, l'affinamento e la sostituzione (3R) degli esperimenti sugli animali.

Tuttavia, lo sfruttamento di questo potenziale richiede procedure standardizzate, analisi ad alto contenuto e un elevato livello di throughput. Presentiamo una tecnica che combina l'affettamento automatizzato del miocardio umano vivente con il mantenimento in vitro in un sistema di coltivazione biomimetico che è diventato disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Con l'approccio proposto, il numero di singole fette che possono essere generate da un singolo campione miocardico transmurale è limitato solo dal tempo di elaborazione. Un campione di dimensioni e qualità sufficienti (3 cm x 3 cm) produce spesso 20-40 fette di tessuto che vengono comodamente tagliate con un vibratoma automatizzato. Queste fette possono essere collocate in camere di coltivazione appartenenti al sistema. Le camere consentono la stimolazione elettrica, i cui parametri possono essere modulati (cioè durata dell'impulso, polarità, velocità e corrente), nonché la regolazione del pre- e postcarico, utilizzando fili a molla all'interno delle camere. La contrazione di ogni fetta è registrata dal movimento di un piccolo magnete attaccato a un filo a molla e visualizzato come un grafico interpretabile. I dati possono essere registrati in ogni momento e analizzati utilizzando un software disponibile gratuitamente. Oltre alla stimolazione costante al basale, è possibile eseguire protocolli programmati per valutare funzionalmente il loro periodo refrattario, la soglia di stimolazione, il potenziamento post-pausa e la relazione forza-frequenza.

Questa coltivazione biomimetica a lungo termine di più fette miocardiche da un singolo cuore apre la strada a future ricerche ex vivo sia nel tessuto umano che in quello animale e facilita lo screening per gli effetti terapeutici e cardiotossici dei farmaci nella medicina cardiovascolare. È già stato applicato a vari approcci sperimentali 2,12,13,15. Qui, forniamo una descrizione dettagliata passo-passo della preparazione del tessuto umano e forniamo soluzioni per i problemi di coltivazione frequentemente incontrati.

Protocollo

La raccolta di tessuti per gli esperimenti qui descritti è stata approvata dai comitati di revisione istituzionale dell'Università di Monaco e dell'Università della Ruhr di Bochum. Gli studi sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto prima della raccolta dei tessuti.

1. Acquisizione tissutale

1. Ottenere tessuto umano da pazienti sottoposti a trapianto di cuore o cardiochirurgia.
2. Prima di procurare il tessuto, preparare 2 L di soluzione cardioplegica (ulteriormente indicato come tampone di affettamento (Tabella 1)).
3. Dopo aver ottenuto una biopsia ventricolare sinistra transmurale (LV) di dimensioni 4 cm x 4 cm, posizionare immediatamente il tessuto (entro 5 minuti dall'escissione) in un becher sterile monouso di plastica richiudibile contenente circa 70 ml di tampone per affettatura fredda (4 °C). Conservare a 4 °C.
   NOTA: il tampone di affettamento utilizzato in questo protocollo consente la conservazione a freddo (4 °C) del tessuto per un massimo di 36 ore. Ciò consente il trasporto a freddo del tessuto da cliniche che non sono vicine al laboratorio. Tuttavia, i tempi di trasporto ≤ 24 ore si sono dimostrati ottimali.

2. Preparare l'agarosio e il vibratoma

1. Assicurarsi che siano preparate e sterilizzate camere di coltivazione sufficienti (Figura 1A).
   1. Immergere le camere e gli elettrodi di grafite in 1 L di una soluzione di isopropanolo al 10% e agitare durante la notte. Il giorno seguente, trasferire le camere in una soluzione di isopropanolo al 100% per 3 minuti e autoclave gli elettrodi di grafite a 120 °C per 10 minuti.
   2. Lasciare asciugare all'aria le camere e gli elettrodi di grafite sotto una cappa a flusso laminare.
   3. Collegare un circuito stampato a ciascuna delle camere in base alle posizioni disponibili sul bilanciere. Posizionare due elettrodi di grafite sul circuito stampato secondo le istruzioni del produttore.
   4. Posizionare un coperchio della capsula di Petri da 35 mm sulla parte superiore della camera per evitare contaminazioni.
2. Impostare il sistema di coltivazione Myodish (vedi Tabella dei materiali) in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ collegando il sistema a un computer (Figura 1B).
3. Preparare l'agarosio a bassa fusione al 4% in tampone di affettamento (senza glucosio; Tabella 2). L'agarosio può essere conservato a 4 °C per 6 mesi.
   1. Il giorno dell'esperimento, sciogliere un volume di riserva di soluzione di agarosio usando un bagno d'acqua impostato a 80 °C. A seconda della quantità, la fusione richiede circa 30 minuti.
   2. Quando l'agarosio è liquido, aspirare 8 mL di agarosio liquido in una siringa da 10 mL, con ulteriori 2 mL di aria. Chiudere la siringa con un tappo sterile e metterla a testa in giù a bagnomaria a 37 °C per 20 minuti, per evitare che l'agarosio si solidifichi e per equilibrare la sua temperatura per evitare danni da ipertermia del campione.
4. Se presente, accendere il dispositivo di raffreddamento ad acqua del vibratoma almeno 30 minuti prima dell'affettamento dei tessuti per consentire una capacità di raffreddamento sufficiente. Impostare la temperatura della circolazione dell'acqua a 4 °C.
   NOTA: Il vassoio di taglio e la piastra di raffreddamento utilizzati qui contenevano entrambi una circolazione dell'acqua incorporata. Questo è altamente raccomandato per il raffreddamento e per ridurre i rischi di contaminazione. È comunque possibile utilizzare il ghiaccio anche come tecnica di raffreddamento. Inoltre, il dispositivo di raffreddamento ad acqua non deve essere collegato al vassoio di taglio e/o alla piastra di raffreddamento del vibratomo a questo punto del protocollo.
5. Pulire il vassoio di affettatura e la piastra di campionamento del vibratome lavando tutte le superfici con isopropanolo al 100% per almeno 3 minuti.
   NOTA: a seconda del sistema di vibratomi utilizzato, la configurazione del vibratoma potrebbe essere diversa. Fare riferimento al manuale del vibratoma presente in laboratorio per informazioni sui metodi di set-up e calibrazione della lama.
6. Riempire il vassoio di taglio fino al 90% -95% con tampone di affettatura. Nel set-up attualmente utilizzato, questo corrisponde a circa 400 ml. Collegare il tubo del dispositivo di raffreddamento ad acqua alle valvole sul vassoio di taglio e sulla piastra di raffreddamento del vibratoma.
7. Disinfettare tutti gli strumenti necessari per la preparazione immergendoli in una soluzione di isopropanolo al 100% per 5 s. Rimuovere gli utensili dalla soluzione di isopropanolo e asciugarli all'aria sotto la cappa a flusso laminare.

3. Tagliare e incorporare i campioni

1. Trasferire il campione di tessuto in una capsula di Petri da 100 mm riempita con tampone per affettatura a freddo. Tenere la parabola su una piastra di raffreddamento a 4 °C (collegata al refrigeratore o posta sul ghiaccio).
2. Rimuovere le trabecole endocardiche tenendo l'endocardio con una pinzetta e usando le forbici per tagliare via circa 3 mm di tessuto endocardico. Allo stesso modo, rimuovere il tessuto adiposo in eccesso sotto l'epicardio, se presente.
3. Fissare il campione di tessuto tagliato, lato endocardico verso l'alto, a un cerotto di gomma di 2 cm x 2 cm utilizzando quattro aghi da 0,9 mm x 70 mm da 20 G fissati in posizione quadrata (0,9 cm x 0,9 cm; Figura 1C, D). Assicurarsi che il bordo diagonale di ciascuna punta dell'ago sia rivolto verso l'interno. Ciò migliora la fissazione e previene danni al miocardio.
   ATTENZIONE: L'orientamento del quadrato sopra menzionato deve essere ortogonale alla direzione predominante della miofibra prevista.
4. Tagliare via tutto il tessuto in eccesso al di fuori del quadrato a quattro aghi usando un bisturi. Se la dimensione del campione originale lo consente, utilizzare due campioni di tessuti miocardici durante questa preparazione dallo stesso campione grezzo.
5. Usando una pinzetta, posizionare il campione tagliato su un pezzo di tessuto sterile per rimuovere qualsiasi tampone di affettamento in eccesso lasciato sul campione. Per evitare l'essiccazione del campione, non tenere il campione sul tessuto per più di 10 s.
6. Posizionare il campione o i campioni in una capsula di Petri da 35 mm, in modo tale che la lama tagli perpendicolarmente all'allineamento dei cardiomiociti e l'epicardio sia rivolto verso il basso. Se la preparazione include due campioni, assicurarsi che i campioni siano centrati e non si tocchino.
7. Prelevare la siringa di agarosio dal bagno d'acqua e immergere il campione o i campioni in agarosio. (Figura 2A). Lasciare solidificare l'agarosio per 5 minuti su una piastra di raffreddamento. Il campione o i campioni devono rimanere in contatto con la capsula di Petri, il che garantirà che il piano di taglio sia parallelo alla direzione predominante della fibra miocardica.
   ATTENZIONE: Non svuotare completamente la siringa per evitare bolle d'aria. Prestare attenzione alla quantità di agarosio che viene lasciata nella siringa durante l'immersione dei campioni. Nel caso di bolle d'aria nel piatto con i campioni, estrarre con attenzione le bolle d'aria nella siringa.

4. Posizionamento dei campioni sul vassoio di taglio

1. Rimuovere l'agarosio solidificato contenente il campione o i campioni dalla capsula di Petri da 35 mm utilizzando una spatola o uno strumento simile, incastrandolo tra il campione e il lato della capsula di Petri. Tagliare via parte dell'agarosio usando un bisturi mantenendo i campioni coperti.
   ATTENZIONE: Non rimuovere troppo dell'agarosio. Dovrebbero essere rimasti almeno 5 mm di agarosio sui lati lungo e corto nel piano X / Z.
   NOTA: i passaggi 4.2-4.4 devono essere eseguiti in rapida successione (ad esempio, massimo 5 s). Avere tutti gli strumenti necessari a portata di mano prima di iniziare. Nessun riposizionamento del campione è possibile dopo il posizionamento. Cerca di limitare l'esposizione della colla all'aria e all'umidità. Il contatto con aria o fluidi solidificherà la colla, rendendola inutilizzabile.
2. Con una pipetta, posizionare e distribuire 60 μL di colla all'interno e intorno al centro della piattaforma di taglio.
3. Posizionare il lato epicardico del campione contenuto nell'agarosio sopra l'area incollata usando una pinzetta. Non riposizionare. Il lato endocardico del campione deve essere visibile nell'agarosio. Lasciare solidificare la colla per 1 minuto. Premere delicatamente l'agarosio contenente il campione dall'alto con uno strumento smussato (ad esempio, una pinzetta) evitando di tagliare o danneggiare l'agarosio.
4. Posizionare la piattaforma campione nella posizione designata nel vassoio di taglio del vibratoma, riempito con tampone di affettatura.

5. Avvio del vibratoma

1. Impostare l'ampiezza delle vibrazioni a 1 mm e la velocità di taglio iniziale a 0,07 mm/s. Impostare lo spessore della fetta a 300 μm per tagliare le fette.
2. Finché la lama taglia solo l'agarosio, aumentare la velocità di taglio al massimo, che in questo caso è di 1,50 mm/s. Non appena il vibrame inizia a tagliare il tessuto, diminuire immediatamente la velocità a 0,07 mm/s.
   NOTA: Se il tessuto non viene affettato senza intoppi, ad esempio se nel campione sono presenti grandi aree fibrotiche, può essere utile aumentare l'ampiezza di taglio fino a 1,5 mm e ridurre la velocità di taglio a 0,04 mm/s.

6. Preparazione del mezzo e dell'incubatrice durante la procedura di affettatura

1. Riempire ogni camera di coltivazione con 2,4 ml di terreno di coltivazione completo (Tabella 3).
2. Posizionare le camere di coltivazione riempite con mezzo sul sistema di coltivazione nell'incubatore impostato a 37 °C, 5% CO₂, 21% O₂ e un'umidità dell'80%. Equilibrare il mezzo per almeno 20 min.
3. Collegare il sistema di coltivazione con un computer e avviare il programma software corrispondente.
4. Impostare la velocità del bilanciere a 60 giri/min e preimpostare i parametri di stimolazione (impulsi di stimolazione e frequenza). Per le fette cardiache umane, impostare la stimolazione standard su impulsi bifasici con corrente di 50 mA, ciascuno costituito da corrente positiva di 3 ms, una pausa di 1 ms e un impulso di 3 ms di corrente invertita, ad una velocità di stimolazione di 30 battiti al minuto (BPM).
   NOTA: Nei tessuti ben conservati, la soglia di stimolazione tipica è di circa 15 mA. Per garantire una stimolazione affidabile e per tenere conto di qualsiasi possibile aumento della soglia di stimolazione, si raccomanda di impostare la corrente su un valore che superi la soglia di stimolazione da due a tre volte.
5. Controllare gli indicatori degli elettrodi del software per verificare che gli elettrodi delle camere di coltivazione funzionino correttamente.
   NOTA: è necessario intervenire ogni volta che l'indicatore di canale nel software di coltivazione diventa rosso. In questo caso, le cariche dell'impulso bipolare non sono bilanciate.

7. Preparazione delle fette

NOTA: Le fette subendocardiche iniziali non sono comunemente adatte alla coltivazione di tessuti e devono essere scartate a causa della morfologia irregolare. Dopo le prime cinque o 10 fette, la consistenza e la morfologia della fetta migliorano. La fetta ideale è di almeno 1 cm x 1 cm, non ha macchie fibrotiche o solo limitate, non è frammentata e ha un allineamento omogeneo delle fibre (Figura 2B, D). La fibrosi interstiziale, situata tra le fibre dei miociti, è spesso presente nel miocardio umano difettoso. Sorprendentemente, questo non è un predittore negativo del successo della coltivazione.

1. Versare una quantità adeguata di tampone per affettatura fredda in un coperchio della piastra di Petri da 5 cm per assicurarsi che le fette non si asciughino. Mettere le fette nel coperchio della capsula di Petri contenente il tampone di affettatura a freddo.
2. Separare l'agarosio dal tessuto usando una pinzetta. Evitare di toccare il tessuto. Maneggiare il tessuto con attenzione poiché qualsiasi danno al tessuto ridurrà il tasso di successo della coltivazione.
3. Determinare la direzione delle fibre miocardiche mediante un'ispezione ravvicinata contro una fonte di luce. Questo è importante quando si attaccano i triangoli di plastica al tessuto nel passaggio 7.6.
   NOTA: i passaggi 7.4 e 7.5 devono essere eseguiti in rapida successione, entro 5 s.
4. Attaccare due triangoli di plastica a un campione usando la colla per ancorare il tessuto all'interno delle camere di coltivazione.
   1. Posizionare 1 μL di colla su un coperchio sterile della capsula di Petri. Usa una pinzetta agganciata per raccogliere uno dei triangoli di plastica autoclavati. Immergere rapidamente il bordo anteriore del triangolo nella colla e incollare il triangolo sul campione, perpendicolare all'allineamento dei cardiomiociti. Ripetere l'operazione per l'altro triangolo.
5. Tagliare il tessuto che supera la larghezza del triangolo con un bisturi (Figura 2C). Riposizionare la fetta con i due triangoli montati nel tampone di taglio del vassoio di taglio.
   NOTA: ripetere i passaggi da 7.2 a 7.5 fino a quando non viene preparato un numero sufficiente di fette per riempire le camere di coltivazione. Si consiglia di preparare alcune fette aggiuntive per consentire la sostituzione delle fette con scarsa contrazione.

8. Montare le fette

NOTA: Il postcarico è determinato dalla rigidità del filo della molla nelle camere di coltivazione. Sono disponibili tre diversi tipi, in base allo spessore del filo della molla.

1. Prendi una camera di coltivazione a riempimento medio dall'incubatrice. Selezionare una delle fette preparate e inserirla nella camera collegando un triangolo a ciascun perno.
2. Regolare la distanza tra i pin di montaggio in base alle dimensioni del campione. Assicurarsi che il campione sia immerso nel mezzo. Riposizionare la camera nella presa designata del sistema di coltivazione nell'incubatore.
   ATTENZIONE: non allungare eccessivamente il tessuto e non piegare eccessivamente il filo della molla!
3. Impostare la tensione di precarico dopo il posizionamento del piatto sul bilanciere.
   1. Diminuire il precarico ruotando la vite di regolazione in senso antiorario. Fallo fino a quando la linea di base del grafico corrispondente sullo schermo del computer non cambia più.
   2. Aumentare con attenzione il precarico (cioè aumentare la tensione) ruotando la vite di regolazione in senso orario. Per le camere con la massima rigidità, continuare fino a quando la linea di base corrispondente nel grafico è aumentata di 1000-1200 unità, che corrisponde a 1 mN di precarico.
      NOTA: la regolazione esatta dipenderà dalla singola costante di molla di una camera di coltivazione, che può essere determinata mediante calibrazione prima di un esperimento secondo le istruzioni del produttore. Il software di registrazione consente di prendere in considerazione la calibrazione della singola camera in modo che le forze vengano visualizzate uniformemente in μN. Si consiglia di applicare la stimolazione elettrica dall'inizio della coltivazione. Pertanto, è ben possibile che la fetta inizi a contrarsi durante la regolazione del precarico. In questo caso, concentrarsi sulla linea di base diastolica per valutare il precarico.

9. Cambiare il mezzo

1. Preparare il terreno di coltivazione secondo la ricetta nella Tabella 3. Poco prima dell'uso del mezzo, aggiungere 50 μL di β-mercaptoetanolo (50 mM) a un tubo da 50 ml. Conservare a 4 °C.
2. Una volta ogni 2 giorni, scambiare parzialmente il terreno di coltivazione. Aggiornare il mezzo ogni 2 giorni, se si desidera la coltivazione a lungo termine delle fette miocardiche.
3. Preriscaldare il mezzo fresco a bagnomaria o in un incubatore ad aria calda a 37 °C per 30-45 min. Rimuovere una camera di coltivazione dall'incubatore e posizionarla sotto una cappa a flusso laminare.
   ATTENZIONE: È essenziale mantenere la camera, così come il mezzo, calda a 37 °C (> 35 °C) per evitare iper contratture dovute alla bassa temperatura. Un danno meno distinto può essere presente come un aumento della tensione diastolica entro poche ore dallo scambio medio. Questo può sembrare recuperare, ma lo stress ripetuto potrebbe causare un deterioramento accumulato.
4. Rimuovere il mezzo dalla camera di coltivazione, lasciando circa 0,8 ml nella camera. Aggiungere 1,6 ml di mezzo fresco alla stessa camera. Il volume totale del mezzo dovrebbe essere di circa 2,4 ml per camera.
5. Riposizionare il coperchio della camera e riposizionare la camera di coltivazione nella rispettiva posizione.

Risultati

La contrazione delle fette miocardiche è stata visualizzata sullo schermo del computer dopo l'inserimento della camera di coltivazione nel connettore corrispondente (Figura 3). La contrazione delle fette miocardiche umane è iniziata immediatamente dopo la stimolazione. Le fette ipercontrastratte per 5-10 min. Ciò era visibile come un aumento delle forze diastoliche, causato da una contrattura tonica delle frazioni tissutali danneggiate. Questo processo è stato ripristinato a vari livelli...

Discussione

In passato, la ricerca cardiovascolare ha fatto grandi progressi nella coltivazione dei cardiomiociti. Tuttavia, la coltivazione 3D di cardiomiociti con geometria intatta non è ancora ben consolidata. Rispetto ai precedenti protocolli applicati per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico, il protocollo che abbiamo descritto qui assomiglia più da vicino all'ambiente in vivo del tessuto. Inoltre, l'applicazione di pre e postcarico consente un ambiente più biomimetico. Siamo in grado di analizzar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish culture system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070