הכנת רקמת שריר הלב האנושית לטיפוח ארוך טווח

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח ex vivo של רקמת שריר הלב החדרית האנושית. זה מאפשר ניתוח מפורט של כוח התכווצות וקינטיקה, כמו גם את היישום של pre- ו- afterload כדי לחקות את הסביבה הפיזיולוגית in vivo מקרוב יותר.

Abstract

גידול קרדיומיוציטים ראה מספר עצום של התפתחויות, החל מגידול תאים דו-ממדי (דו-ממדי) וכלה באורגנואידים שמקורם ב-iPSC. בשנת 2019 הודגמה דרך ex vivo לטפח פרוסות שריר הלב המתקבלות מדגימות לב אנושיות, תוך התקרבות למצב in vivo של התכווצות שריר הלב. דגימות אלה מקורן בעיקר בהשתלות לב או בהצבת מכשירי סיוע לחדר שמאלי. באמצעות ויברטום ומערכת טיפוח שפותחה במיוחד, פרוסות בעובי 300 מיקרומטר ממוקמות בין חוט קבוע לחוט קפיץ, ומאפשרות טיפוח יציב וניתן לשחזור במשך מספר שבועות. במהלך הטיפוח, הפרוסות מגורות באופן רציף על פי הגדרות בודדות. ניתן להציג ולתעד התכווצויות בזמן אמת, וניתן ליישם בקלות חומרים פרמקולוגיים. ניתן לתזמן ולבצע פרוטוקולי גירוי המוגדרים על-ידי המשתמש כדי להעריך פרמטרים חיוניים של כיווץ כמו פוטנציה לאחר ההשהיה, סף הגירוי, יחסי כוח-תדר ותקופת עקשן. יתר על כן, המערכת מאפשרת הגדרה משתנה לפני ואחרי העומס לטיפוח פיזיולוגי יותר.

כאן, אנו מציגים מדריך שלב אחר שלב כיצד ליצור טיפוח מוצלח לטווח ארוך של פרוסות שריר הלב של החדר השמאלי האנושי, באמצעות פתרון גידול ביומימטי מסחרי.

Introduction

בעשור האחרון, גידול במבחנה של תאי שריר הלב עשה התקדמות רבה, החל מטכניקות דו-ממדיות ותלת-ממדיות (תלת-ממדיות) וכלה בשימוש באורגנואידים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שהתמיינו למיוציטים לבביים ^1,2,3. גידולי Ex vivo ותאים ראשוניים הראו שהם בעלי ערך רב, במיוחד עבור מחקרים גנטיים ופיתוח תרופות ^4,5,6. שימוש ברקמות אנושיות משפר את הערך התרגומי של התוצאות. עם זאת, טיפוח תלת-ממדי ארוך טווח של רקמות שריר הלב עם גיאומטריה שלמה אינו מבוסס היטב. הגיאומטריה השלמה היא תכונה מרכזית לחיקוי תנאי in vivo, שכן תפקוד לב תקין, תקשורת בין תאים שונים, כמו גם אינטראקציות בין מטריצת תאים הם תנאים מוקדמים. טיפוח רקמות שריר הלב עבר שלבים שונים של התפתחות. אחוזי ההצלחה והיציבות של גידול רקמות שריר הלב ex vivo היו בתחילה נמוכים למדי, אך הגישות האחרונות הניבו תוצאות מבטיחות 7,8,9,10,111.

מבין אלה, Fischer et al. היו הראשונים שהדגימו כי ניתן לשמור על כדאיות וביצועים מתכווצים של רקמת שריר הלב האנושית בטיפוח תאי ex vivo במשך שבועות רבים⁷. הטכניקה שלהם התבססה על פרוסות רקמה דקות שנחתכו מתוך שריר הלב האנושי, שהורכבו בתאי גידול שפותחו לאחרונה וסיפקו תנאים ביומכניים מוגדרים וגירוי חשמלי מתמשך. שיטת טיפוח זו דומה מאוד לתפקוד in vivo של רקמת שריר הלב, ושוכפלה על ידי מספר קבוצות מחקר עצמאיות ^{2,12,13,14,15}. חשוב לציין כי התאים ששימשו את Fischer et al. אפשרו גם רישום רציף של כוחות מפותחים במשך עד 4 חודשים, ובכך פתחו הזדמנויות חסרות תקדים למחקר פיזיולוגי ופרמקולוגי על שריר הלב האנושי השלם⁷.

טכניקות דומות פותחו באופן עצמאי על ידי קבוצות אחרות ויושמו על בני אדם, חולדות, חזירים וארנבים שריר הלב ^7,10,11. Pitoulis et al. פיתחו לאחר מכן שיטה פיזיולוגית יותר, המשחזרת את יחס הכוח-אורך הרגיל במהלך מחזור התכווצות, אך פחות מתאימה לניתוח בתפוקה גבוהה¹⁶. ככזו, ניתן לראות את הגישה הכללית של גידול ביומימטי כצעד נוסף לצמצום, עידון והחלפה (3R) של ניסויים בבעלי חיים.

עם זאת, ניצול של פוטנציאל זה דורש נהלים סטנדרטיים, ניתוחי תוכן גבוהים ורמת תפוקה גבוהה. אנו מציגים טכניקה המשלבת חיתוך אוטומטי של שריר הלב האנושי החי עם תחזוקה במבחנה במערכת גידול ביומימטית שהפכה לזמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים). עם הגישה המוצעת, מספר הפרוסות הבודדות שניתן ליצור מדגימה אחת של שריר הלב הטרנסמורלי מוגבל רק על ידי זמן העיבוד. דגימה בגודל ובאיכות מספיקים (3 ס"מ על 3 ס"מ) מניבה לעתים קרובות 20-40 פרוסות רקמה שנחתכות בנוחות עם ויברטום אוטומטי. פרוסות אלה ניתן לשים בתאי טיפוח השייכים למערכת. התאים מאפשרים גירוי חשמלי, שאת הפרמטרים שלו ניתן לווסת (כלומר, משך הדופק, הקוטביות, הקצב והזרם), כמו גם את התאמת העומס לפני ואחרי, באמצעות חוטי קפיץ בתוך התאים. הכיווץ של כל פרוסה נרשם מתנועה של מגנט קטן המחובר לחוט קפיץ ומוצג כגרף הניתן לפרשנות. ניתן להקליט נתונים בכל עת ולנתח אותם באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי. מלבד הקצב הבסיסי הקבוע, ניתן לבצע פרוטוקולים מתוזמנים כדי להעריך באופן פונקציונלי את תקופת העקשנות שלהם, את סף הגירוי, את העוצמה שלאחר ההשהיה ואת הקשר בין הכוח לתדר.

טיפוח ביומימטי ארוך טווח זה של פרוסות שריר הלב מרובות מלב בודד סולל את הדרך למחקר ex vivo עתידי הן ברקמות אנושיות והן ברקמות של בעלי חיים, ומאפשר את הסינון להשפעות תרופתיות טיפוליות וקרדיוטוקסיות ברפואת הלב וכלי הדם. זה כבר יושם על גישות ניסיוניות שונות 2,12,13,15. כאן, אנו נותנים תיאור מפורט שלב אחר שלב של הכנת רקמות אנושיות ומספקים פתרונות לבעיות טיפוח שנתקלים בהן לעתים קרובות.

Protocol

איסוף הרקמות לניסויים המתוארים כאן אושר על ידי ועדות הביקורת המוסדיות של אוניברסיטת מינכן ובוכום של אוניברסיטת הרוהר. המחקרים נערכו על פי הנחיות הצהרת הלסינקי. המטופלים נתנו את הסכמתם מדעת בכתב לפני איסוף הרקמות.

1. רכישת רקמות

1. להשיג רקמה אנושית מחולים שעברו השתלת לב או ניתוח לב.
2. לפני רכישת הרקמה, הכן 2 ליטר של תמיסה לב-ריאה (המכונה גם חיץ חיתוך (טבלה 1)).
3. לאחר קבלת ביופסיה של חדר שמאלי טרנסמורלי בגודל 4 ס"מ על 4 ס"מ (LV), הניחו את הרקמה מיד (תוך 5 דקות לאחר הכריתה) בכוס סטרילית חד-פעמית מפלסטיק הניתן להסתרה המכילה כ-70 מ"ל של חיץ חיתוך קר (4 מעלות צלזיוס). שמור על 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: מאגר החיתוך המשמש בפרוטוקול זה מאפשר אחסון קר (4 °C) של הרקמה למשך עד 36 שעות. זה מאפשר הובלה קרה של הרקמה ממרפאות שאינן קרובות למעבדה. עם זאת, זמני ההובלה ≤ 24 שעות הוכיחו את עצמם כאופטימליים.

2. הכנת אגרוז והוויברטום

1. ודא שתאי טיפוח מספיקים מוכנים ומעוקרים (איור 1A).
   1. טבלו את התאים ואלקטרודות הגרפיט ב-1 ליטר של תמיסת איזופרופנול של 10% והתסיסו בן לילה. למחרת, מעבירים את התאים לתמיסת איזופרופנול של 100% למשך 3 דקות ואוטוקלים את אלקטרודות הגרפיט בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   2. תנו לתאים ולאלקטרודות הגרפיט להתייבש באוויר מתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית.
   3. חבר לוח מעגלים לכל אחד מהתאים בהתאם למיקומים הזמינים על הנדנדה. הניחו שתי אלקטרודות גרפיט על לוח המעגלים בהתאם להוראות היצרן.
   4. מניחים מכסה צלחת פטרי 35 מ"מ על גבי התא כדי למנוע זיהום.
2. הגדר את מערכת הטיפוח המיודית (ראו טבלת חומרים) באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ על-ידי חיבור המערכת למחשב (איור 1B).
3. להכין את 4% נמוך נמס agarose במאגר חיתוך (ללא גלוקוז; טבלה 2). ניתן לאחסן את האגרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
   1. ביום הניסוי, להמיס נפח מלאי של תמיסת אגרוז באמצעות אמבט מים שנקבע על 80 מעלות צלזיוס. בהתאם לכמות, ההמסה אורכת כ-30 דקות.
   2. כאשר האגרוז נוזלי, משכו 8 מ"ל של אגרוז נוזלי למזרק של 10 מ"ל, עם תוספת של 2 מ"ל אוויר. סגור את המזרק עם מכסה סטרילי והנח אותו הפוך באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, כדי למנוע את התמצקות האגרוז, וכדי לאזן את הטמפרטורה שלו כדי למנוע נזקי היפרתרמיה של הדגימה.
4. אם קיים, הפעילו את מכשיר קירור המים של הוויברטום לפחות 30 דקות לפני חיתוך הרקמה כדי לאפשר יכולת קירור מספקת. הגדר את הטמפרטורה של זרימת המים ל 4 °C (76 °F).
   הערה: מגש החיתוך וצלחת הקירור המשמשים כאן הכילו שניהם זרימת מים מובנית. זה מומלץ מאוד לקירור ולהורדת סיכוני הזיהום. עם זאת, ניתן גם להשתמש בקרח כטכניקת קירור. כמו כן, אין צורך לחבר את התקן קירור המים למגש החיתוך ו/או לצלחת הקירור של הוויברטום בשלב זה של הפרוטוקול.
5. נקו את מגש החיתוך של הוויברטום ואת צלחת הדגימה על ידי שטיפת כל המשטחים עם 100% איזופרופנול למשך 3 דקות לפחות.
   הערה: בהתאם למערכת הוויברטום שבה נעשה שימוש, הגדרת הוויברטום עשויה להיות שונה. עיין במדריך של הוויברטום הקיים במעבדה לקבלת מידע על שיטות ההגדרה וכיול הלהב.
6. מלאו את מגש החיתוך עד 90%-95% במאגר חיתוך. במערך המשמש כיום, זה מתאים כ 400 מ"ל. חברו את הצינורות של מכשיר קירור המים לשסתומים במגש החיתוך ובפלטת הקירור של הוויברטום.
7. יש לחטא את כל הכלים הדרושים להכנה על ידי טבילתם בתמיסת איזופרופנול 100% למשך 5 שניות. הסר את הכלים מתמיסת האיזופרופנול ויבש באוויר מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.

3. קיצוץ והטמעה של הדגימות

1. מעבירים את דגימת הרקמה לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה במאגר חיתוך קר. השאירו את המנה על צלחת קירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (מחוברת לצידנית יותר או מונחת על קרח).
2. הסר את הטרבקולה אנדוקרדיאלית על ידי החזקת אנדוקרדיום עם פינצטה ושימוש במספריים כדי לחתוך כ -3 מ"מ של רקמה אנדוקרדיאלית. באותו אופן, להסיר רקמת שומן מוגזמת מתחת לאפיקרדיום אם קיים.
3. לקבע את דגימת הרקמה החתוכה, הצד האנדוקרדיאלי כלפי מעלה, לכדי מדבקת גומי בגודל 2 ס"מ על 2 ס"מ באמצעות ארבע מחטים בגודל 0.9 מ"מ x 70 מ"מ 20 גרם המקובעות במצב מרובע (0.9 ס"מ x 0.9 ס"מ; איור 1C, D). ודא שהקצה האלכסוני של כל קצה מחט מצביע פנימה. זה משפר את הקיבעון ומונע נזק לשריר הלב.
   אזהרה: הכיוון של הריבוע הנ"ל צריך להיות אורתוגונלי לכיוון המיופייבר השולט הצפוי.
4. חותכים את כל הרקמה העודפת מחוץ לריבוע ארבע המחטים באמצעות אזמל. אם גודל הדגימה המקורית מאפשר, השתמש בשתי דגימות של רקמות שריר הלב במהלך הכנה זו מאותה דגימה גולמית.
5. באמצעות פינצטה, הניחו את הדגימה הגזומה על פיסת רקמה סטרילית כדי להסיר כל חיץ חיתוך עודף שנותר על הדגימה. כדי למנוע ייבוש מתוך הדגימה, אין לשמור את הדגימה על הרקמה במשך יותר מ -10 שניות.
6. הניחו את הדגימות בצלחת פטרי 35 מ"מ, כך שהלהב חותך בניצב ליישור הקרדיומיוציטים והאפיקרדיום פונה כלפי מטה. אם ההכנה כוללת שתי דגימות, ודא שהדגימות ממורכזות ואינן נוגעות זו בזו.
7. קחו את מזרק האגרוז מאמבט המים והטביעו את הדגימות באגרוז. (איור 2א). תנו לאגרוזה להתמצק במשך 5 דקות על צלחת קירור. הדגימות חייבות להישאר בקשר עם צלחת פטרי, מה שיבטיח שמישור החיתוך יהיה מקביל לכיוון הסיבים שריר הלב השולט.
   אזהרה: אין לרוקן את המזרק במלואו, על מנת למנוע בועות אוויר. שימו לב לכמות האגרוז שנותרה במזרק במהלך טבילת הדגימות. במקרה של בועות אוויר בצלחת עם הדגימות, משכו בזהירות את בועות האוויר בחזרה למזרק.

4. הנחת הדוגמאות על מגש החיתוך

1. מוציאים את האגרוז המוצק המכיל את הדגימה(ות) מצלחת פטרי 35 מ"מ באמצעות מרית או כלי דומה, על ידי חיטובו בין הדגימה לצד של צלחת הפטרי. חותכים חלק מהאגרוז באמצעות אזמל תוך שמירה על כיסוי הדגימות.
   אזהרה: אין להסיר יותר מדי מהאגרוז. צריכים להישאר לפחות 5 מ"מ של אגרוז בצדדים הארוכים והקצרים במישור X/Z.
   הערה: שלבים 4.2-4.4 צריכים להתבצע ברצף מהיר (כלומר, מקסימום 5 שניות). יש את כל הכלים הדרושים בהישג יד לפני תחילת העבודה. לא ניתן למקם מחדש את המדגם לאחר ההצבה. נסו להגביל את החשיפה של הדבק לאוויר וללחות. מגע עם אוויר או נוזלים ימצק את הדבק, ויהפוך אותו לבלתי שמיש.
2. עם פיפטה, מניחים ומפיצים 60 μL של דבק במרכז ומסביב לרציף החיתוך.
3. הניחו את הצד האפיקרדיאלי של הדגימה הכלולה באגרוז על גבי האזור המודבק באמצעות פינצטה. אין למקם מחדש. הצד האנדוקרדיאלי של המדגם חייב להיות גלוי באגרוז. תנו לדבק להתמצק למשך דקה אחת. לחץ בעדינות על האגרוז המכיל את הדגימה מלמעלה באמצעות כלי קהה (למשל, פינצטה) תוך מניעת חיתוך לתוך האגרוז או פגיעה בו.
4. מקם את פלטפורמת הדגימה במקומה המיועד במגש החיתוך של הוויברטום, המלא במאגר חיתוך.

5. התחלת הוויברטום

1. הגדר משרעת רטט ל-1 מ"מ ואת מהירות החיתוך הראשונית ל-0.07 מ"מ לשנייה. הגדר את עובי הפרוסה ל-300 מיקרומטר כדי לחתוך פרוסות.
2. כל עוד הלהב רק חותך את האגרוז, הגדל את מהירות החיתוך למקסימום שלה, שבמקרה זה הוא 1.50 מ"מ לשנייה. ברגע שהוויברטום מתחיל לחתוך את הרקמה, הפחיתו את המהירות ל-0.07 מ"מ לשנייה באופן מיידי.
   הערה: אם הרקמה אינה פרוסה בצורה חלקה, למשל אם יש אזורים פיברוטיים גדולים במדגם, זה עשוי לעזור להגדיל את משרעת החיתוך עד 1.5 מ"מ ולהפחית את מהירות החיתוך ל -0.04 מ"מ לשנייה.

6. הכנת בינוני וחממה במהלך הליך החיתוך

1. מלאו כל תא טיפוח ב-2.4 מ"ל של מדיום גידול מלא (טבלה 3).
2. הניחו את תאי הטיפוח המלאים במדיום על מערכת הטיפוח באינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, 21% O₂ ולחות של 80%. שיווי המשקל של המדיום למשך 20 דקות לפחות.
3. חבר את מערכת הטיפוח עם מחשב והפעל את התוכנה המתאימה.
4. הגדר את מהירות הנדנדה ל-60 סל"ד והגדר מראש את פרמטרי הגירוי (פולסים ותדירות גירוי). עבור פרוסות לב אנושיות, הגדר את הגירוי הסטנדרטי לדחפים דו-פאזיים עם זרם של 50 mA, שכל אחד מהם מורכב מזרם חיובי של 3 אלפיות השנייה, הפסקה של 1 אלפיות השנייה ופולס של 3 אלפיות השנייה של זרם הפוך, בקצב קצב של 30 פעימות לדקה (BPM).
   הערה: ברקמות שהשתמרו היטב, סף הגירוי האופייני הוא סביב 15 mA. כדי להבטיח גירוי אמין וכדי להסביר כל עלייה אפשרית של סף הגירוי, מומלץ להגדיר את הזרם לערך החורג מסף הגירוי פי שניים עד שלושה.
5. בדוק את מחווני האלקטרודה של התוכנה כדי לוודא שהאלקטרודות של תאי הטיפוח פועלות כראוי.
   הערה: יש צורך בפעולה בכל פעם שמחוון הערוץ בתוכנת הטיפוח הופך לאדום. במקרה זה, מטעני הדו קוטביות של הדו-קוטביות אינן מאוזנות.

7. הכנת הפרוסות

הערה: פרוסות תת-לב ראשוניות בדרך כלל אינן מתאימות לגידול רקמות ויש להשליך אותן בגלל מורפולוגיה לא אחידה. לאחר חמש עד עשר הפרוסות הראשונות, מרקם הפרוסה והמורפולוגיה משתפרים. הפרוסה האידיאלית היא לפחות 1 ס"מ על 1 ס"מ, אין לה או רק טלאים פיברוטיים מוגבלים, היא לא מקוטעת, ויש לה יישור סיבים הומוגני (איור 2B, D). פיברוזיס אינטרסטיציאלי, הממוקם בין סיבי המיוציטים, קיים לעתים קרובות בשריר הלב האנושי הכושל. באופן מפתיע, זה לא מנבא שלילי להצלחת הטיפוח.

1. יוצקים כמות מספקת של חיץ חיתוך קר במכסה צלחת פטרי 5 ס"מ כדי להבטיח שהפרוסות לא יתייבשו. מניחים את הפרוסות במכסה צלחת פטרי המכיל את חיץ החיתוך הקר.
2. הפרד את האגרוז מהרקמה באמצעות פינצטה. יש למנוע נגיעה ברקמה. טפלו ברקמה בזהירות שכן כל פגיעה ברקמה תפחית את אחוזי ההצלחה של הטיפוח.
3. קבע את כיוון סיבי שריר הלב על ידי בדיקה מדוקדקת מול מקור אור. יש לכך חשיבות כאשר מצמידים את משולשי הפלסטיק לרקמה בשלב 7.6.
   הערה: שלבים 7.4 ו- 7.5 צריכים להתבצע ברצף מהיר, תוך 5 שניות.
4. חברו שני משולשי פלסטיק לדגימה באמצעות דבק על מנת לעגן את הרקמה בתוך תאי הטיפוח.
   1. מניחים 1 μL של דבק על מכסה צלחת פטרי סטרילי. השתמשו בפינצטה מחוברת כדי לאסוף את אחד ממשולשים הפלסטיים האוטומטיים. טבלו במהירות את הקצה הקדמי של המשולש בדבק והדביקו את המשולש על הדגימה, בניצב ליישור הקרדיומיוציטים. חזור על הפעולה עבור המשולש השני.
5. חתכו את הרקמה שחורגת מרוחב המשולש עם אזמל (איור 2C). הניחו את הפרוסה עם שני המשולשים המותקנים בחזרה למאגר החיתוך של מגש החיתוך.
   הערה: חזור על שלבים 7.2 עד 7.5 עד שיהיו מוכנות מספיק פרוסות כדי למלא את תאי הטיפוח. אנו ממליצים להכין כמה פרוסות נוספות כדי לאפשר החלפת פרוסות בהתכווצות לקויה.

8. הרכבת הפרוסות

הערה: העומס שלאחר מכן נקבע על ידי נוקשות חוט הקפיץ בתאי הטיפוח. שלושה סוגים שונים זמינים, בהתבסס על עובי חוט הקפיץ.

1. קח תא גידול מלא בינוני מהחממה. בחר אחת מהפרוסות המוכנות והכנס אותה לתא על ידי חיבור משולש אחד לכל סיכה.
2. התאם את המרחק בין פיני ההרכבה בהתאם לגודל המדגם. ודא שהמדגם שקוע במדיום. החזירו את התא לשקע המיועד שלו למערכת הטיפוח בחממה.
   אזהרה: אין למתוח יתר על המידה את הרקמה ואל תכופפו יתר על המידה את חוט הקפיץ!
3. הגדר את מתח הטעינה מראש לאחר מיקום המנה על הנדנדה.
   1. הקטן את הטעינה מראש על-ידי סיבוב בורג הכוונון נגד כיוון השעון. בצע פעולה זו עד שנקודת ההתחלה של הגרף המתאים על מסך המחשב לא תשתנה עוד.
   2. הגבירו בזהירות את הטעינה מראש (כלומר, הגבירו את המתח) על ידי סיבוב בורג הכוונון בכיוון השעון. עבור התאים עם הנוקשות הגבוהה ביותר, המשך עד שקו הבסיס המתאים בגרף גדל ב- 1000-1200 יחידות, אשר מתאים ל- 1 mN של טעינה מראש.
      הערה: ההתאמה המדויקת תהיה תלויה בקבוע הקפיץ הבודד של תא הטיפוח, אשר ניתן לקבוע על ידי כיול לפני ניסוי על פי הוראות היצרן. תוכנת ההקלטה מאפשרת התחשבות בכיול התא הבודד כך שהכוחות יוצגו באופן אחיד ב- μN. מומלץ ליישם גירוי חשמלי מתחילת הטיפוח. ככזה, ייתכן מאוד שהפרוסה מתחילה להתכווץ במהלך התאמת הטעינה מראש. במקרה זה, התמקדו בקו הבסיס הדיאסטולי כדי להעריך את העומס מראש.

9. שינוי המדיום

1. מכינים מדיום גידול על פי המתכון בטבלה 3. זמן קצר לפני השימוש במדיום, הוסיפו 50 μL של β-mercaptoethanol (50 mM) לצינור של 50 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. אחת ליומיים, החליפו חלקית את מדיום הטיפוח. רענן את המדיום כל יומיים, אם יש צורך בטיפוח ארוך טווח של פרוסות שריר הלב.
3. מחממים מראש את המדיום הטרי באמבט מים או באינקובטור אוויר חם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות. מוציאים את תא הטיפוח מהאינקובטור ומניחים אותו מתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית.
   אזהרה: חיוני לשמור על החדר, כמו גם על הבינוני, חם ב 37 ° C (> 35 ° C) כדי למנוע התכווצויות יתר עקב טמפרטורה נמוכה. נזק פחות מובהק עשוי להיות נוכח כעלייה במתח הדיאסטולי תוך מספר שעות לאחר חילופי דברים בינוניים. זה עשוי להיראות מחלים, אבל מתח חוזר ונשנה עלול לגרום להידרדרות מצטברת.
4. הסר את המדיום מתא הטיפוח, והשאר כ-0.8 מ"ל בתא. הוסף 1.6 מ"ל של מדיום טרי לאותו תא. הנפח הכולל של המדיום צריך להיות סביב 2.4 מ"ל לכל תא.
5. מניחים את כיסוי החדר לאחור ומחזירים את תא הטיפוח למקומו המתאים.

תוצאות

הכיווץ של פרוסות שריר הלב הוצג על מסך המחשב לאחר החדרת תא הטיפוח למחבר המתאים לו (איור 3). התכווצות פרוסות שריר הלב האנושיות החלה מיד עם הגירוי. הפרוסות התרכזו יתר על המידה במשך 5-10 דקות. זה נראה לעין כעלייה של כוחות דיאסטולים, שנגרמו על ידי התכווצות טוניקה של שברי רקמה פגומים....

Discussion

בעבר, מחקר הלב וכלי הדם עשה התקדמות רבה בטיפוח של קרדיומיוציטים. עם זאת, הטיפוח התלת-ממדי של קרדיומיוציטים עם גיאומטריה שלמה עדיין אינו מבוסס היטב. בהשוואה לפרוטוקולים קודמים שיושמו עבור גידול ex vivo של רקמת שריר הלב, הפרוטוקול שתיארנו כאן דומה יותר לסביבת in vivo של הרקמה. יתר על כן, ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish bioreactor system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070