Préparation de tissu myocardique humain pour la culture à long terme

Résumé

Nous présentons un protocole pour la culture ex vivo de tissu myocardique ventriculaire humain. Il permet une analyse détaillée de la force de contraction et de la cinétique, ainsi que l’application de la pré- et post-charge pour imiter de plus près l’environnement physiologique in vivo .

Résumé

La culture de cardiomyocytes a connu un grand nombre de développements, allant de la culture de cellules bidimensionnelles (2D) aux organoïdes dérivés de l’iPSC. En 2019, une façon ex vivo de cultiver des tranches de myocarde obtenues à partir d’échantillons de cœur humain a été démontrée, tout en approchant in vivo de l’état de contraction myocardique. Ces échantillons proviennent principalement de transplantations cardiaques ou de placements de dispositifs d’assistance ventriculaire gauche. À l’aide d’un vibratome et d’un système de culture spécialement développé, des tranches de 300 μm d’épaisseur sont placées entre un fil fixe et un fil à ressort, permettant une culture stable et reproductible pendant plusieurs semaines. Pendant la culture, les tranches sont continuellement stimulées selon des paramètres individuels. Les contractions peuvent être affichées et enregistrées en temps réel, et les agents pharmacologiques peuvent être facilement appliqués. Des protocoles de stimulation définis par l’utilisateur peuvent être programmés et exécutés pour évaluer les paramètres de contraction vitaux tels que la potentialisation post-pause, le seuil de stimulation, la relation force-fréquence et la période réfractaire. De plus, le système permet un réglage variable de la précharge et de la post-charge pour une culture plus physiologique.

Ici, nous présentons un guide étape par étape sur la façon de générer une culture réussie à long terme de tranches myocardiques ventriculaires gauches humaines, en utilisant une solution de culture biomimétique commerciale.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, la culture in vitro de cellules myocardiques a fait de grands progrès, allant des techniques 2D et tridimensionnelles (3D) à l’utilisation d’organoïdes et de cellules souches pluripotentes induites différenciées en myocytes cardiaques ^1,2,3. Les cultures cellulaires ex vivo et primaires se sont révélées d’une grande valeur, en particulier pour les études génétiques et le développement de médicaments ^4,5,6. L’utilisation de tissus humains améliore la valeur translationnelle des résultats. La culture 3D à long terme de tissus myocardiques à géométrie intacte n’est cependant pas bien établie. La géométrie intacte est une caractéristique clé pour imiter les conditions in vivo, car une fonction cardiaque appropriée, la communication entre différentes cellules, ainsi que les interactions cellule-matrice sont des conditions préalables. La culture du tissu myocardique est passée par différentes phases de développement. Le taux de réussite et la stabilité de la culture ex vivo du tissu myocardique étaient initialement assez faibles, mais des approches récentes ont donné des résultats prometteurs 7,8,9,10,11.

Parmi ceux-ci, Fischer et al. ont été les premiers à démontrer que la viabilité et la performance contractile du tissu myocardique humain peuvent être maintenues dans la culture cellulaire ex vivo pendant de nombreuses semaines⁷. Leur technique était basée sur de fines tranches de tissus coupées dans du myocarde humain explanté, qui étaient montées dans des chambres de culture nouvellement développées qui fournissaient des conditions biomécaniques définies et une stimulation électrique continue. Cette méthode de culture ressemble beaucoup à la fonction in vivo du tissu myocardique et a été reproduite par plusieurs groupes de recherche indépendants 2,12,13,14,15. Il est important de noter que les chambres utilisées par Fischer et al. ont également permis l’enregistrement continu des forces développées jusqu’à 4 mois, et ont ainsi ouvert des opportunités sans précédent pour la recherche physiologique et pharmacologique sur le myocarde humain intact⁷.

Des techniques similaires ont été développées indépendamment par d’autres groupes et appliquées au myocarde humain, de rat, porcin et de lapin ^7,10,11. Pitoulis et al. ont par la suite développé une méthode plus physiologique, qui reproduit la relation force-longueur normale au cours d’un cycle de contraction, mais qui est moins adaptée à l’analyse à haut débit¹⁶. En tant que telle, l’approche générale de la culture biomimétique peut être considérée comme une étape supplémentaire dans la réduction, le raffinement et le remplacement (3R) de l’expérimentation animale.

Cependant, l’exploitation de ce potentiel nécessite des procédures standardisées, des analyses à contenu élevé et un niveau de débit élevé. Nous présentons une technique qui combine le tranchage automatisé du myocarde humain vivant avec l’entretien in vitro dans un système de culture biomimétique qui est devenu disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux). Avec l’approche proposée, le nombre de tranches individuelles pouvant être générées à partir d’un seul échantillon myocardique transmural n’est limité que par le temps de traitement. Un spécimen de taille et de qualité suffisantes (3 cm x 3 cm) donne souvent 20 à 40 tranches de tissu coupées de manière pratique avec un vibratome automatisé. Ces tranches peuvent être placées dans des chambres de culture appartenant au système. Les chambres permettent une stimulation électrique, dont les paramètres peuvent être modulés (c’est-à-dire la durée de l’impulsion, la polarité, la vitesse et le courant), ainsi que le réglage de la précharge et de la post-charge, à l’aide de fils à ressort à l’intérieur des chambres. La contraction de chaque tranche est enregistrée à partir du mouvement d’un petit aimant attaché à un fil à ressort et affichée sous forme de graphique interprétable. Les données peuvent être enregistrées à tout moment et analysées à l’aide d’un logiciel disponible gratuitement. Outre le rythme de base constant, des protocoles planifiés peuvent être effectués pour évaluer fonctionnellement leur période réfractaire, leur seuil de stimulation, leur post-pause-potentialisation et leur relation force-fréquence.

Cette culture biomimétique à long terme de plusieurs tranches myocardiques à partir d’un cœur individuel ouvre la voie à de futures recherches ex vivo dans les tissus humains et animaux et facilite le dépistage des effets thérapeutiques et cardiotoxiques des médicaments en médecine cardiovasculaire. Il a déjà été appliqué à diverses approches expérimentales 2,12,13,15. Ici, nous donnons une description détaillée étape par étape de la préparation des tissus humains et fournissons des solutions aux problèmes de culture fréquemment rencontrés.

Protocole

La collecte de tissus pour les expériences décrites ici a été approuvée par les comités d’examen institutionnels de l’Université de Munich et de l’Université de la Ruhr à Bochum. Les études ont été menées conformément aux directives de la Déclaration d’Helsinki. Les patients ont donné leur consentement éclairé écrit avant le prélèvement de tissus.

1. Acquisition tissulaire

1. Obtenir des tissus humains de patients subissant une transplantation cardiaque ou une chirurgie cardiaque.
2. Avant de vous procurer le tissu, préparer 2 L de solution cardioplégique (ci-après appelée tampon tranchant (tableau 1)).
3. Après avoir obtenu une biopsie transmurale ventriculaire gauche (VL) de 4 cm x 4 cm, placez immédiatement le tissu (dans les 5 minutes suivant l’excision) dans un bécher stérile à usage unique en plastique fermable contenant environ 70 mL de tampon de tranchage froid (4 °C). Conserver à 4 °C.
   REMARQUE: Le tampon de tranchage utilisé dans ce protocole permet le stockage au froid (4 °C) du tissu jusqu’à 36 h. Cela permet le transport à froid des tissus à partir de cliniques qui ne sont pas proches du laboratoire. Cependant, les temps de transport ≤ 24 h se sont avérés optimaux.

2. Préparation de l’agarose et du vibratome

1. Assurez-vous que suffisamment de chambres de culture sont préparées et stérilisées (Figure 1A).
   1. Immerger les chambres et les électrodes de graphite dans 1 L d’une solution d’isopropanol à 10% et agiter pendant la nuit. Le lendemain, transférer les chambres dans une solution à 100% d’isopropanol pendant 3 min et autoclaver les électrodes de graphite à 120 °C pendant 10 min.
   2. Laissez les chambres et les électrodes en graphite sécher à l’air libre sous une hotte à écoulement laminaire.
   3. Fixez une carte de circuit imprimé à chacune des chambres en fonction des positions disponibles sur la bascule. Placez deux électrodes en graphite sur la carte de circuit imprimé conformément aux instructions du fabricant.
   4. Placez un couvercle de boîte de Petri de 35 mm sur le dessus de la chambre pour éviter toute contamination.
2. Installez le système de culture Myodish (voir Tableau des matériaux) dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ en connectant le système à un ordinateur (Figure 1B).
3. Préparer l’agarose à faible teneur en fusion à 4 % dans un tampon de tranchage (sans glucose; Tableau 2). L’agarose peut être conservée à 4 °C pendant 6 mois.
   1. Le jour de l’expérience, faire fondre un volume stock de solution d’agarose à l’aide d’un bain-marie fixé à 80 °C. Selon la quantité, la fonte prend environ 30 min.
   2. Lorsque l’agarose est liquide, aspirer 8 mL d’agarose liquide dans une seringue de 10 mL, avec 2 mL d’air supplémentaires. Fermez la seringue avec un capuchon stérile et placez-la à l’envers dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min, pour empêcher l’agarose de se solidifier et pour équilibrer sa température afin d’éviter que l’échantillon ne soit endommagée par hyperthermie.
4. Le cas échéant, allumez le dispositif de refroidissement par eau du vibratome au moins 30 minutes avant le tranchage des tissus pour permettre une capacité de refroidissement suffisante. Réglez la température de la circulation de l’eau à 4 °C.
   REMARQUE: Le plateau de coupe et la plaque de refroidissement utilisés ici contenaient tous deux une circulation d’eau intégrée. Ceci est fortement recommandé pour le refroidissement et pour réduire les risques de contamination. Cependant, il est également possible d’utiliser de la glace comme technique de refroidissement. En outre, le dispositif de refroidissement par eau n’a pas besoin d’être connecté au plateau de coupe et/ ou à la plaque de refroidissement du vibratome à ce stade du protocole.
5. Nettoyez le plateau de tranchage et la plaque d’échantillonnage du vibratome en rinçant toutes les surfaces avec 100% d’isopropanol pendant au moins 3 min.
   REMARQUE: Selon le système vibratome utilisé, la configuration du vibratome peut différer. Reportez-vous au manuel du vibratome présent en laboratoire pour plus d’informations sur les méthodes de réglage et d’étalonnage des pales.
6. Remplissez le plateau de coupe jusqu’à 90% à 95% avec un tampon de tranchage. Dans la configuration actuellement utilisée, cela correspond à environ 400 mL. Connectez le tuyau du dispositif de refroidissement par eau aux vannes du plateau de coupe et de la plaque de refroidissement du vibratome.
7. Désinfectez tous les outils nécessaires à la préparation en les immergeant dans une solution 100% isopropanol pendant 5 s. Retirez les outils de la solution d’isopropanol et séchez-les à l’air sous la hotte à écoulement laminaire.

3. Rognage et intégration des échantillons

1. Transférer l’échantillon de tissu dans une boîte de Petri de 100 mm remplie de tampon de tranchage à froid. Conservez le plat sur une plaque de refroidissement à 4 °C (relié au refroidisseur ou placé sur de la glace).
2. Enlever les trabécules endocardiques en tenant l’endocarde avec une pince à épiler et en utilisant des ciseaux pour couper environ 3 mm de tissu endocardique. De la même manière, enlevez le tissu adipeux excessif sous l’épicarde s’il est présent.
3. Fixer l’échantillon de tissu coupé, côté endocardique vers le haut, sur un patch en caoutchouc de 2 cm x 2 cm à l’aide de quatre aiguilles de 0,9 mm x 70 mm 20 G fixées en position carrée (0,9 cm x 0,9 cm; Figure 1C, D). Assurez-vous que le bord diagonal de chaque pointe d’aiguille pointe vers l’intérieur. Cela améliore la fixation et prévient les dommages au myocarde.
   ATTENTION: L’orientation du carré mentionné ci-dessus doit être orthogonale à la direction prédominante attendue du myofiber.
4. Coupez tout l’excès de tissu à l’extérieur du carré des quatre aiguilles à l’aide d’un scalpel. Si la taille de l’échantillon d’origine le permet, utilisez deux échantillons de tissus myocardiques au cours de cette préparation à partir du même échantillon brut.
5. À l’aide d’une pince à épiler, placez l’échantillon coupé sur un morceau de tissu stérile pour éliminer tout excès de tampon de tranchage laissé sur l’échantillon. Pour éviter le dessèchement de l’échantillon, ne conservez pas l’échantillon sur le tissu pendant plus de 10 s.
6. Placez le ou les échantillons dans une boîte de Petri de 35 mm, de telle sorte que la lame coupe perpendiculairement à l’alignement des cardiomyocytes et que l’épicarde soit orienté vers le bas. Si la préparation comprend deux échantillons, assurez-vous que les échantillons sont centrés et ne se touchent pas.
7. Prélevez la seringue d’agarose du bain-marie et immergez l’échantillon dans l’agarose. (Figure 2A). Laissez l’agarose se solidifier pendant 5 min sur une plaque de refroidissement. Le ou les échantillons doivent rester en contact avec la boîte de Pétri, ce qui garantira que le plan de coupe sera parallèle à la direction prédominante de la fibre myocardique.
   ATTENTION: Ne videz pas complètement la seringue, afin d’éviter les bulles d’air. Faites attention à la quantité d’agarose qui reste dans la seringue lors de l’immersion des échantillons. Dans le cas de bulles d’air dans le plat avec les échantillons, retirez soigneusement les bulles d’air dans la seringue.

4. Placer les échantillons sur le plateau de coupe

1. Retirer l’agarose solidifiée contenant le ou les échantillons de la boîte de Petri de 35 mm à l’aide d’une spatule ou d’un outil similaire, en l’imbriquant entre l’échantillon et le côté de la boîte de Pétri. Coupez une partie de l’agarose à l’aide d’un scalpel tout en gardant les échantillons couverts.
   ATTENTION : Ne pas enlever trop d’agarose. Il doit rester au moins 5 mm d’agarose sur les côtés long et court du plan X/Z.
   REMARQUE : Les étapes 4.2 à 4.4 doivent être effectuées en succession rapide (c.-à-d. un maximum de 5 s). Ayez tous les outils requis à portée de main avant de commencer. Aucun repositionnement de l’échantillon n’est possible après le placement. Essayez de limiter l’exposition de la colle à l’air et à l’humidité. Le contact avec de l’air ou des fluides solidifiera la colle, la rendant inutilisable.
2. À l’aide d’une pipette, placez et répartissez 60 μL de colle dans et autour du centre de la plate-forme de coupe.
3. Placez le côté épicardique de l’échantillon contenu dans l’agarose sur la zone collée à l’aide d’une pince à épiler. Ne pas repositionner. La face endocardique de l’échantillon doit être visible dans l’agarose. Laissez la colle se solidifier pendant 1 min. Appuyez doucement sur l’agarose contenant l’échantillon par le haut avec un outil émoussé (par exemple, une pince à épiler) tout en empêchant de couper ou d’endommager l’agarose.
4. Placez la plate-forme d’échantillonnage dans sa position désignée dans le plateau de coupe du vibratome, rempli de tampon de tranchage.

5. Démarrage du vibratome

1. Réglez l’amplitude de vibration sur 1 mm et la vitesse de coupe initiale sur 0,07 mm/s. Réglez l’épaisseur de la tranche sur 300 μm pour couper les tranches.
2. Tant que la lame ne coupe que l’agarose, augmentez la vitesse de coupe à son maximum, qui dans ce cas est de 1,50 mm / s. Dès que le vibratome commence à couper le tissu, diminuez immédiatement la vitesse à 0,07 mm/s.
   REMARQUE: Si le tissu n’est pas tranché en douceur, par exemple s’il y a de grandes zones fibrotiques dans l’échantillon, il peut être utile d’augmenter l’amplitude de coupe jusqu’à 1,5 mm et de réduire la vitesse de coupe à 0,04 mm / s.

6. Préparation du milieu et de l’incubateur pendant la procédure de tranchage

1. Remplir chaque chambre de culture avec 2,4 mL de milieu de culture complet (tableau 3).
2. Placez les chambres de culture remplies de milieu sur le système de culture dans l’incubateur réglé à 37 ° C, 5% de CO₂, 21% O₂ et une humidité de 80%. Équilibrez le milieu pendant au moins 20 min.
3. Connectez le système de culture à un ordinateur et démarrez le logiciel correspondant.
4. Réglez la vitesse de la bascule à 60 tr/min et préréglez les paramètres de stimulation (impulsions et fréquence de stimulation). Pour les tranches cardiaques humaines, définissez la stimulation standard sur des impulsions biphasiques avec un courant de 50 mA, chacune composée d’un courant positif de 3 ms, d’une pause de 1 ms et d’une impulsion de courant inversé de 3 ms, à une vitesse de stimulation de 30 battements par min (BPM).
   REMARQUE: Dans les tissus bien conservés, le seuil de stimulation typique est d’environ 15 mA. Pour assurer une stimulation fiable et tenir compte de toute augmentation possible du seuil de stimulation, il est recommandé de régler le courant à une valeur qui dépasse le seuil de stimulation de deux à trois fois.
5. Vérifiez les indicateurs d’électrode du logiciel pour vérifier que les électrodes des chambres de culture fonctionnent correctement.
   REMARQUE: Une action est nécessaire chaque fois que l’indicateur de canal dans le logiciel de culture devient rouge. Dans ce cas, les charges d’impulsion bipolaires ne sont pas équilibrées.

7. Préparation des tranches

REMARQUE: Les tranches sous-endocardiques initiales ne conviennent généralement pas à la culture de tissus et doivent être jetées en raison de leur morphologie inégale. Après les cinq à 10 premières tranches, la texture et la morphologie des tranches s’améliorent. La tranche idéale mesure au moins 1 cm x 1 cm, n’a pas ou seulement des plaques fibrotiques limitées, n’est pas fragmentée et a un alignement homogène des fibres (Figure 2B, D). La fibrose interstitielle, située entre les fibres myocytaires, est souvent présente dans le myocarde humain défaillant. Étonnamment, ce n’est pas un prédicteur négatif du succès de la cultivation.

1. Versez une quantité suffisante de tampon de tranchage à froid dans un couvercle de boîte de Petri de 5 cm pour vous assurer que les tranches ne dessècheront pas. Placez les tranches dans le couvercle de la boîte de Petri contenant le tampon de tranchage à froid.
2. Séparez l’agarose du tissu à l’aide d’une pince à épiler. Évitez de toucher le tissu. Manipulez le tissu avec précaution car tout dommage au tissu réduira le taux de réussite de la culture.
3. Déterminez la direction des fibres myocardiques en les inspectant de près par rapport à une source de lumière. Ceci est important lors de la fixation des triangles en plastique au tissu à l’étape 7.6.
   REMARQUE: Les étapes 7.4 et 7.5 doivent être effectuées successivement, dans un délai de 5 s.
4. Fixez deux triangles en plastique à un échantillon à l’aide de colle afin d’ancrer le tissu à l’intérieur des chambres de culture.
   1. Placez 1 μL de colle sur un couvercle stérile de boîte de Pétri. Utilisez une pince à épiler pour ramasser l’un des triangles en plastique autoclavés. Trempez rapidement le bord avant du triangle dans la colle et collez le triangle sur l’échantillon, perpendiculairement à l’alignement des cardiomyocytes. Répétez l’opération pour l’autre triangle.
5. Coupez les tissus dépassant la largeur du triangle à l’aide d’un scalpel (Figure 2C). Replacez la tranche avec les deux triangles montés dans le tampon de tranchage du plateau de coupe.
   REMARQUE: Répétez les étapes 7.2 à 7.5 jusqu’à ce que suffisamment de tranches soient préparées pour remplir les chambres de culture. Nous vous recommandons de préparer quelques tranches supplémentaires pour permettre le remplacement des tranches avec une mauvaise contraction.

8. Montage des tranches

REMARQUE: La post-charge est déterminée par la rigidité du fil de ressort dans les chambres de culture. Trois types différents sont disponibles, en fonction de l’épaisseur du fil à ressort.

1. Prenez une chambre de culture moyennement remplie de l’incubateur. Sélectionnez l’une des tranches préparées et insérez-la dans la chambre en reliant un triangle à chaque broche.
2. Ajustez la distance entre les broches de montage en fonction de la taille de l’échantillon. Assurez-vous que l’échantillon est immergé dans un milieu. Replacez la chambre dans sa cavité désignée du système de culture dans l’incubateur.
   ATTENTION: Ne pas trop étirer le tissu et ne pas trop plier le fil à ressort!
3. Réglez la tension de précharge après le placement du plat sur la bascule.
   1. Diminuez la précharge en tournant la vis de réglage dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Faites-le jusqu’à ce que la ligne de base du graphique correspondant sur l’écran de l’ordinateur ne change plus.
   2. Augmentez soigneusement la précharge (c.-à-d. augmentez la tension) en tournant la vis de réglage dans le sens des aiguilles d’une montre. Pour les chambres présentant la rigidité la plus élevée, continuez jusqu’à ce que la ligne de base correspondante dans le graphique ait augmenté de 1000 à 1200 unités, ce qui correspond à 1 mN de précharge.
      REMARQUE: Le réglage exact dépendra de la constante de ressort individuelle d’une chambre de culture, qui peut être déterminée par étalonnage avant une expérience selon les instructions du fabricant. Le logiciel d’enregistrement permet de prendre en compte l’étalonnage individuel de la chambre afin que les forces soient uniformément affichées en μN. Il est recommandé d’appliquer une stimulation électrique dès le début de la culture. En tant que tel, il est bien possible que la tranche commence à se contracter lors de l’ajustement de la précharge. Dans ce cas, concentrez-vous sur la ligne de base diastolique pour évaluer la précharge.

9. Changer de support

1. Préparer le milieu de culture selon la recette du tableau 3. Peu de temps avant l’utilisation du milieu, ajouter 50 μL de β-mercaptoéthanol (50 mM) dans un tube de 50 mL. Conserver à 4 °C.
2. Une fois tous les 2 jours, échangez partiellement le milieu de culture. Rafraîchissez le milieu tous les 2 jours, si la culture à long terme des tranches myocardiques est souhaitée.
3. Préchauffer le milieu frais au bain-marie ou dans un incubateur à air chaud à 37 °C pendant 30 à 45 min. Retirez une chambre de culture de l’incubateur et placez-la sous une hotte à écoulement laminaire.
   ATTENTION : Il est essentiel de garder la chambre, ainsi que le milieu, au chaud à 37 °C (> 35 °C) pour éviter les hyper contractures dues à une température basse. Des dommages moins distincts peuvent être présents sous la forme d’une augmentation de la tension diastolique quelques heures après un échange moyen. Cela peut sembler se rétablir, mais un stress répété peut entraîner une détérioration accumulée.
4. Retirer le milieu de la chambre de culture, en laissant environ 0,8 mL dans la chambre. Ajouter 1,6 mL de milieu frais dans la même chambre. Le volume total du milieu devrait être d’environ 2,4 mL par chambre.
5. Replacez le couvercle de la chambre et replacez la chambre de culture dans sa position respective.

Résultats

La contraction des tranches myocardiques a été affichée sur l’écran de l’ordinateur après insertion de la chambre de culture dans son connecteur correspondant (Figure 3). La contraction des tranches myocardiques humaines a commencé immédiatement après la stimulation. Les tranches sont hypercontractées pendant 5-10 min. Cela était visible comme une augmentation des forces diastoliques, causée par une contracture tonique de fractions tissulaires endommagées. Ce processus a ét?...

Discussion

Dans le passé, la recherche cardiovasculaire a fait de grands progrès dans la culture des cardiomyocytes. Cependant, la culture 3D de cardiomyocytes à géométrie intacte n’est pas encore bien établie. Comparé aux protocoles précédents appliqués pour la culture ex vivo de tissu myocardique, le protocole que nous avons décrit ici ressemble plus étroitement à l’environnement in vivo du tissu. De plus, l’application de la pré- et post-charge permet un environnement plus biomimétique. Nou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish culture system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070